一种草莓茎尖组培专用培养基及其生产脱毒苗的方法

摘要

本发明公开了一种属于组培育苗技术领域的草莓茎尖组培专用培养基。包括初代培养基、继代培养基和生根培养基。所述初代培养基是向MS培养基中添加浓度为0.2～0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤和浓度为0.1-0.2mg/L的萘乙酸；所述继代培养基是向MS培养基中添加浓度为0.2～0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤；所述生根培养基为1/2MS培养基。本发明还公开了利用上述培养基培养草莓茎尖组织生产脱毒苗的方法，包括草莓苗的热处理、取材灭菌、初代培养基、继代培养、和生根培养基和移栽等步骤。本发明的草莓脱毒快繁体系方便实用、脱毒效果好、繁殖系数高、遗传稳定性好而且再生率高，可作为商业用途在生产上的大规模使用。

说明书

技术领域

本发明属于组培育苗技术领域，具体说涉及一种草莓茎尖组培专用培养基及其生产脱毒苗的方法。

背景技术

草莓(Fragaria ananassa Ducde)是蔷薇科草莓属宿根性多年生常绿草本植物，属于多倍体，是一种靠匍匐茎进行无性繁殖的作物，传统种苗培育的方法是采用匍匐茎繁殖的无性繁殖方式，效率较低，不利于优良品种的推广，而且极易感染病毒。我国已鉴定明确的草莓病毒有四种，即草莓斑驳病毒(SMOV)、草莓轻型黄边病毒(SMYEV)、草莓皱缩病毒(SCRV)和草莓镶脉病毒(SVBV)。种苗普遍感染病毒是草莓生产中的瓶颈问题，感染病毒的草莓比未感染病毒的草莓长势弱、抗性差、产量明显下降，果品品质与商品性状变劣，严重影响了这一名优种植业的稳步发展。目前，解决草莓的病毒病主要是通过草莓脱毒组培技术，即通过花药组织培养、微茎尖组织培养等技术脱去病毒病原获得无毒草莓再生植株，使草莓种苗恢复品种原种优良种性，以达到优质、高产之目的。草莓的茎尖培养是获得无病毒植株的重要途径。在茎尖培养过程中，应根据外植体来源和生长状况不同，对培养基中激素浓度的大小及相互之间的配比进行调整，从而得到某种材料及相应外植体的最适组培方法。

红颜草莓(又称红颊草莓，日本99号，红脸颊)，是目前最优秀的日本系列草莓。红颜草莓生长势强，植株较高(25厘米)，结果株径大，分生新茎能力中等，叶片大而厚，叶柄浅绿色，基部叶鞘略呈红色，匍匐茎粗，抽生能力中等，花序梗粗，分枝处着生一大一小两完全叶。每个花序4至5朵花，花瓣易落，不污染果实。该品种果个较大，最大可达100多克，一般30至60克。果实圆锥形，种子黄而微绿，稍凹入果面，果肉橙红色，质密多汁，香味浓香，糖度高，风味极佳，果皮红色，富有光泽，韧性强，果实硬度大，耐贮运；但红颜草莓育苗不易，初代培养脱毒效果差，污染及玻璃化问题，初代茎尖萌发率和繁育系数低，移栽成活率不高，继代快繁培养过程中，经常会出现一种生长异常的试管苗即玻璃苗。表现出植株矮小、叶色浅且皱缩，呈水晶样透明或半透明水渍状，茎叶变脆硬，易碎，严重影响繁殖率，给生产造成很大损失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茎尖组培专用培养基。包括初代培养基、继代培养基和生根培养基。

本发明的另一目的在于提供一种草莓茎尖组织培养生产脱毒苗的方法。

一种草莓茎尖组织初代培养基，该初代培养基是含有浓度为0.2～0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)和浓度为0.1-0.2mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培养基，也就是说是以MS培养基为基础培养基，然后向MS培养基中添加浓度为0.2～0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)和浓度为0.1-0.2mg/L的萘乙酸(NAA)；

上述初代培养基中还包含0.02mg/L的赤霉素(GA₃)或/和0.3mg/L的激动素(KT)；

上述初代培养基中0.1-0.2mg/L的萘乙酸(NAA)可以用0.2mg/L的吲哚乙酸(IAA)来代替。

一种草莓茎尖组织继代培养基，该继代培养基是含有浓度为0.2～0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)的MS培养基；

上述继代培养基中还包括0.2mg/L的吲哚乙酸(IAA)。

一种草莓茎尖组织生根培养基，该生根培养基为1/2MS；

上述生根培养基还包含0.1～0.3mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0.5～1.0mg/L的吲哚乙酸(IAA)或0.01～0.1mg/L的萘乙酸(NAA)。

一种草莓茎尖组织培养生产脱毒苗的方法，包括以下操作步骤：

(1)热处理：将无病健壮的日本红颜草莓苗放入人工气候箱中，一天中16小时在40～41℃、有光照的条件下处理，其余18小时在35℃、黑暗条件下处理，持续变温处理4-5周；

(2)材料的采集及消毒：取步骤(1)热处理后的草莓苗匍匐茎顶芽，进行灭菌消毒处理；

(3)茎尖初代培养：在解剖镜下从灭菌消毒后的顶芽上切取0.2-0.5mm大小的茎尖生长点，接种到上述的初代培养基中，暗培养5-7天后，光照培养35-45天至分化出丛生芽，其中，光照强度为1500-2000lx，光照时间为10h/d，温度25±2℃；

(4)继代培养：将初代培养分化出来的丛生芽转接到上述继代培养基中培养25-35天，光照强度为2000-3000lx，光照时间为14h/d，温度25±2℃，继代培养代数控制在5-8代；

(5)生根培养：将经继代培养的草莓苗转到上述生根培养基中促使其生根，生根培养20-35天；

(6)草莓苗的驯化及移栽：将生根培养后的瓶栽草莓苗置于待生长条件下炼苗7-10天，移栽时开盖锻炼1-2d，然后将其移栽至含有基质的营养钵中。

所述移栽具体为：将生根培养后的瓶栽草莓苗置于待生长条件下炼苗7-10天，移栽时开盖锻炼1-2d，然后把草莓苗取出，用水冲掉培养基，用1000倍百菌清浸泡5min后扦插到8×8营养钵中，所用基质为袋装富养基质，扦插完毕后覆膜保湿7-10天，保持相对湿度80％以上，温度30℃以上加盖遮阳网，7-10天后逐步撤膜。

步骤(2)中所述顶芽为2-3cm长，灭菌和消毒方法为：清水冲洗2-3小时后，依次用75％酒精消毒30s，5％次氯酸钠溶液消毒10min，然后再用无菌水冲洗5-8次。

所述0.2-0.5mm大小的茎尖生长点带2-3个叶原基。

步骤(4)中继代培养达到第5代后，包括第5代，使用的继代培养基中硝酸铵浓度降为原浓度的1/2-1/4，继代培养基中其他成分不变。

步骤(6)所述基质为本领域常规使用的基质配方，比如：草碳、蛭石和珍珠岩的混合物。

所使用的培养基的pH为5.7-5.8。

本发明的有益效果：本发明的草莓脱毒快繁体系方便实用、脱毒效果好、繁殖系数高、遗传稳定性好而且再生率高，具体如下：①本发明的组培方法步骤(2)采取的热处理结合茎尖培养脱毒，使草莓苗的脱毒效果达到100％；②在初代培养过程中往往会褐化严重，大大降低诱导萌发率，本发明通过暗培养5-7天，同时降低培养温度来防止褐化，褐化比例明显减少；③继代培养中玻璃化是普遍严重的问题，在这方面本发明主要是通过降低铵态氮与控制代数同时严格控制温度来解决，一般继代培养5代以后，培养基中的大量元素硝酸铵的浓度降为原浓度的1/2-1/4，一般继代控制在8代以内，本发明的繁育系数为5-10；④采用本发明初代培养基对红颜草莓茎尖进行诱导分化培养，其茎尖萌发率为50-65％，而通常情况下茎尖萌发率仅为40％左右；⑤采用本发明生根培养基对红颜草莓茎尖进行生根培养，其诱导生根率90％以上，平均根数5-10条，根长3-8cm不等；⑥本发明的草莓苗的移栽成活率为95％以上。⑦将本发明方法获得的草莓苗进行大规模生产种植，结果表明，草莓亩产量达到3500Kg/亩。本发明方法可作为商业用途的草莓苗脱毒方法在生产上的大规模使用。

具体实施方式

实施例1含有不同激素的初代培养基培养红颜草莓茎尖的实验

将无病健壮的日本红颜草莓苗放入人工气候箱中，一天中16小时在40℃、有光照的条件下处理，其余18小时在35℃、黑暗条件下处理，持续变温处理4周；然后获取顶芽2-3cm长，清水冲洗2-3小时后，依次用75％酒精消毒30s，5％次氯酸钠溶液消毒10min，然后再用无菌水冲洗5-8次；在解剖镜下切取0.2-0.5mm大小的茎尖生长点，接种到上述的初代培养基中，暗培养5天后进行光照培养，光照强度为2000lx，光照时间为10h/d，温度25±2℃；各初代培养基设两个重复，每个处理接种茎尖数为50个，茎尖萌发率统计以茎尖生长点接种后40天分化出的丛生芽为准，茎尖萌发率％＝(萌发出芽的茎尖数/接种总茎尖数)×100％，结果见表1。

配制初代培养基：以MS为基本培养基，向其中添加不同浓度的激素(见表1)，共四种培养基，pH调节至5.7-5.8，高压灭菌20min；

表1含有不同激素的初代培养基及其茎尖萌发率

实施例2用含有不同激素的继代培养基培养草莓丛生芽的实验

把实施例1中的丛生芽分切后转接到继代培养基中培养，光照强度为2000lx，光照时间为14h/d，温度25±2℃，继代培养代数控制在5-8代；第5-6代时，将继代培养基中的大量元素NH₄NO₃的用量减为原来的1/2；第7-8代时大量元素中NH₄NO₃的用量减为原来的1/4，其他成分不变。

继代培养共设置3组，每个处理接种幼芽数为50个，继代培养基配制为：以MS为基本培养基，向其中添加不同浓度的激素(见表2)，培养基PH5.7-5.8。在上述培养基条件下继代培养8代，繁育系数见表2。

繁育系数＝培养30天后幼芽总数/接种幼芽总数

表2含有不同激素的继代培养基及其繁育系数

实施例3含有不同激素的生根培养基培养继代后的草莓苗的实验

将经继代培养的草莓苗转到生根培养基中促使其生根，每个处理接种幼苗数为50个，其中，生根率％＝(生根幼苗数/接种幼苗数)×100％，生根培养基的配制为：以1/2MS(大量元素减半，其他成分不变)为基本培养基，向其中添加不同浓度的激素(见表3)，培养基PH为5.7-5.8。在此培养基条件下生根培养30天计算其生根率，结果见表3。

表3含有不同激素的生根培养基及其生根率

实验结果表明，生根培养基中，加入生长素IAA、IBA或NAA，可以大大提高诱导生根的速度和生根率，作用效果NAA＞IBA＞IAA。

将生根培养后的瓶栽草莓苗置于温室中炼苗7-10天，移栽时开盖锻炼1-2d，然后把草莓苗取出，用水冲掉培养基，用1000倍百菌清浸泡5min后扦插到8×8营养钵中，所用基质为袋装富养基质，扦插完毕后覆膜保湿7-10天，保持相对湿度80％以上，温度30℃以上加盖遮阳网，7-10天后逐步撤膜，移栽成活率在95％以上。

采用本发明方法获得的脱毒草莓苗进行大规模生产种植，结果表明，草莓亩产量达到3500Kg/亩。