法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-01-02
授权
授权
2011-02-16
实质审查的生效 IPC(主分类):A01N63/02 申请日:20091126
实质审查的生效
2010-12-29
公开
公开
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别是涉及苏云金芽孢杆菌cry1Ai的用途,以及改造的mcry1Ai基因及应用。
背景技术
虫害是造成农作物减产的重要原因之一,减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14%,直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10%、小麦减产20%、棉花减产30%以上[夏启中,张明菊,抗植物虫害基因及其应用,鄂州大学学报,2005,(5):56-60.]。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害,但化学农药造成环境污染,生物杀虫剂成本较高。长期以来,大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性,使益虫及其它生态区系遭受破坏,而且严重污染环境,提高生产成本,破坏生态平衡。因此,减少杀虫剂使用量,发展现代植物保护技术,已成为可持续发展农业中必须正视的课题之一。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌,是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物,对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂,对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins,ICPs),也称δ-内毒素(delta-endotoxin),它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E,Crickmore.N,Van Rie.J.,Lereclus.D,Baum.J,Feitelson.J,Zeigler.D.R.,Dean.D.H.Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev,1998,62(3):775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因,并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起,截止2008年6月已发现和克隆了412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用,它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里,转cry1Ab基因的抗虫玉米,转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国,自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1A基因的抗虫棉以来,已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中,由于能得到持续稳定的收益,农民种植转基因作物量逐年增加。2007年,全球转基因作物种植面积增长率达12%,即增加1230万hm2,达到1.143亿hm2(2.824亿英亩)。第一个12年,转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的 农民都带来了经济和环境效益。
由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一,如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。
因此,筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因,可以丰富杀虫基因资源,为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源,提高Bt转基因产品的抗虫效果,并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险,避免新的生态灾难降临,具有重要的经济、社会和生态效益。
发明内容
本发明提供一种苏云金芽孢杆菌cry1Ai在抗虫中的用途,其对小菜蛾、玉米螟、棉铃虫、粉纹夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟等害虫具有高毒力;同时通过对苏云金芽孢杆菌cry1Ai改造,得到苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白mcry1Ai基因序列,以应用于转化微生物和植物,使之表现出对相关害虫的毒性,并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。
苏云金芽孢杆菌cry1Ai基因在抗鳞翅目害虫中的应用。
所述应用是将苏云金芽孢杆菌cry1Ai基因表达的晶体蛋白用于杀灭鳞翅目害虫。
所述应用是将上述基因转入到微生物或植物,使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋白。
一种改造的mcry1Ai基因,其具有如SEQ NO.3所述的核苷酸序列。
改造的mcry1Ai基因在抗鳞翅目害虫中的应用。
所述应用是将上述基因转入到微生物或植物,使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋白。
本发明发现菌株BTS6(保藏号:CGMCC 3459)对鳞翅目害虫具有高毒力,从中克隆得到一个基因,经测序(其核苷酸序列为SEQ NO.1)发现,与公开的cry1Ai基因相似性为100%。经实验证明,该基因蛋白(其氨基酸序列为SEQ NO.2)对鳞翅目害虫具有高毒力,从而可将其转化植物或微生物,使之表达蛋白杀灭鳞翅目害虫。
根据Cry1Ai蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了可以用于转基因植物开发的DNA序列,其核苷酸序列如SEQ NO3所示,该改造基因mcry1Ai用于转化玉米,Cry1Ai蛋白的含量最高可占总可溶蛋白的0.23%。
保藏信息:
分类命名:苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis
保藏号:CGMCC 3459
保藏日期:2009年11月23日
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
附图说明
图1,cry1类PCR-RFLP鉴定图谱
1,引物k3un2/k5un2扩增酶切条带;2,引物k3un3/k5un3扩增酶切条带;M,100bp ladder图2,cry1Ax阳性克隆PCR鉴定
1,3.6kb PCR产物;2,阴性对照;M,λ/Eco130I
图3,Cry1Ax在大肠杆菌中的表达
1,空白对照不可溶组分;2,表达菌株不可溶组分;3,空白对照可溶组分;4表达菌株可溶组分
图4植物表达载体pU1Ai的构建
图5植物表达载体pU1Ai的酶切鉴定
M:Lamda DNA/Eco1301I 1:pU1Ai/Sac I+BamH I,2:pT8A/Sac I+BamH I 3:p3300-Ubi/Sac I+BamH I
图6抗性植株PCR检测
M:DM2000P:pU1Ai CK:阴性对照 1~15:部分转基因植株
图7PCR阳性植株中cry1Ai蛋白占可溶性蛋白比例
图8T0代转基因植株的玉米螟生物活性测定
A,B:未转基因植株 C:转基因植株
具体实施方式
实施例1Cry1Ai基因、蛋白功能
1-1菌株BTS6杀虫活性测定
将菌株接种到LB固体培养基上,培养72小时,至芽孢与晶体释放。将芽孢与晶体用灭菌水洗下来,悬浮起来,稀释到1亿芽孢每毫升的浓度用于杀虫活性测定。以小菜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾为例,测定对鳞翅目害虫的杀虫活性。结果显示该浓度的芽孢晶体混合物对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟具有高活性。四种试虫的死亡率都为100%。
1-2BTS6菌株的PCR-RFLP鉴定
1.利用两对cry1类鉴定引物k3un2/k5un2,k3un3/k5un3(Kuo,W.S.and Chak,K.F.Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis ofrestriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA.Applied andEnvironmental Microbiology,1996,62:1369-1377.),对BTS6菌株大质粒进行PCR-RFLP
分析得到酶切图谱如图1。综合泳道1,2的酶切条带和已知基因的酶切图谱可以大体确定BTS6菌株中含有cry1A,cry1E,cry1K类基因,对鉴定PCR产物建立T-A克隆库,进行测序。得到其中cry1A类片断与cry1Ai相似性100%。
1-3设计一对cry1类基因通用引物扩增从cry1Ai全长基因
根据cry1类基因保守区设计了一对通用引物(Cry1Ai5/Cry1Ai3),序列如下:
Cry1Ai5-ATGGATAACAATCCGAACATCAATG
Cry1Ai3-CTATTCCTCCATAAGGAGTAATTCC
通过PCR扩增的方法,以BTS6的基因组为模版,克隆cry1Ai基因全长,见图2,连接PEB表达载体得到阳性克隆。获得的重组表达载体质粒命名为pEBS6。
用pfuDNA聚合酶,用如下体系进行PCR扩增。。
超纯水补至50μL,混匀离心,加石蜡油30μL。
扩增循环:94℃变性1分钟,54℃退火1分钟,72℃延伸4分钟,25个循环,最后72℃延伸10分钟。
1-4cry1Ai全长基因序列分析
对阳性克隆进行测序,得到基因全长序列。
连接方案:
载体 0.1-0.2μg
目的片段DNA 0.5-1.0μg
5×Ligation Buffer 2μL
T4DNALigase 1μL
用超纯水补足体积到10μL,充分混匀,16℃连接4h或4℃连接过夜。
转化方案:
1、挑取单菌落于5ml LB震荡培养过夜;
2、按1%接种量接种于LB液体培养基中,37℃,230rpm培养2-2.5hr,(OD600=0.5-0.6);,
3、4℃,4,000rpm离心10min;
4、弃上清,加入预冷的0.1M CaCl250ml悬浮细胞,置于冰上30min以上;
5、4℃,4,000rpm离心10min,回收细胞;
6、用2-4ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬细胞,分装成200μl/0.5mL离心管中,于4℃保存(可保存一周)。
7、取200μl感受态细胞与5μL连接产物充分混匀,冰浴30min。
8、42℃热激1.5min,冰浴3min。
9、加入800μl LB培养基37℃培养45min。
10、取200μl涂板,加入相应的抗生素,及IPTG,X-gal,37℃培养。
基因全长3.6kb,见SEQ NO.1,翻译蛋白共1187个氨基酸见SEQ NO.2。通过利用在线分析工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对,使用蛋白保守结构域数据库比对(Conserved Domain Database)分析,该蛋白氨基酸序列SEQ NO.2的36至608位氨基酸是该蛋白的杀虫活性区域。该基因序列与已报道的cry1Ai基因序列完全一致。
1-5cry1Ai的表达
提取JM110阳性克隆质粒,转化Rosetta(λDE3),IPTG诱导表达。
诱导表达过程如下:
1)活化菌种(37℃、12hr);
2)10%接种于LB培养基中(37℃、2hr);
3)加入诱导物IPTG,150rpm,18-22℃低温诱导4-20h;
4)离心收集菌体,加入10mM Tris·Cl(pH 8.0)悬浮;
5)破碎菌体(超声波破碎完全);
6)离心12,000rpm 10min 4℃;
7)收集上清及沉淀各10-15μL,分别电泳检测。
聚丙烯酰胺凝胶配置如下。
上样:上样10-15μl,电泳:130-150V恒压。
染色与脱色:电泳后取出凝胶,用蒸馏水冲洗后,放入染色液中,60rpm振荡染色1hr左右,脱色液中脱色2hr左右,脱色至凝胶背景透明,清水中漂洗至蛋白带清晰。cry1Ai基 因可以表达约134kD的蛋白(见图3)。
1-6杀虫活性测定
以小菜蛾、玉米螟、棉铃虫为例测定蛋白对鳞翅目的杀虫活性,见由表1、表2、表3,结果可知Cry1Ai蛋白对鳞翅目害虫有高毒力。
敏感小菜蛾的生物活性测定结果如表1,各浓度重复4次,每重复接虫15头。
表1,Cry1Ai对敏感小菜蛾的生物活性测定
敏感小菜蛾的生物活性测定结果显示Cry1Ai对敏感小菜蛾有高毒力。
对敏感亚洲玉米螟的生物活性测定见表2,各浓度重复3次,每重复接虫24头
表2,Cry1Ai敏感亚洲玉米螟的生物活性测定
对敏感亚洲玉米螟的生物活性测定结果显示Cry1Ai敏感亚洲玉米螟有高毒力。
对敏感棉铃虫的生物活性测定见表3,各浓度重复3次,每重复接虫15头。活虫按发育等级分类。
表3Cry1Ai敏感棉铃虫的生物活性测定结果
对敏感棉铃虫的生物活性测定结果显示,Cry1Ai敏感棉铃虫的生物活性表现为高效抑制发育。
实施例2Cry1Ai蛋白在转基因植物中的应用
2-1改造基因mCry1Ai
根据Cry1Ai蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了可以用于转基因植物开发的DNA序列。去除了多聚腺苷酸化信号26个,GC含量提高了11.5%。该序列具有GC含量为48%的特征;含有利于植物表达的序列,命名为mCry1Ai具体见SEQ NO.3。在基因上游添加了Ω序列和Kozak序列,在基因3’端添加了内质网定位信号。
该改造基因mCry1Ai合成序列由组成型Ubiquitin启动子驱动,导入到水稻中,对二化螟有较好的抗虫活性。
序列中下划线为Ω序列,加粗的为Kozak序列,边框为KEDL内质网定位信号,上游添加了BamH I、HindIII、XbaI、XmaI、SmaI、NcoI,下游添加了SacI、EcoRI酶切位点,便于载体构建。
合成序列与原有核苷酸序列有84%的相似性。以下是比对结果。
Query:mCry1Ai序列如SEQ NO.3
Sbjct:原有cry1Ai序列
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Query:2035 acgga 2039
Sbjct:1921 acgga 1925
2-2植物表达载体构建
用BamH I和Sac I双酶切中间载体p3300-Ubi,将回收的载体片段分别与用同样两个限制性内切酶消化的cry1Ai片段相连,构建流程见图4,酶切鉴定(图5)证明植物表达载体pU1Ai构建成功,该载体含有由组成型启动子Ubiquitin驱动的cry1Ai基因,筛选标记为bar基因。
2-3玉米遗传转化
2-3-1玉米的控制授粉
(1)玉米抽雄后,用大口袋套住雄穗,下面用别针别住,收集花粉;
(2)雌穗花丝未抽出前,用小口袋将其套住,并用大头针别好;
(3)在授粉的前一天,当花丝伸出约2cm长时,用剪刀剪去花丝的顶部,促进其伸长;
(4)第二天,当花丝伸长后,依下列组合进行授粉(前为母本,后为父本):齐31×综31;
(5)授粉后系上小牌,写上授粉的品种和日期,10~12天后收获;
2-3-2幼胚的剥离和培养
(1)将新收获的玉米雌穗去掉苞叶、花丝,花丝一定要去干净,可用酒精灯将未除净的花丝烧去;用小刀去掉雌穗的头尾部分;
(2)将雌穗浸在70%乙醇中灭菌30sec;
(3)将雌穗取出,浸在2.5%的次氯酸纳中灭菌10~15min,可以在溶液中加几滴Tween20;
(4)用灭菌水清洗3次,用滤纸擦去残留的水珠,置于无菌的环境中备用;
(5)将一只枪式镊子从顶部插入雌穗,用左手持住镊子,右手用装有#21刀片的手术刀切去籽粒的上半部分;
(6)换上#10刀片,将刀尖插入籽粒下部的果皮与胚乳之间,将胚乳挑出;
(7)用刀尖将粘在胚乳顶部或顶部果皮内的幼胚转移到诱导培养基上,操作要小心,不要损伤幼胚。放置时注意胚轴(较平的一面)向下,盾片向上,每皿约放置20~30个;
(8)27~28℃暗培养3~4周,使之开始脱分化,形成愈伤组织;此后,选择生长迅速、质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织继代培养,每2~3周继代一次,选择生长良好的愈伤准备基因枪转化;
(9)在射击前4hr,将切成小块的愈伤转移到含0.4M甘露醇的高渗培养基上;
(10)射击后,使愈伤在高渗培养基上继续培养过夜,然后转移到诱导培养基上,恢复培养一周。
2-3-3用基因枪进行玉米转化
(1)打开超净台,用70%乙醇擦拭超净台内部和基因枪的表面及内部;
(2)打开紫外灯,灭菌30min;
(3)按前述步骤准备微弹;
(4)易裂片、微弹载体、阻拦网灭菌(置于70%乙醇中1.0min,放在滤纸上自然风干);
(5)打开气瓶,调节压力至2,000psi;
(6)按前述方法安装微弹载体和微弹;
(7)将易裂片、阻拦网和微弹载体安装进固定装置中;射击参数为:Gap distance:20mm;微弹载体飞行距离(Macroprojectile flight distance):10mm;微弹飞行距离(Particle flightdistance):7cm;压力:1,350psi;真空度:25inches Hg.;
(8)把培养皿放在托盘上,使愈伤都集中在托盘中间的圆圈内,将托盘插入倒数第二档;
(9)打开基因枪的电源;
(10)打开真空泵;
(11)关闭基因枪的门,按下“抽真空”键(Vac),当真空表读数达到25inches Hg.时,使键置于“保持(Hold)”档;
(12)按下“射击(Fire)”健直到射击结束;
(13)按下“放气”健,使真空表读数归零;
(14)打开基因枪门,取出培养皿,盖好盖子并用封口膜封好;
(15)重复上述步骤,直至完成转化。
2-3-4转化愈伤组织的筛选和植株的再生
(1)将转化后的愈伤组织置于黑暗中,28℃培养过夜,然后转移到N6诱导培养基上培养5~7天;
(2)将愈伤转移到筛选培养基上(含PPT20mg/L),两周继代一次,选择色泽正常、分化良好的愈伤,弃去衰老死亡的愈伤。每皿的培养物不宜过多,愈伤块应尽量小些,并使愈伤紧贴培养基;
(3)继代3~4次后,将愈伤移至N6分化培养基上,在光周期为亮/暗=16/8,28℃条件下培养,每两周继代一次;
(4)将发生绿芽的愈伤组织切分;
(5)当小植株长到1~2cm高时,转移进三角瓶中(含MS生根培养基)继续培养;
(6)3~4叶期且根系较发达时,将小苗移入小花盆中,移入温室培养;二周后移入大花盆,直至开花结实。
2-4转基因植株的PCR检测
2-4-1转基因植株基因组DNA的提取-SDS法
1)称取0.2g的叶片放入1.5ml离心管,用液氮充分研磨成粉末。
2)加入500μl SDS-Buffer(100mM Tris,50mM EDTA,500mM NaCl,pH 8.0),混匀。3)再加入20μl 20%SDS,轻轻混匀后置于65℃水浴10分钟。
4)加入250μl 5M KAC,混匀,冰上放置30分钟。
5)4℃离心,12000rpm,10分钟。
6)取上清,移入新的离心管中,加入等体积的异丙醇中,冰浴5分钟。
7)4℃离心,12000rpm,10分钟。
8)弃上清,70%乙醇洗涤两次,真空干燥DNA后,加入40μl无菌双蒸水溶解,-20℃保存备用。
PCR检测:
反应体系 40μl
10×PCR buffer 4μl
dNTPs(2.5mM) 3.2μl
引物对(10μM) 各1.6μl
模板 1μl
Taq聚合酶(5U/μl) 0.4μl
超纯水补至40μl
PCR反应条件
94℃预变性5min
72℃延伸10min
16℃ 1min 终止反应
检测引物:
Jc1AiF:GTTTCTGTTGAGCGAGTTTGTTCC
Jc1AiR:CACAGCATAGTCGGTGTAGTTGCC
经过抗性筛选得到15株抗性植株,提取抗性植株基因组,以其做模板,进行PCR检测,共得到6株PCR阳性植株(图6)。提取PCR阳性植株可溶性蛋白,1号植株Cry1Ai蛋白的含量最高可占总可溶蛋白的0.23%。(图7是改造mCry1Ai表达蛋白在可溶性蛋白中所占比例图)
PCR阳性植株的生物活性测定
将PCR阳性植株移栽,当植株生长到6~8叶时,将玉米螟初孵幼虫接于心叶中,以未转化植株作为阴性对照,接虫2周后调查食叶级别见表4。结果显示,人工接虫玉米螟后,转基因植株单株间的抗虫性表现有一定差异:转基因植株对玉米螟表现为抗性,没有或只有很小的玉米螟危害的虫孔(图8,未转化植株被玉米螟咬食严重,叶片虫孔大且虫孔数目多,已影 响到植株的正常生长。
附录
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>苏云金芽孢杆菌cry1Ai在抗虫中的用途、改造的mcry1Ai基因及应用
<130>P09478/ZWB
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>3546
<212>DNA
<213>cry1Ai全长基因
<400>1
atggataaca atccgaacat caatgaatgc attccttata attgtttaag taaccctgaa 60
gtagaagtat taggtggaga aagaatagaa actggttaca ccccaatcga tatttccttg 120
tcgctaacgc aatttctttt gagtgaattt gttcccggtg ctggatttgt gttaggacta 180
gttgatataa tatggggaat ttttggtccc tctcaatggg acgcatttct tgtacaaatt 240
gaacagttaa ttaaccaaag aatagaagaa ttcgctagga accaagccat ttctagatta 300
gaaggactaa gcaatcttta tcaaatttac gcagaatctt ttagagagtg ggaagcagat 360
cctactaatc cagcattaag agaagagatg cgtattcaat tcaatgacat gaacagtgcc 420
cttacaaccg ctattcctct ttttgcagtt caaaattatc aagttcctct tttatcagta 480
tatgttcaag ctgcaaattt acatttatca gttttgagag atgtttcagt gtttggacaa 540
aggtggggat ttgatgccgc gactatcaat agtcgttata atgatttaac taggcttatt 600
ggcaactata cagattatgc tgtgcgctgg tacaatacgg gattagagcg tgtatgggga 660
ccggattcta gagattgggt aaggtataat caatttagaa gagagctaac acttactgta 720
ttagatatcg ttgctctatt ctcaaattat gatagtcgaa ggtatccaat tcgaacagtt 780
tcccaattaa caagagaaat ttatacgaac ccagtattag aaaattttga tggtagtttt 840
cgtggaatgg ctcagagaat agaacagaat attaggcaac cacatcttat ggatatcctt 900
aatagtataa ccatttatac tgatgtgcat agaggcttta attattggtc agggcatcaa 960
ataacagctt ctcctgtagg gttttcagga ccagaattcg cattcccttt atttgggaat 1020
gcggggaatg cagctccacc cgtacttgtc tcattaactg gtttggggat ttttagaaca 1080
ttatcttcac ctttatatag aagaattata cttggttcag gcccaaataa tcaggaactg 1140
tttgtccttg atggaacgga gttttctttt gcctccctaa cgaccaactt gccttccact 1200
atatatagac aaaggggtac agtcgattca ctagatgtaa taccgccaca ggataatagt 1260
gtaccacctc gtgcgggatt tagccatcga ttgagtcatg ttacaatgct gagccaagca 1320
gctggagcag tttacacctt gagagctcca acgttttctt ggcagcatcg cagtgctgaa 1380
tttaataata taattgcatc ggatagtatt actcaaatcc ctgcagtgaa gggaaacttt 1440
ctttttaatg gttctgtaat ttcaggacca ggatttactg gtggggactt agttagatta 1500
aatagtagtg gaaataacat tcagaataga gggtatattg aagttccaat tcacttccca 1560
tcgacatcta ccagatatcg agttcgtgta cggtatgctt ctgtaacccc gattcacctc 1620
aacgttaatt ggggtaattc atccattttt tccaatacag taccagctac agctacgtca 1680
ttagataatc tacaatcaag tgattttggt tattttgaaa gtgccaatgc ttttacatct 1740
tcattaggta atatagtagg tgttagaaat tttagtggga ctgcaggagt gataatagac 1800
agatttgaat ttattccagt tactgcaaca ctcgaggctg aatataatct ggaaagagcg 1860
cagaaggcgg tgaatgcgct gtttacgtct acaaaccaac tagggctaaa aacaaatgta 1920
acggattatc atattgatca agtgtccaat ttagttacgt gtttatcgga tgaattttgt 1980
ctggatgaaa agcgagaatt gtccgagaaa gtcaaacatg cgaagcgact cagtgatgaa 2040
cgcaatttac tccaagattc aaatttcaaa gacattaata ggcaaccaga acgtgggtgg 2100
ggcggaagta cagggattac catccaagga ggggatgacg tatttaaaga aaattacgtc 2160
acactatcag gtacctttga tgagtgctat ccaacatatt tgtatcaaaa aatcgatgaa 2220
tcaaaattaa aagcctttac ccgttatcaa ttaagagggt acatcgaaga tagtcaagat 2280
ttagaagttt atttgatccg ttacaatgca aaacacgaaa cgttaaacgt gccaggtacg 2340
ggttccttat ggccacttgc agttaaaagt ccaattggaa ggtgcggtga accgaatcga 2400
tgtgcaccac ggattgagtg gaaacctgat gtagattgtt cctgcagaga cggagaaaaa 2460
tgtgcgcatc attcccatca tttctccttg gacattgatg taggatgtac agacttaaat 2520
gaggatttag gcgtatgggt gatattcaag attaagacac aagatggcca tgcgaaaata 2580
ggaaatctag aatttctcga agagaagctt ttattaggag aagcattagc acgtgtgaag 2640
aaagcggaga aaaaatggag agacaaacgc gaaaaattgg aatgggaaac aaatattgtt 2700
tataaagagg caaaagaatc tgtagatgct ttattcgtag attctcaata taatagatta 2760
caaacggata cgaacattgc gatgattcat gcggcagata aacgcgttca tcgaatccga 2820
gaagcgtatt tgccagagtt atctgtgatt ccgggtgtca atgcggctat tttcgaagaa 2880
ttagaaggtc ttattttcac cgcattctcc ctatatgatg cgagaaatgt cattaaaaac 2940
ggagatttca attatggttt atcatgctgg aatgtgaaag ggcatgtaga tgtagaagaa 3000
caaaacaacc accgttccgt ccttgttatc ccagaatggg aagcagaagt gtcccaagaa 3060
gttcgtgtct gtccaggtcg tggctatatc cttcgtgtta cagcgtacaa agagggatat 3120
ggagagggct gcgtaacgat ccatgagatc gaagacaata cagacgaact gaaattcagc 3180
aactgtgtag aagaggaagt atatccaaac aacacggtaa cgtgtaatga ttatactgcg 3240
actcaagaag aatatgaggg tacgtacact tctcgtaatc gaggatatga cggagcctat 3300
gaaagcaatt cttctgtacc agctgattat gcatcagcct atgaagaaaa agcgtataca 3360
gatggacgaa gagacaatcc ttgtgaatct aacagaggat atagggatta cacaccacta 3420
ccagctggct atgtgacaaa agaattagag tacttcccag aaaccgataa ggtatggatt 3480
gagatcggag aaacggaagg aacattcatt gtggatagcg tggaattact ccttatggag 3540
gaatag 3546
<210>2
<211>1181
<212>PRT
<213>cry1Ai全长基因编码的氨基酸序列
<400>2
1 METAspAsnAsnProAsnIleAsnGluCysIleProTyrAsnCysLeuSerAsnProGlu
21 ValGluValLeuGlyGlyGluArgIleGluThrGlyTyrThrProIleAspIleSerLeu
41 SerLeuThrGlnPheLeuLeuSerGluPheValProGlyAlaGlyPheValLeuGlyLeu
61 ValAspIleIleTrpGlyIlePheGlyProSerGlnTrpAspAlaPheLeuValGlnIle
81 GluGlnLeuIleAsnGlnArgIleGluGluPheAlaArgAsnGlnAlaIleSerArgLeu
101 GluGlyLeuSerAsnLeuTyrGlnIleTyrAlaGluSerPheArgGluTrpGluAlaAsp
121 ProThrAsnProAlaLeuArgGluGluMETArgIleGlnPheAsnAspMETAsnSerAla
141 LeuThrThrAlaIleProLeuPheAlaValGlnAsnTyrGlnValProLeuLeuSerVal
161 TyrValGlnAlaAlaAsnLeuHisLeuSerValLeuArgAspValSerValPheGlyGln
181 ArgTrpGlyPheAspAlaAlaThrIleAsnSerArgTyrAsnAspLeuThrArgLeuIle
201 GlyAsnTyrThrAspTyrAlaValArgTrpTyrAsnThrGlyLeuGluArgValTrpGly
221 ProAspSerArgAspTrpValArgTyrAsnGlnPheArgArgGluLeuThrLeuThrVal
241 LeuAspIleValAlaLeuPheSerAsnTyrAspSerArgArgTyrProIleArgThrVal
261 SerGlnLeuThrArgGluIleTyrThrAsnProValLeuGluAsnPheAspGlySerPhe
281 ArgGlyMETAlaGlnArgIleGluGlnAsnIleArgGlnProHisLeuMETAspIleLeu
301 AsnSerIleThrIleTyrThrAspValHisArgGlyPheAsnTyrTrpSerGlyHisGln
321 IleThrAlaSerProValGlyPheSerGlyProGluPheAlaPheProLeuPheGlyAsn
341 AlaGlyAsnAlaAlaProProValLeuValSerLeuThrGlyLeuGlyIlePheArgThr
361 LeuSerSerProLeuTyrArgArgIleIleLeuGlySerGlyProAsnAsnGlnGluLeu
381 PheValLeuAspGlyThrGluPheSerPheAlaSerLeuThrThrAsnLeuProSerThr
401 IleTyrArgGlnArgGlyThrValAspSerLeuAspValIleProProGlnAspAsnSer
421 ValProProArgAlaGlyPheSerHisArgLeuSerHisValThrMETLeuSerGlnAla
441 AlaGlyAlaValTyrThrLeuArgAlaProThrPheSerTrpGlnHisArgSerAlaGlu
461 PheAsnAsnIleIleAlaSerAspSerIleThrGlnIleProAlaValLysGlyAsnPhe
481 LeuPheAsnGlySerValIleSerGlyProGlyPheThrGlyGlyAspLeuValArgLeu
501 AsnSerSerGlyAsnAsnIleGlnAsnArgGlyTyrIleGluValProIleHisPhePro
521 SerThrSerThrArgTyrArgValArgValArgTyrAlaSerValThrProIleHisLeu
541 AsnValAsnTrpGlyAsnSerSerIlePheSerAsnThrValProAlaThrAlaThrSer
561 LeuAspAsnLeuGlnSerSerAspPheGlyTyrPheGluSerAlaAsnAlaPheThrSer
581 SerLeuGlyAsnIleValGlyValArgAsnPheSerGlyThrAlaGlyValIleIleAsp
601 ArgPheGluPheIleProValThrAlaThrLeuGluAlaGluTyrAsnLeuGluArgAla
621 GlnLysAlaValAsnAlaLeuPheThrSerThrAsnGlnLeuGlyLeuLysThrAsnVal
641 ThrAspTyrHisIleAspGlnValSerAsnLeuValThrCysLeuSerAspGluPheCys
661 LeuAspGluLysArgGluLeuSerGluLysValLysHisAlaLysArgLeuSerAspGlu
681 ArgAsnLeuLeuGlnAspSerAsnPheLysAspIleAsnArgGlnProGluArgGlyTrp
701 GlyGlySerThrGlyIleThrIleGlnGlyGlyAspAspValPheLysGluAsnTyrVal
721 ThrLeuSerGlyThrPheAspGluCysTyrProThrTyrLeuTyrGlnLysIleAspGlu
741 SerLysLeuLysAlaPheThrArgTyrGlnLeuArgGlyTyrIleGluAspSerGlnAsp
761 LeuGluValTyrLeuIleArgTyrAsnAlaLysHisGluThrLeuAsnValProGlyThr
781 GlySerLeuTrpProLeuAlaValLysSerProIleGlyArgCysGlyGluProAsnArg
801 CysAlaProArgIleGluTrpLysProAspValAspCysSerCysArgAspGlyGluLys
821 CysAlaHisHisSerHisHisPheSerLeuAspIleAspValGlyCysThrAspLeuAsn
841 GluAspLeuGlyValTrpValIlePheLysIleLysThrGlnAspGlyHisAlaLysIle
861 GlyAsnLeuGluPheLeuGluGluLysLeuLeuLeuGlyGluAlaLeuAlaArgValLys
881 LysAlaGluLysLysTrpArgAspLysArgGluLysLeuGluTrpGluThrAsnIleVal
901 TyrLysGluAlaLysGluSerValAspAlaLeuPheValAspSerGlnTyrAsnArgLeu
921 GlnThrAspThrAsnIleAlaMETIleHisAlaAlaAspLysArgValHisArgIleArg
941 GluAlaTyrLeuProGluLeuSerValIleProGlyValAsnAlaAlaIlePheGluGlu
961 LeuGluGlyLeuIlePheThrAlaPheSerLeuTyrAspAlaArgAsnValIleLysAsn
981 GlyAspPheAsnTyrGlyLeuSerCysTrpAsnValLysGlyHisValAspValGluGlu
1001 GlnAsnAsnHisArgSerValLeuValIleProGluTrpGluAlaGluValSerGlnGlu
1021 ValArgValCysProGlyArgGlyTyrIleLeuArgValThrAlaTyrLysGluGlyTyr
1041 GlyGluGlyCysValThrIleHisGluIleGluAspAsnThrAspGluLeuLysPheSer
1061 AsnCysValGluGluGluValTyrProAsnAsnThrValThrCysAsnAspTyrThrAla
1081 ThrGlnGluGluTyrGluGlyThrTyrThrSerArgAsnArgGlyTyrAspGlyAlaTyr
1101 GluSerAsnSerSerValProAlaAspTyrAlaSerAlaTyrGluGluLysAlaTyrThr
1121 AspGlyArgArgAspAsnProCysGluSerAsnArgGlyTyrArgAspTyrThrProLeu
1141 ProAlaGlyTyrValThrLysGluLeuGluTyrPheProGluThrAspLysValTrpIle
1161 GluIleGlyGluThrGluGlyThrPheIleValAspSerValGluLeuLeuLeuMETGlu
1181 Glu***
<210>3
<211>2091
<212>DNA
<213>Cry1Ai蛋白的杀虫活性区
<400>3
ggatccaagc tttctagacc cgggcctatt tttacaacaa ttaccaacaa caacaaacaa 60
caaacaacat tacaattact atttacaatt acaaccatgg cgatttcgcg ggagatggac 120
aacaatccga acattaacga gtgcataccc tacaactgtc tcagcaaccc tgaggtggaa 180
gtgctcggtg gagagaggat agagactggt tacaccccaa tcgacatctc cttgtcgcta 240
acgcagtttc tgttgagcga gtttgttccc ggtgccggct ttgtgttagg cctagttgac 300
atcatatggg gaatctttgg tccctctcaa tgggacgcgt ttcttgtcca gatagaacaa 360
ctcatcaatc agcgcatcga agagttcgcc aggaatcagg ccatttccag actcgaagga 420
ctaagcaatc tgtatcagat ctacgctgag tccttccggg agtgggaagc cgatcccacc 480
aatccagcgc tccgggaaga gatgcgcata cagttcaatg acatgaacag tgcccttaca 540
accgccattc ccctgtttgc ggttcagaac taccaagttc ctctgctctc ggtctacgtt 600
caagctgcga atctccatct ctcagtcttg cgggatgtat cggtgtttgg acaaaggtgg 660
ggctttgatg ccgcgaccat caacagccgt tacaatgatc tcaccaggct cattggcaac 720
tacaccgact atgctgtgcg ctggtacaac acgggcttag agcgtgtgtg gggaccggac 780
tccagagatt gggtgaggta caatcagttc agacgagagc taacacttac tgtgctcgac 840
atcgttgctc tgttctcgaa ctatgatagt cgaaggtatc cgattcgaac agtctcccag 900
ttgaccagag agatctatac gaacccagtg ctcgagaact tcgatggcag ctttcgtggc 960
atggcacaac gcatagaaca gaatatcagg caaccgcacc ttatggacat ccttaacagc 1020
ataaccatct atactgatgt gcatagaggc ttcaactact ggtcagggca ccagatcaca 1080
gcctctcctg tagggttctc tggaccggag ttcgcgttcc ctctatttgg gaatgcgggg 1140
aatgcagctc cacccgtgct tgtctcactc actggcttgg ggatcttccg cacactctct 1200
tcacctctct atcgcagaat catacttggt tcaggcccaa acaaccagga actgtttgtc 1260
cttgatggca cggagttctc ctttgcctcc ctgacgacca acttgccttc cactatctac 1320
cggcagaggg gtacagtcga ttcgctagat gtcatcccgc cacaagacaa cagcgtaccg 1380
cctcgtgcgg gattcagcca ccgattgagc catgtcacca tgctgagcca agcagctgga 1440
gcagtctaca ccttgagagc acccacgttc tcttggcaac atcgcagtgc cgagttcaat 1500
aacataatcg cgtcggatag catcactcag atccctgcag tgaagggcaa ctttcttttc 1560
aatggctctg tcatctcagg accaggcttc actggtgggg acttagttcg gctcaattcg 1620
agtggcaaca acattcagaa ccgggggtac attgaggttc ccattcactt cccgtcgacc 1680
tctaccaggt atcgagttcg tgtacggtat gcctctgtga ccccgattca cctcaacgtc 1740
aattggggca actcgtccat tttctccaac acagtaccag ccacagccac gtcactcgac 1800
aacctgcaat cgagcgactt cggctacttc gagagtgcca atgccttcac gtcttcctta 1860
ggtaacatcg taggtgtcag gaacttcagt gggactgcag gcgtgatcat agaccgcttc 1920
gagtttattc cggttactgc aacactcgag gctgagtaca atctggaaag agcgcagaag 1980
gcggtgaatg cgctgtttac gtcaacaaat cagctggggc tgaaaacaaa tgtgacggac 2040
taccataagg atgaactttg ataaggtacc ctcgaggagc tctccgaatt c 2091
机译: 用于上皮伤口预防和治疗的药物组合物,免疫调节药物组合物,药物组合物,杀虫剂,杀虫剂组合物,凝集素KM +杀虫剂在瘢痕形成中的用途,凝集素KM +在制备免疫调节药物中的用途,凝集素KM +的用途在制备抗菌药物中,凝集素KM +在抗病毒药中的应用,凝集素KM +在抗真菌药中的应用,凝集素KM +在抗寄生虫药中的应用,表达方法,DNA载体,重组生物,核苷酸序列,抗体,蛋白质和核外基因
机译: 苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的质粒编码,它们的产生及其在创建基因工程细菌菌株中的应用,其在每个人中的无性耐药性及其在生产唾液蛋白,所生产的蛋白质,方法和方法中的用途杀虫效果
机译: 杀虫多肽,杀虫组合物,重组多核苷酸,dna构建体,植物细胞或转基因植物,抑制生长或消灭农业害虫种群的方法,抑制生长或消灭害虫的方法,防治鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵害的方法转基因植物中的抗性,并提供抗虫性管理和至少一种杀虫剂多肽的用途