一种超声提取珠子参总皂苷的方法

摘要

本发明公开了一种超声提取珠子参总皂苷的方法，将珠子参烘干，粉碎后过40目筛，称取粗粉，置索氏提取器中，加入石油醚，回流2h，取出滤纸筒，药材晾干，备用；称取预处理好的材料，按料液比(g/mL)1∶10-20分别加入浓度为30％-70％的乙醇，充分摇匀后浸泡1h，在30-50℃、超声提取10-30min。超声提取法操作具有简单、省时、安全、简便、成本低、提取效率高、成分不被破坏等优势。

说明书

技术领域

本发明涉及中草药有效成分提取技术领域，尤其涉及一种超声提取珠子参总皂苷的方法。

背景技术

皂苷(saponins)又称碱皂体、皂素、皂甙、皂角苷或皂草苷，是存在于植物界的一类结构较复杂的苷类化合物，是能形成水溶液或胶体溶液并能形成肥皂状泡沫的植物苷统称。根据已知皂苷元的分子结构，可以将皂苷分为两大类，一类为甾体皂苷，另一类为三萜皂苷。皂苷多为白色或乳白色无定形粉末，少数为晶体，味苦而辛辣，对黏膜有刺激性。皂苷一般可溶于水、甲醇和稀乙醇，易溶于热水、热甲醇及热乙醇，不溶于乙醚、氯仿及苯。

珠子参为五加科人参属植物珠子参Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng或羽叶三七Panax japonicus C.A.Mey.var.bipinnatifidus(Seem.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎，主产于云南、陕西、甘肃、四川、湖北和贵州等地。化学成分的研究表明，珠子参主要含有皂苷类成分，其中包括人参甙R₀、R_a、Rb₁、R_b2、Rb₃、Rc、Rd、Re、Rf、Rg₁、Rg₂、F₁、F₂、F₃，三七苷R₁、R₂、R₃；珠子参甙R₁、R₂、F₁、F₂、F₃、F₄、F₅、F₆；羽叶三七甙F₁、F₂；假人参苷F₁₁；竹节参苷IV、竹节参甙IVα、竹节参甙Iva甲酯(即齐墩果酸-(3-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸甲酯)-28-O-β-D-葡萄吡喃糖甙)；齐墩果酸-3-O-β-D-(6‘-甲酯)-吡喃葡萄糖醛酸甙，齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖甙，3-O-[β-D-(6‘-甲酯)吡喃葡萄糖醛酸基]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖甙，3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖基]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖甙，β-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖甙。药理研究表明，珠子参总皂甙对中枢神经系统有明显的抑制作用，除镇静、催眠及镇痛等作用外，还能提高动物对缺氧的耐受能力；珠子参总皂甙具有明显提高机体NK细胞活性的作用，对PHA和ConA诱导下的T细胞增殖效应有明显的增强作用；珠子参总皂甙能够轻度改善缺血再灌后的左室功能，显著降低再灌后血浆LDH和CPK水平，明显减轻心肌钙聚集，对心肌缺血再灌损伤具有保护作用，珠子参根茎的皂苷部分有抗溃疡作用。

提取皂苷的方法主要有温浸提取法、回流提取法以及超声提取法等。超声波是一种高频机械波，这种特殊的物理环境使细胞中的有效成分能够直接与溶剂接触并溶解在其中，提高了有效成分的提取率。超声提取法无须加热，且提取时间短，提取率高。但尚未见到最佳超声提取工艺的有关技术公开。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种超声提取珠子参总皂苷的最佳工艺方法。

本发明采用以下技术方案：

一种超声提取珠子参总皂苷的方法，将珠子参烘干，粉碎后过40目筛，称取粗粉，置索氏提取器中，加入石油醚，回流2h，取出滤纸筒，药材晾干，备用；称取预处理好的材料，按料液比(g/mL)1∶10-20分别加入浓度为30％-70％的乙醇，充分摇匀后浸泡1b，在30-50℃、超声提取10-30min。

优选的，所述的超声提取珠子参总皂苷的方法，按料液比(g/mL)1∶20加入50％的乙醇，50℃超声提取30min。

传统方法(温浸法和回流法)需要长时间加热，这对皂苷具有一定的破坏性，超声提取法操作具有简单、省时、安全、简便、成本低、提取效率高、成分不被破坏等优势。

附图说明

图1香草醛浓度对吸光度的影响；

图2高氯酸体积对吸光度的影响；

图3显色温度对吸光度的影响；

图4显色时间对吸光度的影响；

图5放置时间对吸光度的影响；

图6人参皂苷Re标准曲线；

图7超声时间对总皂苷提取率的影响；

图8超声温度对总皂苷提取率的影响；

图9料液比对总皂苷提取率的影响；

图10乙醇浓度对总皂苷提取率的影响。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

1.2实验部分

1.2.1仪器、试剂与材料

仪器：UV-1600紫外分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，SL202N型药物电子天平(上海明桥精密科学仪器有限公司)，RE-52AA旋转挥发仪(上海亚荣生化仪器厂)，玻璃仪器气流烘干机(郑州长城科工贸有限公司)，HH-6B数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)，KQ-100E超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，药用植物粉碎机(黄骅市中兴仪器有限公司)。

试剂：人参皂苷Re对照品(中国药品生物制品检定所)，香草醛(天津市巴斯夫化学制药有限公司)，高氯酸、甲醇、乙醇、冰醋酸及正丁醇等试剂均为分析纯(西安试剂厂)。

材料：珠子参购于西安市万寿路药材市场，经鉴定为五加科人参属植物珠子参的干燥根状茎。

性状鉴别：根茎节膨大部呈类球形，扁球形或不规则菱角形，偶呈连珠状，直径0.5～2.8cm，有的一侧或两侧残存细的节间。表面黄棕色或棕褐色，粗糙，有明显的纵皱纹，中部有略呈环列的疣状突起及细根痕，有的可见略凹陷的茎痕。质坚硬，不易折断，断面不平坦，切断面黄白色，粉性，有黄色分泌道斑点。气微，味苦、微甘，嚼之刺喉。蒸(煮)者断面黄白色或黄棕色，略呈角质样，味微苦、微甘，嚼之不刺喉。

显微鉴别：根茎节膨大部(直径1.4cm)横切面：木栓层为5～10层细胞。皮层稍窄，有分泌道，呈圆形或长圆形，大小悬殊，直径32～500μm，切向约至600μm，周围分泌细胞5～18。维管束外韧型，环状排列，束间形成层断续可见，射线宽。韧皮部有分泌道，较小；木质部导管呈放射状或“V”字形排列，导管类多角形，直径约至76μm。射线宽广，中央有髓。本品薄壁细胞中含草酸钙簇晶，直径20～96μm；并含淀粉粒。

理化鉴别：(1)取本品粉末1g，加水10mL，浸泡过夜，置60℃水浴中热浸10分钟，立即滤过。取具塞试管两支，各加入滤液1mL，分别加5％氢氧化钠试液与5％盐酸溶液各2mL，用力振摇1分钟，加酸管生成的泡沫比加碱管高出约1倍。

(3)取本品粉末约0.5g，加乙醇5mL，振摇30分钟，滤过，滤液蒸干，滴加三氯化锑饱和的氯仿溶液，再蒸干，即显紫红色。

(4)取本品粉末1g，加水5～10滴，搅匀，再加水饱和的正丁醇10mL，密塞，振摇约10分钟，放置过夜，滤过，滤液蒸干，残渣加硫酸与30％乙醇的混合溶液(1→20)10mL，加热回流2小时，用氯仿20mL提取，分取氯仿层，用水10mL洗涤(必要时离心，使分层)，弃去洗液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取齐墩果酸与人参二醇对照品，加甲醇制成每1mL含齐墩果酸1.5mg和人参二醇0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸溶液(1→10)，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

材料预处理：将珠子参烘干，粉碎后过40目筛，称取粗粉约40g，置索氏提取器中，加入石油醚约150mL，回流2h，取出滤纸筒，药材晾干，备用。

1.2.2珠子参总皂苷含量测定方法的建立

1.2.2.1对照品溶液的配制

精密称取人参皂苷Re对照品7.5mg于25mL容量瓶中，以甲醇溶解定容，配制成0.3mg/mL的人参皂苷Re对照品溶液。

1.2.2.2样品溶液的制备

称取经预处理的珠子参粗粉1.00g，置于索式提取器中，用60％的乙醇150mL，90℃回流3次，每次2h。提取液经过滤后，减压回收溶剂，浓缩至干，残渣加水30mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇加入量分别20mL、20mL、10mL、10mL、10mL，合并萃取液，减压回收正丁醇液，蒸干(称重)，用甲醇溶解，定容至10mL。

1.2.2.3测定波长的选择

移取样品溶液0.3mL于10mL具塞磨口试管中，70℃挥干，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，摇匀，60℃水浴加热20min，冰水浴10min。精确加入冰醋酸5mL，振荡摇匀。随行试剂做空白，用UV-1600紫外光度计在400-800nm范围做一个全程扫描，发现其最大吸收波长在550nm左右。同法对人参皂苷Re于400-800nm范围作全程扫描，发现其最大吸收波长也在550nm左右，故选择550nm为测定波长。

1.2.2.4显色条件的选择

经预试验，显色剂香草醛-冰醋酸浓度、高氯酸加入量、显色温度、显色时间以及放置时间对测量结果均有影响，因此分别对这五种因素进行考察。

1.2.2.4.1香草醛浓度对显色反应的影响

分别移取5份0.3mL人参皂苷Re对照品溶液(0.3mg/mL)于具塞试管中，70℃挥干，依次加入精密加入1％、3％、5％、7％、9％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，摇匀，60℃水浴加热20min，冰水浴10min后，精确加入冰醋酸5mL，振荡摇匀。随行试剂做空白，于550nm处比色测定吸收值。

1.2.2.4.2高氯酸体积对显色反应的影响

同1.2.2.3.1，对照品烘干后，加入5％香草醛-冰醋酸溶液，依次加入高氯酸0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，其他条件不变，测定吸收值。

1.2.2.4.3加热温度对显色反应的影响

同1.2.2.3.1，对照品烘干后，加入5％香草醛-冰醋酸溶液，加热温度分别设为40、50、60、70和80℃，其他条件不变，测定吸收值。

1.2.2.4.4显色时间对显色反应的影响

同1.2.2.3.1，对照品烘干后，加入5％香草醛-冰醋酸溶液，显色时间分别设定为10、15、20、25、30min，其他条件不变，测定吸收值。

1.2.2.4.5放置时间对显色反应的影响

取0.3mL对照品溶液于具塞试管中，烘干后，加入5％香草醛-冰醋酸溶液，其他条件与1.2.2.3.1项相同。在室温中分别放置0、10、20、30、60、120、180min，随行试剂做空白，于550nm处比色测定吸收值。

1.2.2.5标准曲线的绘制

精密吸取1.2.2.1所配置的人参皂苷Re对照品溶液0.07mL、0.3mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、8.0mL分别于10mL具塞磨口试管中，70℃挥干，在1.2.2.4项所选的最佳显色条件下以随行试剂做空白，于550nm处比色测定吸收值，绘制标准曲线。

1.2.2.6精密度考察

精密吸取对照品溶液5份，每份0.3mL，置于具塞磨口试管中，挥干，按1.2.2.4所选最佳条件进行实验，测定吸收值，计算RSD。

1.2.2.7稳定性实验

精密移取对照品溶液0.3mL，置于具塞磨口试管中，挥干，按1.2.2.4所选最佳条件隔一定时间测定一次吸收值。

1.2.2.8加样回收率实验

移取珠子参总皂苷样品5份，分别精密加入人参皂苷Re对照品溶液0.2mL，摇匀，挥干。按1.2.2.4项下所选最佳条件测定吸收值，计算总皂苷量。

1.2.3珠子参总皂苷不同提取方法的对比研究

1.2.3.1温浸提取法

称取经预处理的珠子参粗粉1.00g，8倍量60％乙醇浸泡12h后，60℃水浴温浸3次，3次时间分别为2h、2h、1h。提取液经过滤后，减压回收溶剂，浓缩至干，残渣加水30mL溶解，然后用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇加入量分别20mL、20mL、10mL、10mL、10mL，合并萃取液，减压回收正丁醇，蒸干(称重)，用甲醇溶解，过滤并定容至10mL。在1.2.2.4项所选最佳显色条件下以随行试剂做空白，于550nm处比色测定吸收值，计算总皂苷含量。

1.2.3.2回流提取法

提取方法同1.2.2.2。在1.2.2.4项所选最佳条件下以随行试剂做空白，于550nm处比色测定吸收值，计算总皂苷含量。

1.2.3.3超声提取法

经预试验，超声时间、超声温度、液料比和乙醇浓度均会影响总皂苷的提取率。因此，先进行单因素考察试验，再应用正交实验，对这四种因素进行综合考查，研究超声综合条件对总皂苷提取率的影响，寻求珠子参总皂苷最佳的提取工艺。

1.2.3.3.1超声时间对总皂苷提取率的影响

称取经预处理的5份药粉，每份1.00g，超声时间分别设为10、20、30、40、50min，乙醇浓度为60％，料液比为1∶20，超声温度40℃。提取后，减压回收溶剂。浓缩至干，残渣加超纯水30mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇加入量分别20mL、20mL、10mL、10mL、10mL，合并正丁醇液，减压回收正丁醇液，蒸干(称重)，用甲醇溶解，过滤并定容至10mL，冷藏备用。

移取0.10mL样品，用甲醇稀释20倍，在1.2.2.4项所选最佳条件下以随行试剂做空白，于550nm处比色测定吸收值，计算总皂苷含量。

1.2.3.3.2超声温度对总皂苷提取率的影响

称取5份经预处理的药粉，每份1.00g，超声温度分别为30、40、50、60、70℃，同1.2.3.3.1项相同方法进行实验。

1.2.3.3.3液料比对总皂苷提取率的影响

称取5份经预处理的药粉，每份1.00g，料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，同1.2.3.3.1项相同方法进行实验。

1.2.3.3.4乙醇浓度对总皂苷提取率的影响

称取5份经预处理的药粉，每份1.00g，提取溶剂分别为10％、30％、50％、70％、90％的乙醇，同1.2.3.3.1项相同方法进行实验。

1.3结果与讨论

1.3.1显色条件的选择

分别考察香草醛浓度、高氯酸加入量、显色温度、显色时间、放置时间对测量结果的影响，其结果如图1至图5所示：

根据上述试验结果得最佳显色条件为：精密加入7％的香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.6mL，摇匀，于60℃水浴加热20min，并在1h内测定吸光度。

1.3.2珠子参总皂苷含量测定方法

以人参皂苷Re含量为横坐标(X)，吸收值(Abs)为纵坐标(Y)绘制标准曲线，结果显示，人参皂苷Re在2μg-200μg范围内呈良好线性关系(图6)，回归方程Y＝0.0038X+0.0028，R²＝0.9992。

0.3mL对照品溶液5次平行测定RSD＝1.33％，结果表明，本方法精密度良好；稳定性实验结果表明，本方法在1h内稳定性良好；平均回收率为103.8％，结果表明，本方法回收率良好。

1.3.3珠子参总皂苷不同提取方法的对比

1.3.3.1温浸法与回流法

温浸法和回流法所得浸膏和总皂苷含量如表1-1所示。

表1-1温浸法与回流法比较

1.3.3.2超声提取法

1.3.3.2.1超声时间对总皂苷提取率的影响

由图7可以看出，随着超声时间的延长，珠子参总皂苷的提取率呈上升趋势，当时间超过30min时，提取率变化不大，所以正交实验选择超声时间10、20、30min。

1.3.3.2.2超声温度对总皂苷提取率的影响

由图8可以看出，在一定温度范围内，随着超声温度的升高，珠子参总皂苷的提取率呈上升趋势，但超过50℃时，提取率反而随着超声温度的升高而减小，这可能是因为温度升高对皂苷的破坏性增强，所以正交实验选择超声温度30、40、50℃。

1.3.3.2.3料液比对总皂苷提取率的影响

由图9可以看出，随着料液比的升高，珠子参总皂苷的提取率呈上升趋势，当液料比超过1∶20时，提取率变化不大，所以正交实验选择料液比为1∶10、1∶15、1∶20。

1.3.3.2.4乙醇浓度对总皂苷提取率的影响

由图10可以看出，随着乙醇浓度的升高，珠子参总皂苷的提取率呈上升趋势，但当乙醇浓度超过70％时，提取率变化不大，所以正交实验选择乙醇浓度为30％、50％、70％。

根据上述预试验结果，选取超声时间(A)、超声温度(B)、料液比(C)、溶剂浓度(D)四个因素，每个因素三水平，按L₉(3⁴)正交表进行实验。因素水平安排见表1-2。

表1-2因素水平表

1.3.3.2.5正交试验的结果与分析

按正交表进行实验，每组实验平行做三份，每份取珠子参样品为1.00g，按因素水平表分别制备样品，同1.2.2.4项所选最佳方法进行测定。正交实验结果见表1-3，方差分析分别见表2-4。

表1-3珠子参总皂苷正交试验结果分析

表1-4试验方差分析表.

注：F0.05(2.2)＝19，“*”表示显著性

由表1-3结果直观分析可知，R_C＞R_B＞R_D＞R_A，即料液比(C)极差最大，超声温度(B)其次，乙醇浓度(D)再次，超声温度(A)最小，这表明影响珠子参总皂苷提取率的主次因素依次为：C＞B＞D＞A。从四因素三水平来看，A₃B₃C₃D₂为优选工艺，即超声提取的最佳工艺条件为：加入20倍体积的50％乙醇，50℃超声提取30min。

由表1-4方差分析来看，F(B)＞0.05，F(C)＞0.05，即超声时间(B)和料液比(C)对总皂苷提取率有显著影响，而F(A)＜0.05，F(D)＜0.05，即超声时间(A)和乙醇浓度(D)对总皂苷提取率影响不显著。

1.4结论

实验结果显示，超声提取法最佳的工艺条件为：加入20倍体积的50％乙醇，50℃超声提取30min。与传统提取方法(温浸法和回流法)相比，超声提取法提取珠子参总皂苷提取率(7.57％)明显高于温浸法(5.06％)和回流法(6.30％)，因此最佳提取方法为超声提取法。传统方法(温浸法和回流法)需要长时间加热，这对皂苷具有一定的破坏性，超声提取法操作具有简单、省时、安全、简便、成本低、提取效率高、成分不被破坏等优势，可以广泛应用于中药有效成分的提取。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。