稳定表达高致病力禽流感病毒HA蛋白的MDCK细胞系及其用途

摘要

本申请涉及稳定表达高致病力禽流感病毒HA蛋白的MDCK细胞系及其在增殖A型流感病毒中的用途。本申请也涉及利用所述MDCK细胞系增殖A型流感病毒的方法。

说明书

技术领域

本申请涉及稳定表达高致病力禽流感病毒HA蛋白的MDCK细胞系及其在增殖A型流感病毒中的用途。本申请也涉及利用所述MDCK细胞系增殖A型流感病毒的方法。

背景技术

禽流感病毒(AIV)是由正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起禽类的一种从呼吸系统病变到严重全身性败血症的急性高度接触性传染病，被国际兽医局确定为I类烈性传染病。早在1878年，Perroncito就报道了禽流感在意大利的流行。1901年Centanni Saranuzzi分离和描述了该病的病原，但直到1959年Schafer才证明该病属于A型流感病毒。在以后的几年中，不断有分离到禽流感病毒的报道。尤其在近几年，禽流感在世界各地包括亚洲、北美、南非、北非、中东和远东、英国等地频繁爆发，给世界各国造成严重的经济损失。A型流感病毒不仅能引起禽类严重的疾病，而且对人类和低等哺乳类动物也是如此。自1997年，香港证实18人感染禽流感并导致6人死亡后，在越南、柬埔寨和印度尼西亚等国家陆续有报道人感染禽流感病历(Chotpitayasunondh etal.，2005)。直到2006年3月，5个亚洲国家中被确诊为患禽流感的病历共有165例，其中泰国22例，柬埔寨5例，印度尼西亚29例，越南93例，其中有94人死亡(WHO.2006)。禽流感已成为具有重要公共卫生意义的传染病，引起全世界的广泛关注。

AIV的亚型分类是按病毒表面蛋白HA和NA的抗原性不同划分的。目前已发现16种血凝素(HA)和10种神经氨酸酶(NA)。不同的AIV亚型毒力相差很大，同一亚型内的不同毒株及同一毒株感染不同宿主时其毒力也不尽相同。非致病性毒株和低致病力毒株感染后往往只引起一些轻微的临床症状，而高致病力毒株却可引起高达100％的死亡率。到目前为止，所有被判为高致病 力的毒株都属于H5和H7亚型，其血凝素HA的两个亚单位HA1和HA2的裂解位点附近均有4个或更多的碱性氨基酸，更容易被裂解。因而，所有强毒株在CEF细胞和MDCK细胞上培养时，均能在不加胰酶的条件下形成蚀斑。与此不同地是，低致病力的流感毒株仅能在加胰酶和无血清的条件下形成蚀斑。

目前，禽流感以疫苗免疫为主要手段的防控措施日渐得到广泛关注，其中以禽流感灭活疫苗应用为主。禽流感灭活疫苗的生产依旧采用50多年前成型的鸡胚培养方法。鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。尽管如此，利用鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量的SPF级的鸡胚，因此产量难以扩大。另外，鸡胚带有潜在的污染可能，而且培养周期过长，不利于应对大规模的流感爆发。另外，一旦鸡蛋有问题，整个疫苗计划就会失败。

由于上述原因，世界卫生组织、各国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。因为细胞培养具有不受外源病毒污染、生产规模易于扩大、对环境无污染等特点，有效克服鸡胚制备法的缺点。用于疫苗生产的流感毒株均为低致病力毒株或者是高致病力毒株的HA位点人工改造而符合低致病力毒株特性。低致病力流感病毒只有在加入TPCK-胰酶(裂解HA0为HA1和HA2，是感染细胞的先决条件)和无血清的条件下，才能在MDCK等易感细胞上生长。2007年，全球最大的生物制药公司之一诺华宣布，欧盟已经批准其人流感疫苗Optaflu上市。Optaflu是第一个由细胞培养而非鸡胚生产的疫苗，能够迅速扩大生产能力以应对大流行。相对于人用流感疫苗研发，禽流感疫苗细胞培养技术的研究相对滞后。2006年荷兰AkzoNobel公司有关负责人员宣称，该公司采用与传统鸡胚培养不同的方法制备人用H5N1型禽流感疫苗，即其疫苗生产是在2000升发酵罐中进行大规模无血清的细胞培养。然而，无血清的培养使得疫苗的生产成本高昂，根本无法应用在低成本控制的兽用疫苗开发上。因而，细胞培养技术在禽流感疫苗的研发上依然是不成功的。

高致病力的禽流感病毒(如H5亚型)的HA裂解位点很容易被裂解，所以无需额外地添加TPCK-胰酶。通过此特性，高致病力的禽流感病毒能在含血清的培养液中生长良好。因而，本发明人通过对流感病毒易感细胞MDCK的改造， 建立稳定表达H5HA蛋白的细胞系(MDCK-HA)。借助于表达于细胞膜上的H5HA蛋白，低致病力和高致病力(但HA裂解位点已改造为不易裂解)的A型流感病毒可在培养基含血清条件下培养的MDCK-HA细胞中生长良好。

综上所述，本发明人建立的MDCK-HA细胞系可为A型低致病力流感病毒基础研究和流感疫苗毒的大规模细胞培养提供最适宜细胞宿主。

发明内容

本申请第一方面提供一种稳定表达高致病力禽流感病毒HA蛋白的细胞，该细胞经含有表达高致病力禽流感病毒HA蛋白的逆转录病毒样颗粒转化而含有整合入细胞基因组的HA基因及真核启动子，且稳定表达HA蛋白于细胞膜上或细胞浆中，其中，所述细胞为A型流感病毒易感细胞。

在一个具体实施方式中，所述A型流感病毒易感细胞为MDCK细胞或CEF细胞。

在一个具体实施方式中，所述细胞仅表达禽流感病毒的HA基因，而不表达禽流感病毒的其它基因。

在一个具体实施方式中，所述细胞基因组含有禽流感病毒H5亚型或H7亚型的HA基因。

在一个具体实施方式中，所述真核启动子是CMV-立即启动子。

在一个具体实施方式中，所述HA基因的核苷酸序列如NCBI accession NoNC_007362所示。

在一个具体实施方式中，本申请的细胞为保藏编号为CCTCC NO：C200968的MDCK-HA细胞。

本申请第二方面提供一种细胞培养物，所述细胞培养物含有本申请的细胞。

在一个具体实施方式中，所述细胞培养物的细胞是MDCK细胞或CEF细胞。

在另一个具体实施方式中，所述细胞培养物的细胞是保藏编号为CCTCC NO：C200968的MDCK-HA细胞。

在另一个具体实施方式中，所述细胞培养物还含有适于所述细胞生长的培 养基。

在另一个具体实施方式中，所述培养基含有血清而不含有TPCK-胰酶。

本申请第三方面提供一种增殖A型流感病毒的方法，所述方法包括：

将A型流感病毒与本申请的细胞或细胞培养物在适于所述禽流感病毒增殖的条件下共同孵育。

在一个具体实施方式中，所述流感病毒为A型低致病力流感病毒。

在一个具体实施方式中，所述A型低致病力流感病毒为H1亚型、H3亚型、H4型、H9型或H10亚型。

在另一个具体实施方式中，所述细胞为保藏编号为CCTCC NO：C200968的MDCK-HA细胞。

在其它实施方式中，所述细胞培养物为含有保藏编号为CCTCC NO：C200968的MDCK-HA细胞的细胞培养物。进一步地，该细胞培养物还可含有适于该细胞生长的培养基。

本申请第四方面提供本申请所述的细胞或细胞培养物在增殖A型流感病毒中的用途。

在一个具体实施方式中，所述细胞为保藏编号为CCTCC NO：C200968的MDCK-HA细胞。

在其它实施方式中，所述细胞培养物为含有保藏编号为CCTCC NO：C200968的MDCK-HA细胞的细胞培养物。

在一个具体实施方式中，所述流感病毒是A型低致病力流感病毒。

本申请还提供一种制备稳定地表达高致病力禽流感病毒HA基因的细胞系的方法，该方法包括：

(1)提供含有抗性基因和高致病力禽流感病毒HA基因的逆转录病毒样颗粒；

(2)用该逆转录病毒样颗粒转化细胞；和

(3)在含有抗生素的培养基中筛选能够存活的细胞；

其中，能够稳定表达高致病力禽流感HA蛋白的细胞为本发明的细胞。

附图说明

图1显示pMX-HA重组质粒结构图。

图2表达H5HA的细胞系的免疫荧光图。其中，左图为表达H5HA的细胞系的荧光图，而右图为对照细胞。

图3显示MDCK-HA细胞系Western blot鉴定。其中，M：蛋白预染Marker；1：正常MDCK的总蛋白；2：MDCK-HA细胞的总蛋白。

图4显示PCR检测MDCK-HA细胞系中的HA的转录。其中M：DNAMarker；1：MDCK-HA细胞的总RNA反转录的cDNA为模板扩增HA片段。

图5显示H9N2病毒增殖结果。

图6A-6D分别显示使用本发明的MDCK-HA细胞系进行A型低致病力流感病毒增殖实验所得到的结果。其中，图6A显示的是Pr8的增殖结果；图6B显示的是H3N1病毒的增殖结果；图6C显示的是H4N6的增殖结果；图6D显示的是H10N8的增殖结果。

具体实施方式

本申请第一方面提供一种稳定表达高致病力禽流感病毒HA蛋白的细胞。

细胞可以是MDCK细胞，也可以是CEF细胞，或者是任何易于被禽流感病毒感染的细胞，包括动物细胞和人细胞。

所述细胞经含有禽流感病毒HA基因的逆转录病毒样颗粒转化，能稳定地表达禽流感病毒HA蛋白于其细胞膜上。

在一个具体实施例中，该细胞仅表达禽流感病毒的HA蛋白，而不表达禽流感病毒的其它蛋白或成分。

在其它具体实施例中，该细胞以表达禽流感病毒的HA蛋白为主，也可以表达禽流感病毒的其它蛋白或成分。

表达于本申请细胞上的HA蛋白包括本领域所公认的任何高致病力禽流感病毒的HA蛋白，包括但不限于H5亚型和H7亚型的HA蛋白。

本申请的HA蛋白也包括其类似物或突变蛋白，或其片段。术语“类似物”和“突变蛋白”指参照分子的生物活性衍生物，或这些衍生物保留所需活性(如在本文所述的测定中的免疫反应性)的片段。通常，术语“类似物”指具有天然多肽序列和结构，以及相对于天然分子的一个或多个氨基酸添加、取代(通常性 质保守)和/或缺失的化合物，只要修饰不破坏免疫原性的活性。术语“突变蛋白”指具有一种或多种肽模拟物(“类肽”)的肽，如国际出版物号WO91/04282中所述的。优选类似物或突变蛋白至少具有与天然分子相同的活性或功能。制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域已知的。

特别优选的类似物包括性质上保守的取代，即这些取代发生在与它们的侧链有关的一类氨基酸中。具体而言，氨基酸一般被分成四类：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测：单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸，这样的取代将不会对生物活性有重要影响。例如，感兴趣的多肽可包括多达约5-10个保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多达约15-25个保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之间任何整数，只要该分子的所需功能仍维持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图，容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。

在一个具体实施例中，所述HA蛋白由NCBI accession No NC_007362所示的核苷酸序列所编码。

流感病毒可以是高致病力的禽流感病毒，例如H5亚型和H7亚型。可将高致病力的禽流感病毒的HA基因重组入本发明的细胞中。

所述HA基因可以是现有已知的任何高致病力的禽流感病毒的HA基因，也包括其变异体，只要该变异体编码的HA蛋白也仍然具有HA裂解位点，且仍具备野生型HA蛋白的各种所需功能或活性即可。

具体而言，本发明的HA可包括与H5亚型的HA基因(NCBI accession NoNC_007362)具有高度同源性的核苷酸序列。

“同源性”指两条多核苷酸或两条多肽部分之间的相似性百分数。两条DNA或两条多肽序列在确定的分子长度内，当序列显示有至少约50％，优选至少约为75％、更佳至少约为80-85％、尤其佳至少约为90％、最佳至少约为 95-98％序列相似性时，彼此“基本上同源”。如本文所述，基本同源也指与特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。

通常，“相同性”指两条多核苷酸或多肽序列上准确的核苷酸对核苷酸或者氨基酸对氨基酸对应。通过排列两个分子的序列直接比较它们的序列信息，计算两条排列的序列间匹配的准确数量，将其除以最短序列的长度，然后乘以100，从而可得到相同性百分数。

在同源性和相同性分析中可辅助使用易于获得的计算机程序，如ALIGH、Dayhoff、M.O.(Atlas of Protein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff编辑，5Suppl.，3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC)，它适用于Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl.Math.，2：482-489，1981)。可从Wisconsin Sequence Analysis Package(第8版，从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)获得测定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。使用制造者建议的和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可使用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gap penalty)测定的核苷酸序列与参比序列的同源性百分数。

本发明建立同源性百分数的另一方法是使用版权属于爱丁堡大学、由JohnF.Collins和Shane S.Sturrok开发、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发行的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在这套程序包中使用，其中，在计分表中使用默认参数(例如，间隔开放罚分＝12，间隔延伸罚分＝1，间隔＝6)。从这批数据产生的“匹配”值反映出“序列同源性”。计算序列间的相同性百分数或相似性百分数的其它合适的程序在本领域中一般都是已知的，例如，另一种排列程序是BLAST，使用默认参数。例如，可使用下述默认参数的BLASTN和BLASTP：基因编码＝标准；过滤＝无；链＝两；截留＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGH SCORE；数据库＝无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。在http://www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST网址上可查到这些程序的详细描述。

或者，在同源区域之间形成稳定的双链的条件下进行多核苷酸杂交，接着用单链特异性核酸酶消化，然后测定消化的片段的大小，从而测出同源性。在如(对具体的体系所定义的)严格条件下进行的Southern杂交试验中，可鉴别基本同源的DNA序列。确定适当的杂交条件在本领域熟练技术人员所掌握的知识之内。例如，参见Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic AcidHybridization，同上。

本领域技术人员将理解，可采用本领域公认的各种高致病力禽流感病毒的HA基因来构建本发明的重组质粒，并用该重组质粒转化细胞。

可以按照常规的方法构建含有禽流感病毒HA基因的重组质粒。除HA基因外，该重组质粒还可含有诸如操作性连接于HA基因的启动子等控制元件。

“操作性连接”指元件的排列，其中所述成分被排成一定的形状，以便执行它们所需的功能。因而，可操作性连接于编码序列的给定的启动子，在正确的转录因子等存在时，能使该编码序列有效表达。该启动子不需要与该编码序列邻接，只要它起到指导该序列表达的功能即可。因此，例如不参与翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，与可转录的内含子一样；并且仍可认为该启动子序列“操作性连接”于该编码序列。

“控制元件”指帮助与其连接的编码序列表达的多核苷酸序列。该术语包括启动子、转录终止序列、上游调节结构域、聚腺苷酸化信号、非翻译区域(包括5′-UTR和3′-UTR)，适当时还有前导序列和增强子，这些序列共同地为宿主细胞中的编码序列的转录和翻译创造条件。

“启动子”在本文中指能结合宿主细胞中的RNA聚合酶并启动与之操作性连接的下游(3′方向)编码序列的转录的DNA调节区域。用于本发明的启动子序列包括以高于背景值的可检测的水平启动感兴趣的基因的转录所需的最小数量的碱基或元件。在该启动子序列中有转录启始位点以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核细胞启动子常常(但不总是)含有“TATA”框和“CAT”框。

可用于本发明的真核启动子包括CMV、SV40、survivin等，其中优选的真核启动子为CMV。

控制序列在RNA聚合酶结合启动子序列时“指导转录”细胞中的编码序 列，并将该编码序列转录成mRNA，之后该mRNA被翻译成由该编码序列编码的多肽。

在一个具体的实施方式中，用于本发明的启动子可以是CMV-立即启动子。

重组质粒中还可含有其它各种常规的成分，例如抗性基因，这可由本领域技术人员根据实际的需要作出选择。

在一个具体实施例中，本发明的重组质粒含有CMV_立即启动子；CMV正向引物；5’非编码区末端(主要是用于调控逆转录病毒颗粒的形成)；NotI和XhoI限制性内切酶切位点；抗嘌呤霉素基因；和插入的目的片段，如高致病力禽流感病毒的HA基因。

“转化”在本文中指将外源多核苷酸插入宿主细胞中，而不考虑插入的方法：例如，通过直接摄取、转染、感染等的转化。该外源多核苷酸可以被整合到宿主基因组中。本文中，转化的方法是常规的，可使用市场上可购得的各种转化试剂来实施本发明的转化。

可直接用本发明的重组质粒转化本发明的细胞，例如MDCK细胞和CEF细胞。也可先用本发明的重组质粒与其它质粒共同转化诸如293T细胞之类的细胞产生逆转录病毒样颗粒，然后再将所得的逆转录病毒样颗粒与MDCK细胞等共孵育。例如，转化293T细胞时，还可将所述其它质粒包括PMDSV(VSVG)、MDSV(gag/pol)、NF-κB，这些质粒在转化进入293T细胞后，会形成一病毒样颗粒，该病毒样颗粒包裹本发明的HA基因及真核启动子，然后被293T细胞分泌到细胞外。通过将所述分泌到胞外的逆转录病毒样颗粒与MDCK细胞等共孵育时，所述的病毒粒子可感染MDCK细胞而将本发明的HA基因及真核启动子带入MDCK细胞中，并可整合入MDCK细胞的基因组中。

可通过使转化的MDCK细胞在含有抗生素的培养基中进行筛选，其中只有能够稳定表达HA蛋白的MDCK细胞才能够在该培养基中存活和生长。培养基可以是任何常规的适用于孵育MDCK或CEF细胞的培养基，其中加有相应的抗生素。

可将所获得的细胞继续传代培养，以获得稳定地表达HA蛋白的转化的细胞。

可采用各种现有方法检测所得的细胞是否稳定地表达HA蛋白，包括但不 限于本申请具体实施例所述的间接免疫荧光法鉴定、Western blot鉴定和RT-PCR鉴定等等。

本申请因此也提供一种制备稳定地表达高致病力禽流感病毒HA基因的细胞系的方法，该方法包括：

(1)提供含有抗性基因和高致病力禽流感病毒HA基因的逆转录病毒样颗粒；

(2)用该逆转录病毒样颗粒转化细胞；和

(3)在含有抗生素的培养基中筛选能够存活的细胞；

其中，能够稳定表达HA蛋白的细胞为本发明的细胞。

在一个具体实施方式中，所述逆转录病毒样颗粒通过以下方法制备：

提供含有抗性基因和高致病力禽流感病毒HA基因的重组质粒，用该重组质粒感染宿主细胞，例如293T细胞，并在适于逆转录病毒样颗粒产生的条件下培育该宿主细胞，和从细胞培养物上清中收集该逆转录病毒样颗粒。

该重组质粒较佳含有真核启动子，例如CMV-立即启动子。

采用此方法，本发明人已获得了一株稳定表达高致病力禽流感病毒HA蛋白的MDCK细胞，该细胞已于2010年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山中国武汉大学，430072)，保藏编号是CCTCC NO：C200968。

本发明还包括本发明细胞的培养物，该培养物中含有本发明的细胞，和任选的适于该细胞生长、繁殖的培养基。例如，所述培养基可以是DMEM，其添加有3-8重量％的新生牛血清和3-8μg/ml嘌呤霉素。在一个具体实施方式中，所述新生牛血清的含量为4-6重量％，更优选为5重量％。在一个具体实施例中，所述嘌呤霉素的浓度可以为4-6μg/ml，更优选为5μg/ml。在一个优选实施例中，所述DMEM添加有5重量％的新生牛血清和5μg/ml的嘌呤霉素。

另一方面，本发明还提供一种增殖A型流感病毒的方法，该方法包括：将流感病毒与本发明的细胞或细胞培养物在适于所述流感病毒增殖的条件下共同孵育。

较佳的是，将低致病力的禽流感病毒与本发明的细胞或细胞培养物共同孵育。所述低致病力禽流感病毒包括现有已知的H1亚型、H3亚型、H4亚型、 H9亚型和H10亚型等。

在优选的实施例中，所述增殖A型流感病毒的方法不需要添加TPCK-胰酶。更进一步的，所述方法可含有血清。具体而言，本申请的增殖A型流感病毒的方法可使用含有血清但未添加TPCK-胰酶的培养基。

在一具体实施例中，A型低致病力流感病毒在MDCK-HA细胞中培养条件如下：MDCK-HA细胞培养于不含TPCK-胰酶且含3-8重量％血清的培养液；用10²-10⁵、更佳10³TCID₅₀的低致病力禽流感病毒感染10⁴-10⁷个、更佳10⁵-10⁶个MDCK细胞，培养于37℃且含5％CO₂的CO₂培养箱中。所述的血清含量可以为例如4-6重量％，更优选为5重量％。

本发明的实施除非另外说明，将使用本领域技术人员已知的化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，如《基础免疫学》(Fundamental Virology)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；《实验免疫学手册》(Handbook of ExperimentalImmunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，Blackwell ScientificPublications)；T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins：Structuresand Molecular properties)(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers，Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)，第二版，1989；《酶学方法》(Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)。

以下将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，下述实施例仅仅是阐述性的，而非限制性的。实施例中所使用到的试剂，除非利用说明，否则为市场上可购得的常规试剂。

实施例1：建立稳定表达HA蛋白的MDCK细胞系

1.构建重组质粒pMX-HA

以HA基因(NCBI accession No NC_007362)为模板，加入灭菌双蒸水19.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP Mix(10mmol/L)1μl，10umol/L上游引物(序列为：GCGGCCGCAAAATGGAGAAAATAGTGC(SEQ ID NO：1)，下划线 部分为NotI酶切位点)1μl，10μmol/L下游引物(序列为： CTCGAGTTAAATGCAAATTCTGCATTG(SEQ ID NO：2)，下划线部分为XhoI酶切位点)1μl，Taq Plus DNA聚合酶(TAKARA)0.5ul，混匀，进入PCR反应。PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃保温10min。

PCR产物经试剂盒(Axygen公司)纯化回收后，经NotI和xhoI双酶切后亚克隆到相同限制性内切酶酶切的pMX载体[Onishi，M.，et al.1996.Exp.Hematol.24：324-329]，转化E.coli JM109感受态细胞(TAKARA)，涂布含100g/ml氨苄青霉素的LB平板，挑取抗性菌落扩大培养并抽提质粒。质粒经过PCR、酶切鉴定后，并送上海博尚生物技术有限公司测序验证。构建成功的重组质粒命名为pMX-HA(如图1所示)。

2.转染293T细胞

按照说明书，用试剂盒(OMEGA)进行超纯质粒PMDSV(VSVG)、MDSV(gag/pol)、NF-KB[Onishi，M.，et al.1996.Exp.Hematol.24：324-329]、pMX-HA抽提并进行电泳检测，最后用Nanodrop 2000c紫外可见光分光光度计测量OD260、OD280，计算DNA含量与纯度。

将上述超纯度抽提的PMDSV(VSVG)、PMDSV(gag/pol)、NF-κB及pMX-HA质粒，借助于脂质体2000转染入293T细胞中。转染6h后，弃去细胞上清，加入OPTI-MEM(Invitrogen)，细胞放于37℃的CO₂培养箱中培养。

3.建立稳定表达H5HA蛋白的MDCK细胞系(MDCK-HA细胞系)

将上述转染后的293T细胞上清与MDCK细胞在37℃含5％CO₂的培养箱内孵育培养，感染24h后，弃去细胞上清，用PBS洗两次，然后用胰酶消化制备成单个细胞悬液，接种于细胞培养皿中，在5％CO₂的37℃培养箱中培养。每隔3天换一次液，加入含5％新生牛血清(NCS)和5ug/ml嘌呤霉素的DMEM培养液。15天后，用小管圈住细胞群落并加入胰酶消化成单个细胞悬液，吸出细胞培养于24孔细胞培养板。待8天后，继续上述操作克隆细胞两次。最后，克隆好的细胞系，传十代后进行验证工作。

由此所获得的细胞系已于2010年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山中国武汉大学，430072)，保藏编号是CCTCC NO：C200968。

实施例2：细胞系的验证

1.间接免疫荧光法鉴定

待MDCK-HA细胞长至60％时，用PBS清洗细胞。细胞在-20℃下，用丙酮和甲醇的混合液中渗透和固定，接着用PBS清洗。细胞用PBS-M-T(含5％脱脂奶粉、0.05％Tween-20、0.1％Triton X-100)，37℃孵育90min。用200μL含0.25％Tween-20的PBST清洗3次，每次3min。分别加入用含5％脱脂奶粉、0.05％Tween 20的PBS(PBS-M-T)稀释的H5HA多克隆抗体(或可使用市售获得的H5HA抗体，例如Influenza A Hemagglutinin H5(Avian H5N1)mAb(www.antibodies-online.com/terms.htm，Germany)，置37℃下孵育1h。清洗同上。加入PBS-M-T稀释50μL FITC-羊抗鼠IgG(KPL，1∶200)，37℃下温育1h，清洗同上。最后，用倒置荧光显微镜(OLYMPUS)观察结果并拍照记录，具体参见图2。实验结果发现HA蛋白丰富地表达于MDCK-HA细胞浆及细胞膜上，但未能表达于正常的MDCK细胞。

2.Western blot鉴定

克隆化细胞系MDCK-HA取1-2×10⁷细胞，用冰预冷的PBS洗涤2次后，加入100μl RIPA裂解液(1％Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、150mM NaCl、10mMTris-HCl[pH 7.4]、10mM EDTA、0.1％SDS)，冰浴5min，12,000×g离心10min后收集上清。经12％SDS-PAGE上进行分离后，电转印至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜经5％脱脂奶粉封闭后，分别与小鼠抗H5HA多克隆抗体(或可使用市售获得的H5HA抗体，例如Influenza A Hemagglutinin H5(Avian H5N1)mAb(www.antibodies-online.com/terms.htm，Germany)，37℃孵育1h，再经PBST洗涤后，与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 37℃孵育1h，最后经AEC显色。设置正常的MDCK细胞总蛋白为阴性对照。Western blot结果如图3所示，MDCK-HA细胞系能表达H5HA蛋白，而正常MDCK全细胞的裂解总蛋白中 未能检测到H5HA蛋白的表达。

3.RT-PCR鉴定

3.1抽提总RNA

培养适当数量的MDCK细胞和MDCK-HA细胞，加入Trizol溶液(Invitrogen)裂解，室温放置5min；加200μl氯仿，用力摇动15s，室温放置2-3min；10,000×g，4℃，离心15min；取上层水相至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min；12,000×g，4℃，离心10min，弃上清，75％乙醇漂洗2次；风干，适量RNase-free水溶解RNA。

3.2RT-PCR

采用Reverse Transcription System kit反转录试剂盒(TAKARA)合成cDNA。取5μL抽提的MDCK-HA细胞总RNA、1μL 12bp保守的特异性引物(AGCAAAAGCAGG(SEQ ID NO：3))、6μL灭菌RNase-free水混合均匀，于70℃作用5min，迅速放冰上，稍离心。加入反转录反应液(含5×反应缓冲液4μL，RNase抑制剂1μL，10mM dNTP mix 2μL)，37℃温浴5min，然后加入1μL M-MuLV-RNase混匀，42℃温浴60min，70℃10min灭活反转录酶。

以合成的cDNA为模板，如实施案例1PCR扩增H5HA基因。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图4所示，MDCK-HA细胞系能够扩增出1.7Kb的特异性条带。

实施例3：MDCK-HA细胞系感染H9N2亚型禽流感病毒

将生长旺盛的MDCK细胞转到24孔板上，待其长至适当浓度时用于病毒感染实验。将合适感染量的低致病力H9N2亚型禽流感病毒与MDCK-HA细胞孵育，每个样品重复三次，接毒后观察细胞病变，并于接毒后24h、48h、72h、96h时检测细胞培养上清的血凝效价。同时，设立正常MDCK细胞系感染H9N2亚型禽流感病毒为对照。实验结果表明，H9N2亚型禽流感病毒能在不含TPCK-Trypsin的培养基中的MDCK-HA细胞上生长良好，而在正常MDCK细 胞上却无法检测到血凝性(图5)。

与此同时，按上述方法还监测了H1亚型(如PR8)、H3亚型、H4亚型及H10亚型A型流感病毒在MDCK-HA细胞系上的生长情况，结果见图6A-6D。结果表明这些病毒皆生长良好，而在正常MDCK上却无法测到血凝价。

上述实例仅仅是阐述性的，而非限制性的。本发明的范围将由权利要求书限定。本领域技术人员将理解，在不偏离本申请的精神和范围的情况下，可对本发明作出各种修改和变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

序列表

<110>李泽君

<120>稳定表达高致病性流感病毒HA蛋白的MDCK细胞系及其用途

<130>096707

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

gcggccgcaa aatggagaaa atagtgc    27

<210>2

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<223>引物

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

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