抗WSSV和/或TSV的核酸药物

摘要

本发明公开了一种抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其活性成分为五种核酸，所述五种核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。本发明的抗WSSV和/或TSV的核酸药物无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死WSSV和/或TSV，抗病毒效果好，无药残。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗WSSV和/或TSV的核酸药物。

背景技术

对虾养殖大面积发展兴起于七、八十年代，我国沿海从南到北对虾养殖生产量很大，对沿海经济的发展起到了很大的促进作用。目前，病毒感染是影响对虾养殖的严重威胁，导致对虾养殖场严重的经济损失。其中，对虾桃拉综合征病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)病和对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)病是当前严重危害对虾养殖业健康发展的两种主要对虾病毒性传染病。根据世界银行的虾病报告，1994年对虾病毒病对全球对虾养殖业造成74％的产量损失，其经济损失达30亿美元以上。1995年，国际兽疫局(OIE)、联合国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将该病列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。

对虾白斑综合征病毒(WSSV)病，于1992年首次发现于台湾，1993年5～8月在我国大陆沿海从南到北的养殖场暴发，日本等亚洲国家的对虾养殖场也相继暴发了此病。目前，在亚洲已报道的该病毒的流行国家和地区包括朝鲜、泰国、韩国、印度尼西亚、越南、马来西亚、印度、斯里兰卡、孟加拉国、中国大陆沿海及台湾省等。1995年，美国德克萨斯州对虾养殖场出现白斑综合征病毒，并在西半球的其它地区相继暴发。至此，WSSV在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成几百亿元的经济损失，成为威胁对虾养殖业的主要疾病。

随着市场需求的增加和养殖技术的不断提高，我国水产养殖业迅速发展。但国内外市场对水产品质量的要求越来越高，我国水产品药残超标时有发生，水产品携带病毒、细菌、寄生虫、生物毒素的几率较高，这就造成了水产品的安全障碍。对虾属于无脊椎动物，主要是通过非特异性免疫(Non-specific immunity)力来抵抗病原的入侵。对虾非特异性免疫包括细胞免疫和体液免疫两个方面，虾体内的细胞免疫和体液免疫作用紧密相关，血细胞可合成并释放体液免疫因子，细胞免疫反应又受到体液免疫因子的介导和影响。目前主要采用免疫增强剂来促进或诱发宿主(对虾)防御反应，增强对虾机体抗病能力。因而相对于脊椎动物采用疫苗可以产生好的效果看，开发针对对虾疫病新的治疗和预防措施显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死WSSV和/或TSV，抗病毒效果好，无药残的抗WSSV和/或TSV的核酸药物。

本发明所提供的抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其活性成分为五种核酸，所述五种核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。

本发明的抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其中：所述五种核酸为任意质量比。

本发明的抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其中：所述五种核酸的质量比为1∶1∶1∶1∶1。

本发明的抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其中：还包括可药用载体或赋形剂。

本发明的抗WSSV和/或TSV的核酸药物无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死WSSV和/或TSV，抗病毒效果好，无药残，能控制对虾的白斑病病毒和桃拉综合症病毒的感染，避免对虾的大规模死亡，减少对虾养殖的风险，避免使用化学抗病毒及抗菌药物所产生的药残超标等问题，以此提高对虾产品的质量。

具体实施方式

人工合成如下核酸：

VP19-1：5’-UCAGAAUCGCUGUCCUUCUUU-3’；

VP19-2：5’-GUCAUCAUCAUCGGUGACCUU-3’；

VP19-3：5’-CCUGGUCCUGUUCUUAUAUUU-3’；

VP28-1：5’-CGAUAUUGUCUGUGUGGGUUU-3’；

VP28-2：5’-AGUCACAGGAAUGCGGAGGUU-3’；

VP28-3：5’-UUUCCAUUGCGGAUCUUGAUU-3’；

CP1-1：5’-AUGGUCGCUGUGCUAAGUAUU-3’；

CP1-2：5’-AAUAUUUCCACGCCACCAAUU-3’；

CP1-3：5’-CACUACCAUAAGGGAGAUAUU-3’；

CP2-1：5’-UUGAGAACGGAAAUGACGAUU-3’；

CP2-2：5’-CUUUAGCAAGCGUACCUGGUU-3’；

CP2-3：5’-UCUAAUUUCAGAAUUUCAAUU-3’。

实验条件：小水箱，温度20±2℃；

实验动物：日本对虾，每尾10克左右，体长10～12cm；

毒株：WSSV，TSV；

病毒悬液的制备：10g对虾病料在500mL TNE缓冲液中匀浆，4℃、3500g离心5min，上清液经400目尼龙网过滤后，4℃30000×g离心30min，弃上清，沉淀悬于10mL TM缓冲液，经3500×g离心5min后，4℃30000×g离心20min，沉淀中的病毒粒子重悬浮于1mL TM缓冲液，并用PCR进行定量分析，将所制备的病毒悬液用生理盐水调浓度。

WSSV感染：从日本对虾倒数第二腹节处进行注射；感染不给药组对虾每尾注射白斑病毒悬液100μL；空白对照组注射等量0.9％无菌生理盐水；感染给药物组对虾每尾注射WSSV病毒悬液，拌料给核酸0.2mg/天/只；注射后每日观察、记录活动情况，发病症状，死亡情况等，如甲壳内侧有明显白斑、活力迅速下降等；并连续观察10d，每天换水30％，傍晚时投饵一次。

TSV感染：TSV感染方法同于WSSV感染方式。

WSSV检测具体方法如下：

(1)煮沸法提取DNA：取患WSSV日本对虾肌肉组织0.1g分装至1.5mL离心管，每管加入1mL pH为7.4的PBS缓冲液，冰浴匀浆，将匀浆液6000rpm离心5min，取上清50μL加入1μL蛋白酶K(10mg/mL)，55℃煮沸15min，然后立即放于冰上5min，以8000rpm离心10min，上清做PCR模板；

(2)引物

第一次扩增引物：

F1：5’-CGT GCC TGA ATC A GT ATG TAC GC-3’；

R1：5，-GAC GTT ACA ATA GAC CCA TGT TCG AT-3’；

第二次扩增引物：

F2：5’-CTC ATG TAC CAA ATC TGG GTT ACG A-3’；

R2：5’-CGA TAG ACC ACA A GT TCC GTA GGA-3’。

(3)PCR检测WSSV的体系及程序：

(i)PCR反应体系：

第一次扩增：2.5μL 10×PCR缓冲液，0.4μL dNTP(2.5mM)，0.8μL引物(F1+R1)，0.3μL的TaqDNA聚合酶(5U/μL)，2.0μL模板DNA，最后加19μL的ddH2O；

第二次扩增：2.5μL 10×PCR缓冲液，0.4μL dNTP(2.5mM)，0.8μ引物(F2+R2)，0.3μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)，2.0μL第一次扩增的产物，最后加19μL的ddH2O。

(ii)PCR扩增条件：95℃2min；35个循环：95℃，30s；55℃，30s，72℃，1min。最后72℃10min后在10℃保存。

(4)PCR完成后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。

第一次扩增产物DNA片段长约为328bp，第二次扩增产物DNA片段长约为258bp。

TSV检测具体方法如下：

扩增体系(20μL)：Real-time PCR Premix 10μL，25mmol/L MgCl₂ 0.25μL，2.5mmol/LdNTP 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.125μL，Tsv-F、Tsv-R和Tsv-T浓度都分别为0.6，0.4和0.6μmol/L，体积均为2μL，其余用水补足。

反应程序为：95℃预变性20s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸30s进行40个循环，最后于40℃结束反应。

最后采用软件进行数据分析。

Tsv-F：5′-GCTTGCGTGGTGGGACTAAAT-3′；

Tsv-R：5′-CCTCCACTGGTTGTTGTATCAAAA-3′；

Tsv-T：5′-HEX-AATGCCTGCTAACCCAGTCGAAATT-ECLIPSE-3′。

核酸在对虾上的抗WSSV活性分析结果如表1所示；

核酸在对虾上的抗TSV活性分析结果如表2所示。

表1.核酸在对虾上的抗WSSV活性分析

表2.核酸在对虾上的抗TSV活性分析

从表1和表2的结果中确定VP19-1、VP19-2、VP28-2、CP1-1、CP1-3、CP2-2、CP2-3抗WSSV活性和抗TSV活性较高。

将VP19-1、VP28-2、CP1-1、CP2-3和CP2-3按照质量比为1∶1∶1∶1∶1混合制成核酸药物。

核酸药物稳定性分析：流通蒸汽高温105℃，20分钟灭菌不影响其生物活性；50℃恒温箱内存放2个月不影响其生物活性；室温下存放24个月不影响其生物活性；-20℃存放48个月不影响其生物活性。

日本对虾每尾10克左右，体长10～12cm，随机分成14组，每组100只，每组分别肌肉注射VP19-1、VP19-2、VP19-3、VP28-1、VP28-2、VP28-3、CP1-1、CP1-2、CP1-3、CP2-1、CP2-2、CP2-3、核酸药物、0.9％无菌生理盐水注射后每天观察对虾的活动情况及是否出现死亡等，结果如表3。

表3.对虾的毒性分析结果

  9  CP1-1  93％  10  CP1-2  96％  11  CP1-3  97％  12  CP2-1  92％  13  CP2-2  100％  14  CP2-3  100％

(二)临床试验

病毒滤液的制作：分别取WSSV和TSV感染病虾的鳃、上皮、肌肉、步足和头部软组织，加入缓冲液PBS(PH7.14)匀浆，8000g离心10min去沉淀，上清液用0.45μm滤膜过滤，得到可供感染的WSSV和TSV病毒滤液。

投喂感染：用上述获得的WSSV和TSV病毒滤液分别注射感染健康对虾，采集因此感染而濒临死亡的虾，-20℃保存，作为投喂感染模式的病虾；感染时取该样品的鳃部、上皮、肌肉、步足和头部，剪细制成肉糜，用青霉素和链霉素处理0.5h，攻毒组幼虾饥饿空胃24h后投喂病虾肌肉肉糜一次，6h以后，清除残余物；然后继续投喂各相应饵料，同时设立阴性对照。

投药途径：按照每千克饲料加入200毫克核酸药物混入虾饲料中，通过饲喂给药。

症状观察：感染后，每日观察对虾的活动情况，病死情况，10天后随机抽取部分对虾进行病毒检测。WSSV和TSV的检测方法同上。

数据统计分析结果如表4和表5。

表4.对WSSV病毒的抗性分析结果

表5.对TSV病毒的抗性分析结果

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。