抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因及其应用

摘要

本发明公开了一种抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因的核酸序列及其应用，涉及植物分子育种领域。本发明以甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂的突变体M9为材料，利用引物对进行PCR扩增，获得突变体M9的突变基因，序列为SEQ ID NO.1；该基因翻译获得蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。应用杂交、回交等植物常规育种方法将该基因导入其它对咪唑啉酮类除草剂无抗性的油菜品种或品系，提高导入ALS基因突变核酸序列目标品种或品系对咪唑啉酮类除草剂的耐受性。

说明书

技术领域

本发明涉及植物分子育种领域，具体地说，涉及甘蓝型油菜编码乙酰乳酸合成酶且可以建立咪唑啉酮类除草剂抗性的突变基因核酸序列及其应用。 

背景技术

咪唑啉酮类除草剂是美国氰胺公司在20世纪80年代初开发成功的一类广谱、用量低、对哺乳动物低毒和对环境友好的高效除草剂，通过抑制植物体内支链氨基酸生物合成关键酶乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)，也叫乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)，造成异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成受阻，破坏植物体内蛋白质合成，使植物黄化，生长受抑，最后逐渐死亡。ALS负责催化两个平行反应，催化两分子丙酮酸缩合形成2-乙酰乳酸放出CO₂，最终生成缬氨酸和亮氨酸，催化一分子丙酮酸和一分子2-氧丁酸缩合形成乙酰羟基丁酸，最终生成异亮氨酸。以ALS为靶酶开发的除草剂，已经成为新型高效除草剂的主流产品，1961年美国Du Pont公司首先报道了嘧啶类化合物的活性及对植物体内ALS的抑制作用，1982年该公司成功研发了第一个磺酰脲类除草剂氯磺隆(Chlorsulfuron)。继氯磺隆研发成功以来，众多国际化学公司相继成功开发了咪唑啉酮类、磺酰胺类、嘧啶水杨酸类和三唑嘧啶磺酰胺类除草剂，具体的除草剂品种和商品名更是不计其数。以ALS为靶酶的除草剂具有选择性强、杀草谱广，活性高、使用剂量低，对哺乳动物毒性小等优点，既可作土壤处理剂也可茎叶喷施，除草效率高、使用方便深得广大用户欢迎。 

国外通过对抗咪唑啉酮类除草剂(包括拟南芥、水稻、小麦、玉米、油菜、向日葵)植物的ALS基因克隆表明，抗性作物的产生是由于突变株ALS基因DNA序列产生了若干碱基位点的突变，造成编码蛋白氨基酸残基位点变异，从而引起除草剂与ALS结合方式的变化。有意思的是，这些残基位点变异多数都由5个必需氨基酸中一个氨基酸被取代所致，以拟南芥的密码子和氨基酸位置计算(以下同)，即122位丙氨酸被苏氨酸所取代，如玉米的Mutant1、中国甜菜的Sir-13、向日葵的CLHA-Plus；197位脯氨酸被组氨酸或丝氨酸所取代，如中国甜菜的sur和莴苣的1个突变体；205位丙氨酸被缬氨酸所取代，如向日葵的Two突变体；574位色氨酸被亮氨酸所取代，如玉米的XA17、油菜的PM2；653位丝氨酸被天冬酰胺酸所取代，如水稻的PWC16、小麦的TeallMl、玉米的X112和QJ22、油菜的PM1。这5个必需氨基酸中有3个氨基酸(122位丙氨酸、197位脯氨酸、和205位丙氨酸)位于ALS的氨基端，另2个(574位色氨酸和653位丝氨酸)位于酶的羧基端，这5个氨基酸在绝大多数已知植物的ALS序列中的位置相当保守，只是在苍耳(Xanthium sp.)和豚草中653位是丙氨酸，而不是丝氨酸。另外，在玉米中还发现155位的丙氨酸被苏氨酸和水稻中654位的甘氨酸被谷氨酸取代产生的抗性突变。Whaley等最近又发现了一个 新突变位点，即抗咪草烟(咪唑啉酮类除草剂的一种)的绿穗苋(Amaranthus hybridus)ALS酶376位天门冬氨酸被谷氨酸所取代。 

甘蓝型油菜(Brassica napus)为具有两套基因组A和C的异源四倍体物种(2n＝38)。其中基因组A有10条染色体，起源于不结球白菜(Brassica rapa)，而基因组C有9条染色体，起源于花椰菜(Brassicaoleracea)。Rutledge等发现在甘蓝型油菜基因组内存在5个ALS基因(ALS1～5)，以多基因家族的形式存在，其多样性超过烟草和拟南芥。甚至有人提出，以ALS基因作为遗传标记来区分甘蓝型油菜的品种。而作物对咪唑啉酮类抗性是由于ALS基因产生若干碱基位点突变的结果，但在甘蓝型油菜中仅发现2个ALS位点突变产生的抗性油菜，且都是通过小孢子化学诱变获得，自然突变产生的抗咪唑啉酮类除草剂油菜在国内外未见报道。 

在已有的国内专利中报道了有关抗咪唑啉酮类除草剂作物有小麦、玉米、中国甜菜、向日葵，都是国外公司或研究机构发明。同时，国内关于抗除草剂油菜的研究材料基本都来自国外，抗性基因受国际知识产权保护，一旦商业化种植，要向专利拥有者交纳昂贵的专利费，大幅度提高油菜生产成本。开发具有自主知识产权的抗(耐)除草剂基因，是我国抗除草剂油菜早日进入商业化生产的当务之急。但迄今为止，国内还没有公开或发表过甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂的基因及其应用。 

发明内容

技术问题 

本发明的目的就在于弥补已有专利或技术的不足，以我们发现的自然突变产生的抗咪唑啉酮类除草剂甘蓝型油菜品系M9为材料，提供一种抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因的核酸序列，其编码植物体内乙酰乳酸合成酶，该酶是植物体内支链氨基酸生物合成关键酶。 

本发明的另一个目的在于提供一种甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因突变型的核酸序列在油菜抗咪唑啉酮类除草剂中的应用。 

技术方案  本发明通过以下方案实现： 

一种抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因的核酸序列，其特征是：该序列为SEQ IDNO.1，由2006个碱基组成，命名为BnALS1R基因，即抗咪唑啉酮类除草剂基因，编码乙酰羟基酸合成酶，又叫乙酰乳酸合成酶，与其它来源的甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因相比，BnALS1R基因在1933处G突变成了A。 

上述的核酸序列编码的蛋白质，其特征在于：该序列为SEQ ID NO.2，由655个氨基酸残基组成，编码蛋白序列第638或等同位置处的氨基酸残基为天冬酰氨酸。 

上述的核酸序列用于抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜的育种方法，其特征是： 

(1)用M9单株分别与MICMS双低恢复系3075R和3018R配制4个正反交组合，秋播对4个组合杂种F₁及亲本在菜苗3-5叶期用山东先达化工有限公司生产的咪唑啉酮类除草剂5.0％“豆施乐”水剂处理，处理浓度为90ga.i./hm²，15d后调查成活苗与死苗数，进行抗性鉴定，抗性亲本及杂种F₁均生长正常，其中M9抗性亲本后代株系鉴定，未发现死苗和药害现象； 

(2)对组合3075R/M9和3018R/M9的F₁植株进行小孢子培养，步骤如下： 

油菜开花早期于每日上午7时左右摘取刚开放第一朵花的花序，用吸水纸湿润处理后置于4℃恒温冰箱24h；次日挑选长度为4.5mm左右的花蕾用70％酒精浸泡30s，1％升汞表面消毒10min，无菌水冲洗3次，每次冲洗2min；将消毒花蕾置于无菌玻璃管中，加B₅提取液1ml，用玻璃棒沿管壁将花蕾捣碎挤出小孢子，并用0.22μm孔径滤膜过滤，滤液经1000r/min的离心机离心5min，去除上清液后再加入B₅提取液悬浮小孢子，复重1次，去除上清液，加入NLN-13％蔗糖培养液转入三角瓶中；32℃热激培养24h，25℃黑暗静止培养，直至出现可见的小白点胚状体时，转至25℃恒温摇床50r/min振荡培养，待胚状体长度达5mm左右时转到B₅固体培养基上，25℃光照培养，每天光照时间16小时，直至成苗；将单倍体小孢子苗用2％的秋水仙碱溶液浸泡根部3min后栽入盆钵，成株后移入大田； 

(3)对活棵苗植株在菜苗3-5叶期用有效浓度为90ga.i./hm²的咪唑啉酮类除草剂“豆施乐”进行抗性鉴定，对成活的可育单株套袋自交收获种子；由于3075R和3018R为带有不育细胞质的恢复系，以3075R和3018R为母本的杂交后代即为获得的转乙酰乳酸合成酶基因的抗咪唑啉酮MICMS恢复系。 

有益效果 

本发明的甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因的突变核酸序列，可以应用杂交、回交等植物常规育种方法将突变核酸序列导入其它对咪唑啉酮类除草剂无抗性的油菜品种或品系，提高导入ALS基因突变核酸序列目标品种或品系对咪唑啉酮类除草剂的耐受性。同时，本发明提供了控制导入ALS基因突变核酸序列目标品种或品系附近杂草的方法。该方法包含，向杂草和导入ALS基因突变核酸序列目标品种或品系使用有效量的咪唑啉酮类除草剂，其中与未导入的油菜品种或品系相比，导入的ALS基因突变核酸序列目标品种或品系具有增加的对咪唑啉酮类除草剂的抗性。 

本发明的甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因的突变核酸序列的应用研究包括，但不限于，根据本发明发现的序列特征，设计分子标记，检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因的存在；以该基因突变核酸序列构建载体，通过转基因方法培育抗咪唑啉酮类除草剂的油菜品种。 

与现有技术相比，本发明具有下列优点和效果： 

1、本发明是在我国油菜中首次发现的甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂的基因。 

2、利用本发明的甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因的突变核酸序列，可以提高其它对咪唑啉酮类除草剂无抗性的油菜品种或品系对咪唑啉酮类除草剂的耐受性。 

3、本发明的甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂的基因，打破了我国目前应用的抗除草剂基因被国外垄断的局面。 

本发明还适用于基于该基因的分子标记和基因功能研究、油菜抗除草剂育种和转基因研究等方面。 

附图说明

图1—甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因的突变核酸序列的PCR克隆电泳图 

M，DNA分子量标准，片段从大到小一次为200bp、500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp、4500bp；1，对照H₂O为模板；2，宁油16号(NY16)基因组为模板；3，宁油18号(NY18)基因组为模极；4，抗咪唑啉酮类除草剂甘蓝型油菜品系M9基因组为模板。 

图2-与不同来源的油菜乙酰乳酸合成酶基因核酸序列比较图 

NY16.seq，宁油16号的乙酰乳酸合成酶基因核酸部分序列； 

NY18.seq，宁油18号的乙酰乳酸合成酶基因核酸部分序列； 

Z11524.seq，Genbank下载序列(登录号：Z11524)； 

BnALS1R.seq，甘蓝型油菜品系M9乙酰乳酸合成酶基因核酸部分序列，星号示突变碱基。 

图3-与不同来源的油菜乙酰乳酸合成酶基因氨基酸序列比较图 

NY16.pro，宁油16号的乙酰乳酸合成酶基因氨基酸部分序列； 

NY18.pro，宁油18号的乙酰乳酸合成酶基因氨基酸部分序列； 

Z11524.pro，Genbank下载序列(登录号：Z11524)； 

BnALS1R.pro，甘蓝型油菜品系M9乙酰乳酸合成酶基因氨基酸部分序列，星号示突变氨基酸。 

图4-抗咪唑啉酮的DH株系抗性基因BnALS1R的PCR鉴定电泳图 

M，DNA分子量标准，片段从大到小一次为200bp、500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp、4500bp；1，对照宁油18号基因组为模板；2-8，抗咪唑啉酮的DH株系基因组为模极。 

图5-抗咪唑啉酮的DH株系抗性基因BnALS1R的测序结果图 

1，对照宁油18号基因组为模板的PCR产物测序得到的核酸部分序列；2-8，抗咪唑啉酮的DH株系基因组为模板的PCR产物测序得到的核酸部分序列。阴影示BnALS1R突变碱基。 

具体实施方式

下列实施中所有方法如无特别说明均为常规方法。 

(一)甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因的突变核酸序列的PCR克隆及测序 

苗期取突变体M9，即抗咪唑啉酮类除草剂的自生油菜突变株(公知公用，见高建芹等，植物遗传资源学报，2010，11(3)：369-373)鲜嫩叶片，-70℃保存备用。油菜基因组总DNA提取方法参照Murray等(1980)提出的CTAB方法并作改良。步骤如下： 

(1)取0.2g左右叶片放在研钵中，加入液氮磨碎，转入1.5ml离心管中；(2)加700μl提取缓冲液(2％CTAB，100mM Tris pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1.4M NaCl，临用时加1％β-Me)，混匀，65℃水浴1.5h；(3)冰上冷却，离心12000rpm，5min；(4)吸上清，加RNase(终浓度20μg/ml)，37℃保温0.5h；(5)加苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)600μl，上下混匀；(6)离心，12000rpm，15min；(7)取上清液，加氯仿∶异戊醇(24∶1)600μl，上下混匀；(8)离心，12000rpm，15min；(9)取上清液，加入300μl-20℃预冷的异丙醇，上下混匀，-20℃0.5h；(10)离心，10000rpm，10min；(11)沉淀用600μl 70％乙醇悬浮清洗两次；(12)弃乙醇，真空抽干，DNA用200μl 1×TE缓冲液溶解，(13)用1％琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA质量，样品-20℃冷冻保存备用。 

利用NCBI数据库中已知的ALS基因序列，在基因编码区段两侧设计能够扩增出全长的PCR引物。其正向引物F：5’CATCTCTCTCTCCTCTAACCA3’和反向引物R：5′GATCACCAGCTTCATCTCTC3′。 

以提取的油菜基因组DNA为模板，利用设计的正向引物F和反向引物R，在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行扩增。PCR反应体系为：共50μl，其中，1μl基因组DNA，5μl正向引物F(100nM)，5μl反向引物R(100nM)，5μl 10×buffer(Mg²⁺free)，4μl dNTPs(各2.5mM)，3μl MgCl₂(25mM)，0.25μl TaKaRa Taq(5U/μl)，加ddH₂O至50μl。PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min，共循环35次；72℃延伸5min；10℃保存。 

电泳结果见图1，按北京Tiangen公司生产的普通琼脂糖凝胶DNA同收试剂盒(目录号：DP209)步骤进行PCR产物纯化回收，PCR产物大小为2006bp。纯化的PCR产物送南京金斯瑞生物有限公司测序。测序结果表明该基因编码油菜乙酰乳酸合成酶，具有序列表SEQ ID NO.1的核酸序列，由2006个碱基组成，将其命名为BnALS1R，即抗咪唑啉酮类除草剂基因，BnALS1R具有编码序列表SEQ IDNO.2的氨基酸残基序列的蛋白质。 

(二)向传统油菜品种或品系导入抗性基因BnALS1R 

用M9单株分别与MICMS双低恢复系3075R(浦惠明等，2002，江苏农业科学，4：33-34)和3018R(浦惠明等，1999，江苏农业科学，6：32-33)配制4个正反交组合，秋播对4个杂种F₁及亲本在菜苗3-5叶期用山东先达化工有限公司生产的咪唑啉酮类除草剂5.0％“豆施乐”水剂处理，处理浓度为90ga.i./hm²，15d后调查成活苗与死苗数，进行抗性鉴定，2个敏感型亲本共鉴定211株，喷药后15d内全部死亡，而抗性亲本及杂种F₁均生长正常，其中M9抗性亲本后代2个株系共鉴定429株，未发现死苗和药害现象。 

对组合(3075R/M9)和(3018R/M9)的F₁植株进行小孢子培养。步骤如下： 

1)油菜开花早期于每日上午7时左右摘取刚开放第一朵花的花序，用吸水纸湿润处理后置于4℃ 恒温冰箱24h。 

2)次日挑选长度为4.5mm左右的花蕾用70％酒精浸泡30s，1％升汞表面消毒10min，无菌水冲洗3次，每次冲洗2min。 

3)将消毒花蕾置于无菌玻璃管中，加B₅提取液1ml，用玻璃棒沿管壁将花蕾捣碎挤出小孢子，并用0.22μm孔径滤膜过滤，滤液经1000r/min的离心机离心5min，去除上清液后再加入B₅提取液悬浮小孢子，复重1次，去除上清液，加入NLN-13(13％蔗糖)培养液转入三角瓶中。 

4)32℃热激培养24h，25℃黑暗静止培养，直至出现可见的小白点胚状体时，转至25℃恒温摇床50r/min振荡培养，待胚状体长度达5mm左右时转到B₅固体培养基上，25℃光照培养，每天光照时间16小时，直至成苗。 

5)将单倍体小孢子苗用2％的秋水仙碱溶液浸泡根部3min后栽入盆钵，成株后移入大田。 

对活棵苗植株在菜苗3-5叶期用有效浓度为90ga.i./hm²的咪唑啉酮类除草剂“豆施乐”进行抗性鉴定，对成活的可育单株套袋自交收获种子。由于3075R和3018R为带有不育细胞质的恢复系，以3075R和3018R为母本的杂交后代命名为DH株系，只要是可育的单株均为抗咪唑啉酮的M1CMS恢复系。 

(三)抗咪唑啉酮的DH株系抗性基因BnALS1R的PCR鉴定 

苗期取上述得到的抗咪唑啉酮DH株系的鲜嫩叶片提取DNA，进行抗性基因BnALS1R的PCR鉴定。 

电泳结果见图4，按北京Tiangen公司生产的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209)步骤进行PCR产物纯化回收，PCR产物大小为2006bp。送南京金斯瑞生物有限公司测序。测序结果见图5，表明抗咪唑啉酮DH株系的乙酰乳酸合成酶基因具有序列表SEQ ID NO.1的核酸序列，BnALS1R具有编码序列表SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列的蛋白质。