苯酞酰亚胺类似物及其在制备治疗糖尿病性黄斑水肿药物中的应用

摘要

本发明提供应用一种苯酞酰亚胺类似物及其在制备防治糖尿病黄斑水肿相关失明药物中的应用。此外，本专利提出通过聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米颗粒包裹用于延长苯酞酰亚胺类似物的药效。最后，本专利披露一种合成(2，6-二异丙苯基)-5-氨基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮(化合物4，CLT-003)的新方法。

说明书

【相关申请参照】

本发明已于2009年7月24日申请美国专利，申请号为12/509,369。现以优先权申请中国专利。

【联邦支助的研究】

本研究由美国国立眼科研究所基金资助(NIH EY016627-01，EY017229-02，及EY017229-03)

【背景技术】

沙利度胺是一种有效的抗血管生成药，它和苯酞酰亚胺被批准用于治疗多发性骨髓瘤及麻风结节性红斑。有研究发现，它们可以阻断STZ糖尿病大鼠房水中的VEGF的增加以及抑制视网膜毛细血管基底膜的增厚，因而有望成为有效治疗糖尿病性视网膜病变，包括糖尿病性黄斑水肿的潜在药物。

另外，一种合成(2，6-二异丙苯基)-5-氨基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮(化合物4，CLT-003)的新方法在本申请中公开披露。

【申请概要】

本专利提供苯酞酰亚胺类似物在制备防治糖尿病黄斑水肿相关失明药物中的应用。此外，本专利提出通过聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米颗粒包裹用于延长苯酞酰亚胺类似物给药的药效。最后，本专利披露一种合成(2，6-二异丙苯基)-5-氨基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮(化合物4，CLT-003)的新方法。

本专利申请公开了一种治疗视网膜水肿的药物，该药物为苯酞酰亚胺类似物，含以下化学结构：

本专利申请公开了一种治疗视网膜水肿的药物成分，该药物成分包括一种含以下化学结构的化合物：

该化合物包裹于聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米颗粒。

本专利申请公开了一种能延长药物成分的药效的方法，该药物成分中包括含有如下化学结构的化合物：

即将该化合物包裹于聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米颗粒。该包裹胶囊能持续释放有效的化合物以延长对糖尿病性黄斑水肿的治疗作用。

本专利申请公开了一种合成含如下化学结构的化合物的方法：

此方法为：通过在乙酸中回流使4-硝基苯二甲酸酐与2，6-二异丙基苯胺配对缩合，生成(2，6-二异丙苯基)-5-硝基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮；再将其通过催化氢化或转化氢化加氢。

【图面说明】

本发明的上述特点和资料将通过结合以下的说明和附图更加明了，附图以数字的方式标示：

图1为表格显示沙利度胺及其苯酞酰亚胺类似物对细胞增殖的影响。

图2显示化合物1、化合物4和沙利度胺对内皮细胞(HUVEC)迁移的抑制作用。

图3显示化合物4对管状形成的影响。

图4显示化合物4在CAM实验中对血管形成的影响。

图5显示苯酞酰亚胺类似物对HIF-1α表达的影响。

图6显示化合物4下调VEGF表达。

图7显示沙利度胺、化合物1、2、4对OIR大鼠视网膜血管渗漏的影响。

图8显示沙利度胺、化合物1、2、4对STZ-糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的影响。

图9显示一次玻璃体内注射沙利度胺、化合物1、4后OIR大鼠视网膜血管造影的情况。

图10显示OIR模型中大鼠血管渗透性的种属差异。

图11显示STZ-糖尿病模型中血管渗透性的种属差异。

图12显示OIR BN和SD大鼠的VEGF水平

图13显示STZ诱导的BN和SD糖尿病大鼠视网膜VEGF水平。

图14为表格显示化合物4在CAM实验中对血管形成的影响。

图15为表格显示化合物4对大鼠眼A波和B波的影响。

图16显示化合物4人工合成的路线图。

图17显示沙利度胺及苯酞酰亚胺类似物的化学结构。

图18显示化合物4处理后大鼠视网膜功能与形态学的分析。

图19显示化合物4对HIF-1α激活的影响。

图20显示化合物4对ARPE-19细胞VEGF及可溶性ICAM-1表达的影响。

图21显示化合物4对OIR大鼠视网膜VEGF及ICAM-1表达的影响。

图22显示化合物4对OIR和STZ-糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的影响。

图23显示口服化合物4对STZ-糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的影响。

图24显示化合物4PLGA纳米颗粒的电子显微镜扫描图。

图25显示化合物4PLGA纳米颗粒动态光散射分析

图26显示化合物4纳米颗粒对STZ-糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的影响。

图27显示化合物4纳米颗粒及未经包裹的化合物4对BRCEC生长的抑制作用。

【详细说明】

在下述所披露实例的详细说明中，附图供参照，其中注明相似部分，展示现已公开的图解的实例。这些实例已详尽描述，以便于本技术领域的技术人员实施，必需清楚的是，可能会用到其他实例，且在现披露的范围内可能有逻辑学、机械力学、电子学、功能学及其他的改变。所以，只是用来解释本发明，而绝非对本发明的限制。正如在现披露中所说，术语“或”应该理解定义为逻辑学的可选项，而并非指惟一的选项，除非特意标出了“抑或”。

上述或他处所用的术语、首字缩略词或缩写意为：AMD：老年性黄斑变性；bFGF：碱性纤维母细胞生长因子；BN：Brown-Norway；BRCEC：牛视网膜内皮细胞；BSA：牛血清白蛋白；CAM：绒毛尿囊膜；化合物4(CLT-003)：(2，6-二异丙苯基)-5-氨基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮；化合物1：(2，6-二异丙苯基)-5-羟基-1H-异吲哚-1，3-二酮；化合物2：(2，6-二异丙苯基)-1H-异吲哚-1，3-二酮；DME：糖尿病性黄斑水肿；DR：糖尿病性视网膜病变；DMSO：二甲基亚砜；EPO：促红细胞生成素；ERG：视网膜电流图；HIF-1：缺氧诱导因子-1；HUVEC：人脐静脉内皮细胞；IGF-1：胰岛素样生长因子；NV：新生血管形成；OIR：氧诱导性视网膜病变；PEG：聚乙烯乙二醇；PET：聚乙烯对苯二酸盐；ROP：早产儿视网膜病变；RPE：视网膜色素上皮；SD：sprague-Dawley；STZ：链脲佐菌素；VEGF：血管内皮生长因子；VEGFR：血管内皮生长因子受体。

术语“血管生成”指新生血管长入组织或器官。

术语“视网膜血管渗漏”指视网膜血管渗透性升高。

“疗效量”在本文中定义为：在参照中使用能够产生理想效果的治疗剂量，该剂量符合合理的收益/风险比，并适用于任何医学治疗。有效剂量可能会随诸多因素的影响而改变，如受治疗的疾病或病情、接受治疗的病人的特殊体质及其体形的大小、疾病或病情的严重性等。对于所用的特定化合物的有效剂量，本领域技术人员可以根据经验而无需过多的试验就能确定。

在本领域中所使用的术语“治疗”一词包括抑制或阻止疾病、失调或病态的发展，消除或缓解之。疾病或病态的治疗包含至少改善特定疾病或病态的一种症状，即使其潜在的病理生理并无改变，例如：通过给予镇痛剂来治疗患者的疼痛，即使该镇痛剂并未治疗引起疼痛的病因。

糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病的一种常见微血管并发症，且仍是严重视力缺失和失明的主要因素。视网膜-血屏障的破坏所致的视网膜血管渗漏是DR的一个早期且常见的病理变化。一般认为，在DR早期视网膜血管渗漏的增加发生于临床视网膜病变之前。视网膜血管渗漏常导致糖尿病性黄斑水肿，后者是糖尿病患者视力丧失的首要原因。

糖尿病性黄斑水肿以视网膜Henle’s层与内核层中的细胞外液积聚为特征，在DR发展的任何阶段皆可发生。目前对DR的治疗，包括激光光凝和玻璃体切除，可阻止视力丢失，但对大部分DR患者的视力无改善。由于缺乏早期且适当的治疗，DR仍然是工业化国家中视力丧失和失明的主要原因。因此，有需要研发DR/糖尿病性黄斑水肿的新疗法。

小分子化合物4(CLT-003)已显示治疗糖尿病性黄斑水肿有效。研究资料证实，化合物4具有抗血管生成和抗炎活性。在人视网膜色素上皮细胞及氧诱导的视网膜病变(OIR)大鼠视网膜，化合物4可减弱缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的激活，使血管内皮生长因子(VEGF)和细胞间粘附分子(ICAM-1)表达下调。化合物4还显著降低OIR及STZ诱导糖尿病大鼠的视网膜血管渗漏。此外，一次玻璃体内注射化合物4聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒，其对减少STZ-糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的长期效果至少持续六周。这些发现提示，该单体分子有多重功效，具有巨大潜力成为治疗黄斑水肿的新药，特别是糖尿病性黄斑水肿。

这些新近发现的化合物有一个或多个非对称碳原子，它们以光学纯对映体、光学纯非对映结构体、对映体混合物、非对映体混合物或外消旋立体异构体混合物的形式存在。这些新发现的化合物包括所有这些同分异构体及其混合物。

这些新发现的化合物都是与苯酞酰亚胺类似物相关的化合物，具有抗血管生成和抗血管渗漏的活性。更特别地说，这些发现的化合物归入苯酞酰亚胺类似物系列，其中的哌啶-2，6-二酮基即被2，6-二异苯丙基所取代。如下所示：

此外，所披露的新化合物有如下基本结构：

其中R₁选自羟基、氢和氨基。

以上、此处或他处所用的化合物，如化合物1中的R1为羟基，化合物2中的R1为氢，化合物4中的R1为氨基。各种化合物如下所示：

此外，具有抗血管生成和抗血管渗漏的新化合物有以下基本结构：

其中R₁可选自羟基、氢和氨基。

作为有效治疗糖尿病性黄斑水肿的药物，该化合物有以下结构：

此外，本发明公开了一种为制备治疗血管异常的药物。更特别地说，具体实例直接归入治疗新生血管形成和/或血管渗漏的药物。此化合物具有如下基本结构：

其中R₁选自羟基、氢和氨基。

该治疗虽然不完全包括，但特别针对视网膜血管异常性疾病，如糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、老年性黄斑变性、镰形细胞视网膜病变、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变及其他形式的由视网膜新生血管形成或视网膜血管渗漏引发的视网膜病变与疾病。在一具体实施例中，其治疗包括抑制VEGF和HIF-1α，后者是上调糖尿病性视网膜VEGF的主要转录因子。此外，苯酞酰亚胺类似物也可用作钠通道阻滞剂、钙通道阻滞剂、避孕药、抗炎药及抗癌药。

另一方面，苯酞酰亚胺类似物可通过用一个芳香族基取代戊二酰胺环的方法来合成。一具体实施方案为：通过用反应物4-硝基苯二甲酸酐和2，6-异丙基苯胺产生(2，6-二异丙苯基)-5-硝基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮，后者再加工合成化合物4。根据这一具体实施方案，4-硝基苯二甲酸酐和2，6-异丙基苯胺与醋酸回流3小时以产生(2，6-二异丙苯基)-5-硝基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮，后者进一步与氢气、披钯活性炭和乙醇回流2小时，形成化合物4。

结构活性关系研究表明，用一个芳香族基取代沙利度胺中的戊二酰胺环可生成具有活性的类似物。尤其是用2，6-异丙苯基取代戊二酰胺环，可产生抗血管生成及抗血管渗漏活性更强的类似物——化合物1、2和4。

用内皮细胞增殖实验进行体外药物筛选，证明这三种化合物——化合物1、2和4有很强的抗增殖活性，因为它们选择性地抑制HUVEC和BRCEC生长，其IC50＜3.3μM，这实际上比沙利度胺、现有的苯酞酰亚胺类似物Actimid(CC-4047)和Revimid(CC-5053)(IC₅₀＞100μM)均要低。此外，苯酞酰亚胺类似物并不抑制非内皮细胞的生长，例如周细胞(IC50＞32μM)，这说明它们对内皮细胞生长的抑制具有细胞类型的特异性，而不是非特异的细胞毒性。其中一种苯酞酰亚胺类似物—化合物4，对HUVEC与BRCEC的增殖(IC50≤2.08μM)、对HUVEC的迁移(IC50 of＜1μM)、对HUVEC的管状形成，以及对CAM试验中的血管形成(ED50＝6.5μg/胚)，均有很强的作用。化合物4的抗血管生成作用在OIR模型中也得到证实，后者是视网膜新生血管形成和增殖性糖尿病视网膜病变的一个普遍接受的模型。

沙利度胺和新型苯酞酰亚胺类似物对视网膜血管渗漏及NV的影响已在OIR和STZ-糖尿病大鼠中进行比较。因为STZ-糖尿病大鼠出现包括血管渗漏的背景性糖尿病视网膜病变，该大鼠已成为一个广为应用的实验性糖尿病模型。OIR模型也出现异常的视网膜血管渗漏。实验结果表明，在两种动物模型中，新的苯酞酰亚胺类似物对视网膜血管渗漏的作用明显强于沙利度胺。

在OIR大鼠中以溶剂作对照进行比较，化合物4与沙利度胺以1.0μg/眼的单剂给药，可以使视网膜血管渗漏分别降低40％和18％。在STZ-诱导糖尿病大鼠中以溶剂作对照进行比较，化合物4、沙利度胺、化合物1以1.0μg/眼的单剂给药，它们分别使视网膜血管渗漏降低100％，77％和61％。一次注射24、48小时后，化合物4能完全阻断糖尿病诱发的视网膜血管渗漏。化合物4降低视网膜血管渗漏的作用呈剂量依赖性。结果表明，与沙利度胺相比，化合物4不仅在OIR模型中而且在STZ-糖尿病模型中都显示它对视网膜血管渗漏的降低有更强的作用。

化合物4对OIR大鼠视网膜VEGF表达的调节作用也已研究，结果显示，化合物4下调VEGF的表达，说明化合物4的靶点为VEGF信号通路。

实验显示，化合物4可抑制HUVEC和BRCEC的增殖，但并不抑制非内皮细胞，说明其影响是内皮细胞特异性的。选用化合物4来评估大鼠潜在眼毒性。ERG和组织病理学检查都证实，化合物4在一次高剂量注射后，并未引起大鼠眼组织形态和功能的明显改变。结果提示，化合物4在产生抗血管生成和抗血管渗漏作用所需有效剂量下并无明显毒性。

这些实验显示，低剂量的化合物4即可抑制NV及抗血管渗漏。化合物4更强的抗血管生成和抗血管渗漏作用说明，低剂量的化合物4足以抑制NV和抗血管渗漏，所以不太可能引起副作用。

糖尿病肾病的蛋白尿是血管渗漏的另一种类型。鉴于化合物4能减少大分子渗漏至血管外，因此亦可用它制备治疗蛋白尿的药物。血管渗漏是肿瘤转移过程中重要的一步。阻断肿瘤血管渗漏也有望在治疗实体性肿瘤中取得疗效。

根据实例，化合物4可减少HIF-1α的激活，并下调VEGF和ICAM-1的表达。此外，一次玻璃体内注射和口服化合物4均可减低视网膜血管渗漏，提示化合物4对治疗糖尿病性黄斑水肿有治疗潜能。最后，给予纳米颗粒介导的化合物4持久减少糖尿病大鼠视网膜血管渗漏。

药物或营养品成分

此外，药物或营养成分包括所披露的化合物，以及附加的活性剂、载体、溶剂，赋形剂或辅助剂等，本领域的技术人员通过阅读现披露的信息便可辨识这些成分。

药物或营养成分最好至少包含一种可药用的载体。在这些药物成分中，此次披露的一个或多个化合物组成“活性化合物”，亦称之为“活性剂”。上述“可药用的载体”包括溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等，符合医药管理的要求。附加活性化合物也可纳入药物成分中。药物成分制剂与预定给药途径相宜。给药途径包括：注射用药，如静脉注射、皮内注射、皮下注射、口服(如吸入)、经皮吸收(表面)、经黏膜和直肠给药。注射、皮内或皮下给药的溶液或混悬液包括下列成分：无菌稀释液如注射用水、盐水、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙烯乙二醇或其他合成溶液；抗菌剂如苯甲基乙醇、甲基对羟苯甲酸酯；抗氧化剂如抗坏血酸(维生素C)、重亚硫酸钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐缓冲液，还有增强剂如氯化钠、右旋糖酐。药物给药途径亦可经眼，包括：玻璃体内、结膜下、前房、巩膜表层、眼球后、视锥下或视网膜下注射，或经表面滴眼。PH值可用酸或碱调整，例如盐酸或氢氧化钠。注射制剂可封装在安瓿、一次性管或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

此处所用实验对象指人类和非人类灵长目动物(如大猩猩、恒河猴、短尾猴、绒猴)、家畜(如羊、牛、马、驴、猪)、陪护动物(如狗、猫)、实验室试验用动物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、野外捕获动物(如狐狸、鹿)以及任何其他可得益于现披露药物的生物体。不管对象是人类还是非人类生物体，都可将它看作患者、个体、动物、宿主或受体。

适合用于注射的药物成分包括无菌水溶液或分散剂，以及供临时准备无菌注射液或混悬液用的无菌粉末。静脉注射的适合载体包括生理盐水、无菌水、聚氧乙烯蓖麻油(BASF，帕西帕尼，新泽西州)或磷酸盐缓冲液(PBS)。总之，药物成分必须无菌和流动性好易于用注射器抽吸。在生产和储存时应稳定，保存时应防止细菌和真菌等微生物的污染。载体可为溶剂或分散剂，包括水、乙醇、多羟基化合物(如甘油、丙烯乙二醇、液态聚乙烯乙二醇及类似物)及其合适混合物。为维持适当的流动性，可使用包被如卵磷脂，在分散剂中保持所需颗粒大小以及使用表面活性剂。预防微生物的污染可通过各种抗生素和抗真菌药，如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸(维生素C)、硫汞撒以及类似物。在许多情况下，药物成分中最好包含等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。延长注射药物的吸收可通过在成分中添加延迟吸收的药物来达到，例如单硬脂酸铝和明胶。

无菌注射溶液可通过在合适的溶剂中将所需剂量的活性化合物与单一或组合上述原料混合，然后按需要无菌滤过。总的来说，分散剂是通过将活性化合物混合入无菌载体，后者内含基本的分散介质和所需的其他上述原料。对于无菌注射溶液备用的无菌粉末，准备方法有真空干燥和冰冻干燥，这样就从先前无菌滤过溶液中产出活性原料以及其他理想原料的粉末。

口服药一般包含惰性稀释剂或可食用载体。对于口服给药，活性化合物可与赋形剂混合，以片剂，含片或胶囊(如明胶胶囊)的形式服用。口服药也可用液态载体来制备，用作漱口剂。药物兼容连接剂或佐剂可作为药中成分。片剂、药丸，胶囊，含片和类似物可包含任何以下原料或同类化合物：连接物如微晶纤维素、黄芪胶或明胶，赋形剂如淀粉或乳糖，分裂剂如褐藻酸、羟甲基淀粉钠或玉米淀粉，润滑剂如硬脂酸镁或硅胶，助流剂如二氧化硅胶，甜味剂如蔗糖或糖精，或者调味剂如薄荷、木精水杨酸盐或橙味剂。

对于吸入给药，化合物以按压容器、内含适当的推进物如二氧化碳的分配器或喷雾器中的气雾剂的形式给药。

全身系统给药也可经黏膜或经皮。对于经黏膜或经皮给药，制剂中使用适合于屏障渗透的渗透剂。这种渗透剂在本领域中很普及，例如，经黏膜给药包括去污剂、胆汁盐、褐霉酸衍生物。经黏膜给药可用鼻喷雾剂或栓剂。对于经皮给药，活性化合物制成软膏、油膏，凝胶剂或乳剂，这是本领域熟知的。化合物也可制成栓剂(如用可可油及其他甘油酯等常规栓剂基质)或以保留灌肠的形式经直肠给药。

除其他给药方式外，化合物还可经滴眼或眼内注射给药。对于滴眼药，新药的成分包含一种或多种适用于眼或鼻表面的赋形剂。赋形剂常用在眼表的药物成分中，如溶液或喷雾剂，包括但不限于：张度剂、保存剂、螯合剂、缓冲剂、表面活性剂和抗氧化剂。合适的张度调剂剂包括：甘露醇、氯化钠、甘油、山梨醇及类似物。合适的防腐剂包括：对羟苯甲酸酯、氯化苯甲烃铵、苯镀溴胺、聚季铵盐-1及类似物。合适的螯合剂包括：乙二胺四乙酸钠、及类似物。合适的缓冲剂有：磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐及类似物。合适的表面活性剂包括：离子型和非离子型表面活性剂，非离子型的更好，如聚山梨酸酯、聚蓖麻油衍生物、氧化辛基酚甲醛聚合物(泰洛沙伯)。合适的抗氧化剂包括：亚硫酸盐、抗坏血酸盐，BHA和BHT。新药的配方中可包含一种另外的活性剂。除了附加的防腐剂(如聚季铵盐-1)，新药中除聚乙烯吡咯烷酮或聚苯乙烯磺酸外，不宜包含其他任何聚合物。

当新药中含有聚乙烯吡咯烷酮时，聚乙烯吡咯烷酮可减少过氧化物的含量。新批次的聚乙烯吡咯烷酮好于旧批次。此外，特别的是，当成分中含有大于0.5％的聚乙烯吡咯烷酮时，聚乙烯吡咯烷酮在与奥洛他定混合前应先加热(如加热至室温以上)，以减少聚乙烯吡咯烷酮原料中的过氧化物，并将过氧化物对奥洛他定的化学稳定性的影响降到最小。长时间加热聚乙烯吡咯烷酮水溶液可显著降低过氧化物的含量，但会导致聚乙烯吡咯烷酮溶液变色(黄色或棕黄色)。为减少过氧化物而又不使聚乙烯吡咯烷酮变色，聚乙烯吡咯烷酮溶液的PH值在加热前应调至pH11～13。如果聚乙烯吡咯烷酮溶液的PH值升高的话，短时间的加热即可使过氧化物水平显著降低。

一种恰当加热聚乙烯吡咯烷酮溶液的方式如下：首先，将聚乙烯吡咯烷酮溶于纯水中配成4-6％的溶液，再将PH值调至pH11～13(有效的PH值范围是11-11.5)，在60-121℃范围内加热，65-80℃较理想，最好是70-75℃。持续高温加热30-120分钟(最好是30分钟)。然后冷却至室温，依据奥洛他定的目标PH值，加HC1把pH值调至3.5～8。

对于滴眼药的成分，最好包含一种足够剂量的张度调节剂以产生眼科学认可的渗透压(大致为150-450m0sm，最好是250-350m0sm)。新眼药的pH值应为4～8，6.5～7.5比较好，最好是6.8～7.2。

新滴眼药最好装在不透明塑料容器中。盛装眼药比较好的容器是低密度聚乙烯瓶，后者用氧化乙烯而非伽马射线消毒。

对于眼部注射用药，药物根据治疗的需要可以经结膜下给药。结膜下给药至眼的一个比较好的方法为采用含此处所披露药物成分的可注射制剂。另一个较好的方法是植入缓释剂。

经结膜下注射的药物成分，根据具体情况而定，其眼药贮库制剂包含一种活性剂。眼药贮库制剂包含重要的纯化活性剂微粒如苯酞酰亚胺类似物，这里的化合物4正是如此。此微粒组分可包埋于生物相容性好的可接受的聚合物或脂质中成胶囊制剂。贮库制剂在一个较长期的时间内可按适度的速度释放药物。如果有聚合物或脂质囊的话，在释放完所有的活性剂后，可充分降解并从注射部位排出。贮库制剂可为液态，包含可药用的聚合物、溶解或分散的活性剂。注射后，聚合物可在注射部位经过凝胶化或沉淀形成药物贮库。

眼内植入的固体物质也可设计成包裹于聚合物的形式，且可生物降解或非生物降解。含有新药的准备眼内植入的生物降解聚合物有：无限制的脂肪聚酯如聚乙交酯、聚丙交酯、聚戊-己交酯、聚羟基丁酸酯和聚羟基戊酸、聚氨基酸、多正酯类、聚酐类、脂肪聚碳酸酯、聚醚内酯。举例说明适合应用的非生物降解聚合物为硅胶。

根据执行要求，活性化合物用保护其免受机体快速消除的载体制备，例如控释剂，有植入性和微胶囊给药技术。可用生物降解的、非生物降解的聚合物，如乙烯乙酸、聚酐类、聚羟基酸、胶原蛋白、多正酯类和聚乳酸。制备这些控释剂的方法对于本领域中人员来说轻而易举。这些原材料亦能通过商业获得，如可从Alza公司和Nova医药公司买到。脂质悬液(包括与针对感染细胞含细胞特异抗原的单克隆抗体的脂质)也可用作可药用的载体。这些皆可由本领域熟知该方法的技师来制备，如编号为4,522,811的美国专利所述，后者亦纳入参照。

为达到方便给药且剂量均一，最好将口服及肠外给药的剂量单位化。此处所指的剂量单位化是指个体差异的单位，适用于受治对象的单一剂量；每个单位包含已算好的活性化合物的预计量，与所需药物载体共同产生理想的治疗效果。

这些化合物的毒性和治疗效果取决于细胞培养或实验动物的标准药物程程，如决定LD50(半数致死量)和ED50(半数有效量)。毒性和治疗效果的剂量之比为治疗指数，可用LD50/ED50表示。高治疗指数的化合物显示药物有效。显示毒副作用的化合物也可使用，但需注意设计一个给药系统，后者可将化合物带至所需部位，使其对正常细胞的潜在损害最小，从而减少副作用。

从细胞培养试验和动物实验中获得的数据可用于制定供人体使用该化合物的剂量范围。化合物的剂量最好在循环浓度范围之内，后者包括伴随少毒或无毒的ED50。剂量可在此范围内变动，取决于所用的剂型和给药途径。对于所披露的任何化合物，可先用细胞培养实验估计治疗有效剂量。达到循环血液浓度范围的剂量可像细胞培养制定的那样，通过动物模型来制定，后者包括IC₅₀(半抑制率)。这些信息可用来更精确地确定在人体中使用的有效剂量。血药浓度可用高效液相色谱法测定。

此处定义的活性化合物的有效治疗量(如有效剂量)可在0.001到100g/kg体重的范围内变动，或技师们无需进行试验即能领悟到的其他范围。技师们普遍认同，许多因素会影响患者得到有效治疗所需的药物剂量与时间，包括但不限于：疾病或病情的严重性、先前的治疗、总体健康状况或患者年龄以及其他已患疾病。

【具体实施方式】

通过下面的实施例和图表，能够对新发现的药物得到一个更加完整的理解。所用的实施例和图表其目的仅是为了更好地说明问题，而不是有意用于限制本发明的保护范围。当环境改变时，外形或同等替代物的变化是可以预期的。尽管此处用到了专业术语，但这些术语仅作解释而非限制之用。对上文中披露信息的修改和变动并不脱离本发明的宗旨以及所涉及的范围，所以这些限制会在附加声明中强调。

实施例1：材料和方法

细胞培养：除非有其他说明，所有细胞培养液和辅助物质皆购自Cellgro公司。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获取，在EBM-MV2(Clonetics公司)培养液中培养。牛视网膜内皮细胞(BREC)和周细胞用前人所述的方法分离(Wong，et al.Investig.Opthalmol.Vis.Sci.1987，28：1767-1775)。从当地屠宰场(国家本土肉场)获取12只牛眼，取出视网膜，在DMEM中洗4次。然后视网膜被匀浆并在400xg离心10分钟。收集沉淀的组织颗粒并悬浮于分离液(DMEM加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和250ng/ml两性霉素)中。用85μm的尼龙网(Locker Wire Weavers有限公司)收集微血管，然后转移到含10ml混合酶的皮氏培养皿中，在37℃中孵育20分钟，混合酶中含600μg/ml DNase I(Sigma)、165μg/ml胶原酶(Sigma)和700μg/ml链霉蛋白酶E(EMD)。血管碎片再用53μm的尼龙网收集(Locker Wire Weavers有限公司)，在分离液中清洗，400xg离心5分钟。对于周细胞的筛选培养，将血管碎片悬浮于10ml周细胞生长培养液，并转移至75-cm²塑料组织培养瓶中(BDBiosciences)培养。对于BRCECs的筛选培养，将血管碎片悬浮于10mlBRCEC生长培养液，然后转移到75-cm²预先用胶原包被的塑料组织培养瓶(BD Biosciences)中培养。BRCEC生长培养液由DMEM添加10％人血清、1％谷氨酸盐、1mg/ml胰岛素、550μg/ml转移液、670ng/ml硒、100 IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、250ng/ml两性霉素、90μg/ml肝素(Sigma)及15μg/ml内皮细胞生长辅助物质(Upstate)组成。细胞在37℃、5％CO2中培养，每3天换培养液。用0.25％胰蛋白酶消化细胞，以1∶3进行细胞传代。BRCECs和周细胞的纯度分别用Dil-Ac-LDL(Biomedical Technologies Inc)与LDL受体在BRCECs表面结合、抗平滑肌抗体(Sigma)免疫标记检测。第二代BRCECs和周细胞储存于液氮罐中备用。

MTT实验：以每孔5x10⁴个细胞将细胞接种于24孔板(Nalge Nunc)或预先用明胶包被的24孔板，每组三孔，每孔生长培养液为400μl。24小时后，生长培养液由含1％FBS、有或无不同浓度的沙利度胺或苯酞酰亚胺类似物的培养液取代。处理48到72小时后，将MTT加入，其终浓度为0.5mg/毫升培养液，于37℃、5％CO2中孵育4小时。然后加入等容量的裂解缓冲液，按照生产商推荐的操作程序(Roche Molecular Biochemicals)，细胞在37℃、5％CO2中孵育过夜。在波长570nm下测定甲臌产物(Formazen product)的吸收值，以750nm作为扣除的参照波长。

内皮细胞迁移实验：荧光染色内皮细胞迁移试验使用BD Matrigel^TM和BDFalcon^TM HTS FluoroBlok^TM(BD Biosciences)24-多孔插入系统(图2A)。该插入系统由荧光阻滞3μmPET膜组成，后者可以阻断490-700nm波长的光传播，密封于多孔插入板中。这使得可通过荧光计直接检测经Matrigel迁移到插入板底部的细胞荧光信号。在这个实验系统中，在VEGF(4ng/ml)与不同浓度(0.01-100μM)的化合物1、4及沙利度胺作用下，HUVECs沙利度胺迁移至底部，对照组中不含VEGF。细胞迁移时间为22±1小时。迁移后用钙黄绿素AM(4μg/ml)标记细胞，用Applied Biosystems4000板计数器于485nm激发光波长和530nm发射光波长下检测通过BD Matrigel^TM基质迁移的细胞荧光。

鸡绒毛尿囊膜(CAM)法：将受精的来亨鸡蛋在37.5℃湿润环境下孵育10天。将人VEGF-165和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)(各200ng)加入微生物试验皿中至饱和，在鸡蛋顶端表层破一个小洞，将前者置于CAM上。待同一个微生物试验皿中VEGF/bFGF达到饱和8小时后加抗血管生成化合物，胚体再继续孵育40小时。取出CAM，立即用4％多聚甲醛PBS液固定，置于Petri培养皿中，用Nikon解剖显微镜和Scion照相系统以7.5倍进行数码拍照。然后把1x1-cm的格子放在CAM数码照片上，计数5-7格内的血管平均值作为血管分布量。

氧诱导性视网膜病变(OIR)的诱发：OIR的诱发在Smith等人描述(Smith，et al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1994，35：101-111)的基础上作了部分改进。简言之，新生的BN大鼠(Charles River实验室)在出生后7天(P7)暴露在高氧(75％)环境中5天(P7-12)，然后返回正常氧(室内空气)环境中，从而诱导视网膜病变。

链脲霉素(STZ)诱发糖尿病：禁食过夜后，BN大鼠(8周龄)给予一次腹腔注射新鲜配制的链脲霉素(STZ)(Sigma，50mg/此，溶于10mM柠檬酸盐缓冲液中，pH 4.5)。对照大鼠接受一次柠檬酸盐缓冲液注射。STZ注射24小时后测量血糖水平，往后1周1次，血糖水平高于350mg/dl视为糖尿病大鼠。持续2周高血糖的大鼠用于实验。

玻璃体内注射化合物：沙利度胺和苯酞酰亚胺类似物化合物1、2、4稀释于BN大鼠血清，过滤除菌。OIR和STZ-糖尿病大鼠右眼玻璃体内注射0.5-2.0μg/眼(5μl/眼，0.1-0.4mg/ml BN大鼠血清)的沙利度胺、化合物1、2或化合物4左眼玻璃体内注射等量的BN大鼠血清。

高分子量视网膜荧光血管造影：在视网膜血管造影中使用右旋糖酐高分子量荧光素，如Smith等所述(Smith，et al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1994，35：101-111)。简述如下：用氯胺酮(100mg/kg体重)加乙酰丙嗪(5mg/kg体重)将动物麻醉，然后经左心室灌注溶于PBS中的50mg/ml的高分子量荧光素。标记眼睛，定位、剜出眼球，用4％多聚甲醛PBS液固定3-24小时。做数个切口，然后把视网膜平放在明胶包被玻片上。在荧光显微镜下检查血管系统。全视网膜区域和无血管区域都用电脑图像分析系统检测，并计算每组平均值。

血管渗透性的测量：血管渗透性通过测量从血管进入视网膜的异硫氰酸荧光素-白蛋白或伊文思蓝(Evans蓝)染料-白蛋白化合物来定量，该法在前人所述(Xu，et al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2001，42：789-794)的基础上作了部分改进。简述如下：将异硫氰酸荧光素-白蛋白经股静脉注入，循环2小时。然后经左心室行灌注。小心取出视网膜并将其匀浆。用荧光计测量异硫氰酸荧光素-白蛋白浓度，以每个视网膜中的总蛋白浓度和血清异硫氰酸荧光素-白蛋白浓度做标准化处理。

将伊文思蓝染料(Sigma公司)溶于0.9％的盐水(30mg/ml)，超声振荡5分钟，然后用0.45-μm的滤过器(Millipore)滤过。麻醉大鼠，在显微镜观察下用毛细玻璃管经股静脉注入伊文思蓝(30mg/kg)，注射时间10秒以上。伊文思蓝非共价结合于血流中的白蛋白。伊文思蓝注入后大鼠立即明显变蓝，证实染料已摄取并分散。将大鼠放在暖垫上2小时以确保染料完全循环。然后打开胸腔，经左心室给大鼠灌注1％多聚甲醛柠檬酸盐缓冲液，后者先在37℃中预热以防血管收缩。在120mmHg的生理压力下持续灌注10分钟，以清除血管中的染料。灌注后立即剜出眼球，在手术显微镜下小心取出视网膜。每个样本在150μl甲酰胺中、70℃下放置18小时，从而提取Evans蓝染料。提取物在70,000rpm(转子类型：TLA 100.3)、4℃下离心(Beckman)20分钟。取100μl的上清液用分光光度计DU800(Beckman)在620nm波长下测量吸收值，提取物中伊文思蓝的浓度计算是通过制定伊文思蓝在甲酰胺中的标准曲线和每个样本中的总蛋白浓度标准化得到的。结果以mg伊文思蓝/mg总蛋白量表示。

免疫标记：体外培养的细胞立即在4％多聚甲醛PBS液固定10分钟，用PBS洗三次，每次5分钟，然后用0.5％BSA封闭20分钟。一抗孵育1小时，一抗孵育后用PBS将细胞洗3次，然后用二抗着色1小时。通过将细胞与异硫氰酸荧光素或Texas红共轭二抗(Jackson Immunoresearch)一起孵育，免疫标记信号被显示。用PBS洗盖玻片，0.2μg/ml DAPI染色并封片。用Zeiss荧光显微镜或带氩-氪激光的Zeiss 510共焦激光扫描显微镜收集荧光图像。

蛋白质印迹法：用裂解液提取蛋白。来自不同样本的等量蛋白质通过SDS-PAGE分离，蛋白质印迹分析用抗VEGF抗体。免疫印迹信号通过SuperSignalWest Pico化学发光底物(Pierce)显色。

视网膜电流图(ERG)记录：全域ERG用Espion E2 ERG仪(Diagnosys LLC)记录，如前人所述(Rohrer，Journal of Neuroscience，1999，19：8919-8913)，有两种方法：(A)在暗适应和明适应下用10ms闪光的渐强光，和(B)在明适应下用2Hz闪烁光。BN大鼠分别接受玻璃体内注射化合物4(2.0μg/眼，5μl/眼，0.4mg/ml BN大鼠血清，)或等量BN大鼠血清。注射后不同时间从基线到原始负向电压测量a波振幅，从a波到正性b波峰顶的波谷测量b波振幅。通过先前至闪烁反应峰的波谷来测量闪烁振幅。数据以均数±标准差来表示，用配对t-检验比较用药眼和对照眼间的差异。

视网膜组织学检查：为测试化合物4潜在的眼毒性，8周龄BN大鼠分别玻璃体内内注射该化合物(2.0μg/眼，5μl/眼，4mg/ml BN大鼠血清)或等量BN大鼠血清。注射后于不同时间处死取材。取眼球并置于4％福尔马林液中固定，石蜡包埋，切片，切片包括整个视网膜，其厚度为6μm。切片经HE染色后进行检查。

设计、合成及实验检测了一系列新苯酞酰亚胺类似物。发现和实验结果如下：图16显示化合物4合成途径。1H-NMR(250MHz，CDCl3)δ1.08(12H，d，J＝6.80Hz)，2.50(2H，hept，J＝6.80Hz)，6.75(1H，dd，J＝1.98Hz，8.25Hz)，6.87(1H，d，J＝1.98Hz)，7.16(2H，d，J＝7.85Hz)，7.31(1H，t，J＝7.85Hz)，7.46(1H，d，J＝8.25Hz).mp 252-253oC(lit.253-254oC)。图17显示沙利度胺、actimid，revimid、化合物1，2，和4的不同化学结构。

实施例2：化合物4较沙利度胺及其另外两个类似物能更有效地抑制内皮细胞增殖。

原代内皮细胞(HUVEC和BRCEC)以不同浓度化合物处理3天。用MTT法定量检测细胞存活率，计算各个化合物的IC₅₀(均数±标准差，n＝3，见图1)。IC₅₀值代表三次独立的实验结果。化合物1，2，4抑制内皮细胞增殖，呈浓度依赖性，HUVEC中IC₅₀分别是3.3，3.0，2.0μM，BRCEC中则分别是1.94，3.56，1.83μM。沙利度胺抑制作用较三种新化合物弱，它在HUVEC和BRCEC中的IC₅₀分别为＞100μM和＞32μM(见图1)。现有的苯酞酰亚胺类似物、Actimid(CC-4047)和Revimid(CC-5013)，在HUVEC实验中抑制效果较弱，其IC₅₀＞100μM。同等条件下，这些新化合物未能明显抑制周细胞生长，显示它们对抑制内皮细胞生长具有特异性。以上结果显示，化合物4与它的另外两种类似物和沙利度胺相比具有较强的抗血管新生作用。

图1为表格比较沙利度胺和新的苯酞酰亚胺类似物对细胞增殖的作用。

实施例3：化合物4抑制HUVEC迁移的作用较沙利度胺强

化合物1，4和沙利度胺对内皮细胞迁移的作用通过体外细胞迁移(侵袭)法评估。该方法的优点在于可以改良用于高效筛选。该方法为以荧光为基础的内皮细胞迁移实验。应用BD Matrigel^TM和BD Falcon^TM FluoroBlok^TM(BDBiosciences，Bedford，MA)24孔细胞培养插入板系统(图2A)。该插入系统用可阻挡波长490-700nm的光线传播的3μm阻隔紫外线聚酯膜密封多孔插入板(图2A)。这样，利用荧光计底部读取模式就能直接测量从基质胶移至插入板底部的细胞发出的荧光信号。在该实验系统中，人内皮细胞可侵袭并被荧光染料钙黄绿素AM标记后用荧光计定量。如图2B所示，化合物1和4抑制内皮细胞迁移，呈浓度依赖性，对应的IC₅₀分别是1μM和＜1μM。而沙利度胺的IC₅₀则＞100μM。

图2比较了化合物1，4和沙利度胺对内皮细胞(HUVEC)迁移的抑制作用。图2A是内皮细胞侵袭检测系统的简单示意图。图2B，细胞种植密度为5×10⁴/插入板，在含0.1％BSA EBM-2液的多孔板中培养。该组合检测可持续6小时。用抑制迁移的百分比来表示与对照组(不含抑制剂组)的比较结果。数据代表三次实验的平均结果，每次实验重复三次。条形图代表均数±标准差。

实施例4：化合物4可抑制内皮细胞管状形成

将附有玻片的八孔板置于37℃、5％CO₂中，用基质胶包被30分钟。HUVEC以3×10⁴个细胞/孔的密度种植并在37℃、5％CO₂下孵育16小时，EGM-II培养液中含对照剂(0.5％DMSO)，5μM化合物4或沙利度胺。孵育后用PBS清洗培养板，100％甲醇固定10秒，DiffQuick II液染色2分钟。使用2.5倍物镜数码拍照，分析管状形成，如图3所示，管状形成实验的代表性定性图像表明，化合物4有抑制管状形成的作用。而沙利度胺无抑制作用。

图3显示化合物4对管状形成的影响。以溶剂，沙利度胺和化合物4处理内皮细胞16小时后收集代表性图像。结果显示化合物4有效抑制管状形成。

实施例5：绒毛尿囊膜(CAM)法显示化合物4与沙利度胺，化合物1和2相比对血管形成有较强的抑制作用

CAM实验常用于体内抗血管生成的研究。将已受精的来亨鸡蛋于37.5℃湿润环境下孵育10天。将人VEGF-165和bFGF(各200ng)加于微生物试验皿至饱和，在鸡蛋上方打一小孔并将该皿置于CAM上。VEGF/bFGF在微生物试验皿饱和8小时后，加入抗血管生成化合物，然后将胚胎孵育40小时。48小时后，取出CAM，立即用4％多聚甲醛PBS液固定，置于皮氏培养皿中，使用7.5倍Nikon解剖显微镜和Scion影像系统收集数码影像。将1×1cm方格放入数码CAM影像中，以5-7格内血管平均值作为血管分布的计数。图4显示分别经VEGF-165/bFGF和经VEGF/bFGF加化合物4处理48小时的CAM。VEGF/bFGF诱导CAM团状血管形成。化合物4在浓度达到5μg/胚胎时可抑制VEGF/bFGF诱导的血管形成，其ED₅₀为6.5μg/胚胎，而沙利度胺的ED₅₀则＞100μg/胚胎，提示在CAM实验中化合物4可抑制血管形成(图14)。

图4显示CAM实验中化合物4对血管形成的抑制作用。图4左图显示200ngVEGF-165/bFGF处理48小时的CAM，右图代表200ngVEGF-165/bFGF加5μg/胚胎化合物4处理的CAM。

图14为表格比较CAM实验中化合物4，沙利度胺和SU5416对血管生成的作用，剂量用“μg/胚胎”表示，ED₅₀表示可使血管生成减少至单纯VEGF/bFGF处理(血管数量相当于未加药处理的对照组)的一半。沙利度胺的ED₅₀＞100μg/胚胎，化合物4和SU5416的ED₅₀分别为6.5和7.8μg/胚胎。数据(均数±标准差)代表2-3次独立实验的8-16个样本。

实施例6：苯酞酰亚胺类似物在PC-3前列腺癌细胞中抑制缺氧诱导的HIF-1α的生成

用PC-3前列腺癌细胞检测化合物1，2和2ME2(阳性对照)对缺氧所诱导的HIF-1α表达的抑制作用。细胞用10μM抑制剂(含0.1％DMSO)处理过夜，以DMSO作为对照。用蛋白质印迹法分析经缺氧和化合物处理后PC-3前列腺癌细胞HIF-1α的表达(图5A)。化合物1和2均显著抑制缺氧所诱导的HIF-1α的表达，可达79-90％(图5B)。

图5显示苯酞酰亚胺类似物对HIF-1α表达的影响。用蛋白质印迹法分析经缺氧和化合物处理后PC-3前列腺癌细胞HIF-1α的表达(图5A)。定量分析表明化合物1和2均能抑制缺氧所诱导的HIF-1α表达(图5B)。

实施例7：化合物4下调OIR大鼠视网膜VEGF的表达

VEGF在糖尿病性黄斑水肿中起关键作用。HIF-1α可调节因缺氧引起的VEGF的转录激活。在体外实验中，所测试的苯酞酰亚胺类似物可显著抑制缺氧诱导的HIF-1α表达，提示这些化合物可能通过作用于VEGF信号通路而减少视网膜血管渗漏。为验证这一假设，检测经注射化合物4后OIR大鼠中VEGF的表达。在裂解液中孵育和超声粉碎后，提取正常大鼠、对照以及化合物4处理的OIR大鼠视网膜蛋白。每一样本含等量蛋白质并用SDS-PAGE分离，用VEGF抗体进行蛋白质印迹分析。免疫印迹信号通过SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce)显色。结果显示，经化合物4处理的OIR大鼠视网膜VEGF表达减少(图6)。

图6显示化合物4下调OIR大鼠视网膜VEGF表达。正常大鼠、对照以及化合物4处理的OIR大鼠视网膜VEGF水平用蛋白质印迹检测(图6A)。图6B显示VEGF表达的定量分析。图中标记“正常”代表正常BN大鼠，“对照”代表左眼玻璃体内注射5μl BN大鼠血清，“化合物4”代表右眼玻璃体内注射5μl化合物4(0.8mM，稀释于BN大鼠血清)。

实施例8：一次玻璃体内注射化合物4对OIR大鼠玻璃体内视网膜血管渗漏有较强的抑制作用

为诱导OIR，将出生后7天(P7)的BN大鼠暴露于高氧环境中5天(P7-P12)再转换到常氧状态下饲养。正常对照大鼠在室内空气中饲养。出生后14天，OIRBN大鼠行一次玻璃体内注射，右眼每眼分别注射5μl(浓度为0.8mM，稀释于BN大鼠血清)沙利度胺，化合物1，化合物2或化合物4，左眼注射等量的BN大鼠血清。视网膜血管渗漏的检测用异硫氰酸荧光素标记的白蛋白作为示踪剂。以出生后第16天(P16)正常非OIR大鼠(n＝6)作为基线水平对照。出生后第16天(P16)，与对侧注射稀释液的对照眼比较，沙利度胺处理眼视网膜血管渗漏降低至82％(配对t检验，P＜0.05，n＝6)。化合物4处理眼视网膜血管渗漏降低至61％(配对t检验，P＜0.05，n＝6)。而在相同浓度下，化合物1和2未能明显降低视网膜血管渗漏(图7A和7B)。荧光血管造影显示化合物4在所用剂量下对视网膜新生血管形成的抑制作用较弱(图9)，提示化合物4对减少视网膜血管渗漏的作用较之于对抑制视网膜新生血管形成的作用更强。

为确定化合物4对视网膜血管渗漏的影响是否呈剂量依赖性，P14的OIR大鼠分别接受一次注射0.5，0.75，1.0μg/眼的化合物4(5μl，浓度分别为0.10，0.15，0.20mg/ml)。化合物4和沙利度胺在剂量为0.75和1.0μg/眼时可显著降低血管渗漏(P＜0.05，n＝6)，而剂量为0.5μg/眼时则无明显作用(图7C和7D)，提示两者对OIR大鼠血管渗漏的作用呈剂量依赖性。

图7比较化合物1，2，4(化合物4)和沙利度胺对OIR大鼠视网膜血管渗漏的影响。图7A中，P14 OIR大鼠右眼玻璃体内分别注射5μl/眼(浓度为0.8mM，稀释于BN大鼠血清)沙利度胺，化合物1，2或4，左眼注射等量BN大鼠血清。血管渗漏用异硫氰酸荧光素标记的白蛋白渗漏方法于P16测量，视网膜蛋白量以单位fd/pr(均数±标准差，n＝6)表示。用t检验比较各实验眼与对侧对照眼的差异。P16正常非OIR大鼠视网膜血管渗漏作为P16的基线水平。图7B中，化合物注射眼中血管渗漏值以其与对侧稀释液对照眼平均血管渗漏值的百分比表示。稀释液处理的对照眼视网膜平均血管渗漏计为100％。沙利度胺和化合物4分别降低视网膜血管渗漏18％和40％(n＝6)。图7C和7D中，P14的OIR大鼠接受一次玻璃体内注射化合物4或沙利度胺的剂量如图所示。血管渗漏于P16测量，视网膜蛋白量以单位fd/pr(均数±标准差，n＝6)表示。用配对t检验比较实验组和对照组的差异。图中“正常”代表P16正常大鼠的血管渗漏水平。

实施例9：化合物4对STZ-糖尿病大鼠视网膜血管渗漏有较强的抑制作用

成年BN大鼠禁食一夜后注射STZ(50mg/kg，静脉注射)诱导糖尿病。注射后第二天以及以后每周一次监测血糖水平。血糖水平高于350mg/dl的大鼠为糖尿病大鼠并用于实验。糖尿病发病2周后，STZ-糖尿病大鼠右眼分别玻璃体内内注射沙利度胺，化合物1，2和4(5μl，浓度为0.8mM，稀释于BN大鼠血清)。注射后48小时，用伊文思蓝蛋白渗漏法检测视网膜血管渗漏。结果表明，与注射BN大鼠血清的对侧眼比较，沙利度胺、化合物1、2和4注射眼视网膜血管渗漏明显减少(P＜0.01，n＝6)(图8A)。沙利度胺将正常血管渗漏降低77％，化合物1为61％，而化合物4则达100％至正常水平(基线水平)(图8B)，表明化合物4可完全阻断视网膜血管渗漏。为确定化合物4玻璃体内注射后的时间效应，P14的ORI大鼠在给药后24h及48h右眼每眼注射5μl化合物(浓度为0.8mM，稀释于BN大鼠血清)，视网膜血管渗漏性检测表明，与对侧对照眼相比，化合物注射眼中血管渗漏完全被阻断。

为确定化合物4和沙利度胺对血管渗漏作用的量-效关系，STZ糖尿病大鼠接受玻璃体内注射化合物4和沙利度胺，剂量分别为每眼0.5，0.75和1.0μg(5μl/眼，浓度为0.10，0.15和0.20mg/ml)。与对照组比较，处理2天后，所有剂量的化合物4均显著降低视网膜血管渗漏(P＜0.05，n＝6)(图8C)。而沙利度胺只在剂量为0.75和1.0μg/眼时才有抑制作用，而0.5μg/眼时则无(P＜0.05，n＝6)(图8D)。该观察结果表明，化合物4不仅在OIR模型而且在实验性糖尿病模型中，较之于沙利度胺和其它化合物都有较强的降低视网膜血管渗漏的作用。

图8比较了化合物1、2、4对STZ糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的影响。图8A中，STZ诱导糖尿病两周后给糖尿病大鼠右眼每眼玻璃体内注射5μl(浓度为0.8mM，稀释于BN大鼠血清)沙利度胺，化合物1、2或4，左眼注射等量的BN大鼠血清作为对照。用伊文思蓝蛋白渗漏法检测视网膜血管渗漏。处理2天后，用视网膜蛋白总浓度和血中伊文思蓝浓度来标准化(均数±标准差，n＝6)。用t检验比较各实验眼与对侧对照眼的差异。非糖尿病大鼠血管渗漏作为血管渗漏的基线水平。“正常”代表正常大鼠的血管渗漏水平。图8B中，化合物注射眼的血管渗漏值以其占注射BN大鼠血清的对照眼血管渗漏值的百分比表示。沙利度胺、化合物1、和4分别使视网膜血管渗漏降低77％，61％和100％。图8C和8D中，糖尿病发病2周后，STZ糖尿病大鼠玻璃体内注射化合物的剂量如图所示。处理48h后检测血管渗漏，以每毫克视网膜蛋白中伊文思蓝的毫克数表示(均数±标准差，n＝6)。用t检验比较各实验眼与对侧对照眼的差异。“正常”代表正常大鼠的血管渗漏水平。

实施例10：化合物4对OIR大鼠视网膜新生血管形成有抑制作用。

新生BN大鼠于P7～P12暴露于75％高氧中，而后在室内空气中饲养4天以使视网膜新生血管部分生长。在P16 OIR大鼠视网膜新生血管部分形成时，右眼每眼玻璃体内一次注射1.0μg沙利度胺，化合物1、2或4(每眼5μl，0.2mg/ml，稀释于BN大鼠血清)，左眼注射稀释液(5μl BN大鼠血清)作为对照。在P20用视网膜铺片荧光血管造影评估视网膜新生血管形成。用荧光显微镜观察视网膜血管系统并与对侧对照眼比较(图9A)。视网膜切片观察新生血管情况(图9B)。结果显示，化合物4部分抑制OIR大鼠视网膜新生血管形成，而化合物1、2和沙利度胺均无明显抑制作用。

图9显示OIR大鼠玻璃体内一次注射沙利度胺和化合物后的视网膜血管造影。图9A中，OIR大鼠右眼分别玻璃体内注射5μl各化合物(浓度为0.8mM，稀释于BN大鼠血清)，左眼注射等量BN大鼠血清。P20时行荧光血管造影。图中血管造影代表每组的3只大鼠。需要注意的是，注射化合物4的大鼠新生血管形成较对照少，而沙利度胺和化合物1、2在所用剂量下未能减少新生血管形成。图9B中切片检查显示，注射化合物4的大鼠较之于注射溶剂对照处理的大鼠，其视网膜前新生血管形成减少。

实施例11：在OIR和STZ诱导糖尿病大鼠模型视网膜血管渗漏的种属差异。

已建立视网膜血管渗漏持续时间长的模型供检测新药的长期效果。在SD和BN大鼠OIR以及STZ糖尿病模型中视网膜血管渗漏的时程也已界定。将P7-P12的新生鼠暴露于高氧(75％O₂)以诱导OIR。成年BN大鼠接受STZ注射以诱导糖尿病。用伊文思蓝-白蛋白法检测视网膜血管渗漏。在OIR-BN大鼠中，血管渗漏自P12起增加，P16时达高峰，此时渗漏水平为同龄正常大鼠的8.7倍(P＝7.5E-06)。P18-P22期间，血管渗漏慢慢减少，P30后达正常水平(图10)。在OIR-SD大鼠中，血管渗漏增加较迟缓(P14)。峰值较BN大鼠低(2.2倍)，且P18时渗漏已降至正常水平(图10)。以上观察结果与两种种属间视网膜VEGF水平不同相关。在STZ-BN大鼠中，STZ注射24h后出现高渗漏性(1.4倍；P＝0.0292)，在2周时达平台期(1.8倍；P＝0.074)。高渗漏性在糖尿病诱导后至少持续16周。在STZ-SD大鼠中，注射STZ 3天后血管渗漏开始增加(1.3倍；P＝0.0271)，1周时达峰值(1.5倍；P＝0.004)，2周时降至对照水平(图11)。这些结果表明，在OIR以及STZ糖尿病模型中，BN大鼠较SD大鼠其血管渗漏更强且持续时间更久。因此，该项目研究中所有大鼠模型均选用BN大鼠。这些结果还表明，如该项目二期研究所述，OIR模型适于研究化合物4对视网膜血管渗漏的短期作用，而STZ糖尿病模型则适于对其长期效果的研究。

图10显示OIR模型中大鼠血管渗漏的种属差别。BN和SD大鼠进行高氧处理并检测其视网膜血管渗漏，以总蛋白浓度作标准化处理，以其所占同龄正常对照渗漏水平的百分比(均数±标准差，n＝4)来表示。显著高于对照水平者以*号标注。

图11显示STZ糖尿病大鼠模型中血管渗漏的种属差异。用BN和SD大鼠诱导糖尿病，在所述不同时间点检测视网膜血管渗漏。渗漏水平用总蛋白浓度标准化，以每毫克蛋白中伊文思蓝的微克数(均数±标准差，n＝4)表示。显著高于同龄正常对照水平者以*号标注。

实施例12：缺氧反应时BN大鼠视网膜VEGF水平较SD大鼠高。

为确定OIR BN大鼠其较严重的视网膜新生血管是否与视网膜VEGF高表达相关，用大鼠VEGF酶联免疫吸附测定试剂盒(R&D systems，Inc)定量检测VEGF水平，并用视网膜总蛋白浓度标准化。结果显示，正常BN和SD大鼠两者基础VEGF水平相似。OIR-SD大鼠视网膜VEGF水平与正常对照SD大鼠无显著性差异(图12)。而OIR-BN大鼠视网膜VEGF水平约为正常对照BN大鼠和OIR SD大鼠的10倍(P＜0.001，n＝4)(图12)。

图12显示OIR BN和SD大鼠的VEGF水平。视网膜VEGF水平用酶联免疫吸附测定检测，经视网膜蛋白标准化，以pg/mg表示(均数±标准差，n＝4)。显著高于同龄正常对照水平者以*标注(P＜0.001)。

实施例13：在STZ诱导的糖尿病模型中BN大鼠视网膜VEGF水平较SD大鼠高。

研究表明STZ诱导的BN糖尿病大鼠在类似的高血糖病情和病程下，其视网膜血管渗漏比STZ诱导的SD糖尿病大鼠更严重。为确定是否BN大鼠中糖尿病所致视网膜VEGF水平上调高于SD大鼠，在糖尿病发病后不同的时间点，BN和SD糖尿病大鼠视网膜VEGF水平用蛋白质印迹法行半定量分析，并与各自同龄非糖尿病大鼠比较。结果显示，BN和SD大鼠视网膜VEGF基础水平类似(图11)。然而随着STZ诱导糖尿病的发生，在病程的第3天到16周，BN糖尿病大鼠视网膜VEGF水平高于SD糖尿病大鼠(图13)。

这些观察表明，BN OIR或STZ-糖尿病大鼠视网膜适用于作为研究化合物4作用机理的体内模型，如研究其对VEGF过度表达的影响。

图13显示BN和SD STZ-糖尿病大鼠视网膜VEGF水平。在STZ注射3天以及1、2、4、8和16周后分离BN和SD糖尿病大鼠视网膜。等量的可溶性蛋白用VEGF特异性抗体标记。洗脱膜上的抗体，再用抗β-肌动蛋白抗体标记以对VEGF水平进行标准化。这些结果来自不同时间点收集的视网膜。

实施例14：化合物4未引起任何明显的大鼠眼毒性

为检测化合物4潜在的眼毒性，8周龄正常大鼠玻璃体内注射高剂量化合物4，每眼2μg(5μl/眼，浓度为0.4mg/ml，稀释于BN大鼠血清)或等量BN大鼠血清作为阴性对照。注射前及注射1、2、3、4周后，用ERG记录评估视功能。与BN大鼠血清注射眼比较，ERG检测显示化合物4注射眼未见a波、b波振幅的明显改变(图15和图18A-C)。

给药后4周，用病理组织学检查观察化合物4的潜在毒性。视网膜横切面切片，HE染色，光学显微镜下检查。与对侧BN大鼠血清注射眼视网膜比较，在2μg/眼剂量下，化合物4注射眼的视网膜(5μl/眼，浓度为0.4mg/ml)未见明显的形态学改变或免疫反应(图18D)。

图15为表格比较化合物4对大鼠眼a波、b波的影响。

图18显示化合物4处理后大鼠视网膜功能和形态学分析。8周龄BN大鼠玻璃体内分别注射化合物4(2μg/眼，5μl/眼，浓度为0.4mg/ml，稀释于BN大鼠血清)或等量BN大鼠血清(n＝6)。注射前以及注射1、2、3、4周后行ERG检查。数据显示，与注射稀释液作为对照的大鼠比较，注射化合物4的大鼠ERGa波、b波无显著改变(图18A-18C)。注射4周后处死大鼠，取眼球组织切片，HE染色，显微镜下观察。病理学检查显示，大鼠化合物4处理眼和对照眼视网膜比较无明显形态学改变(图18D)。

实施例15：化合物4减弱HIF-1α激活。

根据实例，图19的实验资料图示化合物4对HIF-1α激活的影响。用400μM氯化钴在有或无0.5、1或2μM化合物4的条件下孵育人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)16小时。使用免疫标记检测HIF-1α的核转运。HIF-1α被染成绿色，核被DAPI复染(蓝色)。标尺为10μM。

实施例16：化合物4降低视网膜色素上皮细胞VEGF和ICAM-1的表达

根据实例，图20的实验资料图示化合物4对ARPE-19细胞中VEGF和可溶性ICAM-1表达的影响。ARPE-19分别经氯化钴，氯化钴加化合物4，TNF-α，TNF-α加化合物4处理。处理18小时后收集无细胞条件培养液，用酶联免疫吸附测定检测VEGF和可溶性ICAM-1的水平。图20A显示对VEGF水平的影响；图20B显示对可溶性ICAM-1水平的影响。*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01，****p＜0.001，n＝3。

实施例17：化合物4下调OIR大鼠视网膜VEGF和ICAM-1的表达。

根据实例，图21的实验资料图示化合物4对OIR大鼠视网膜VEGF和ICAM-1表达的影响。为诱导OIR，BN大鼠于出生后7天(P7)暴露于高氧中(75％O₂)5天(P7-P12)，然后返回常氧下饲养。P14时OIR大鼠玻璃体内注射化合物4和它的稀释液。注射2天后，用酶联免疫吸附测定检测正常大鼠、稀释液以及化合物4处理的OIR大鼠视网膜VEGF和ICAM-1的水平。图21A显示化合物4对VEGF表达的影响；图21B显示化合物4对ICAM-1表达的影响。*P＜0.01，n＝5.

实施例18：一次玻璃体内注射化合物4即可抑制OIR和STZ-糖尿病大鼠视网膜血管渗漏

根据实例，图22的实验资料图示化合物4对OIR和STZ-糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的影响。图22A中，OIR大鼠于P14时右眼玻璃体内注射化合物4，左眼注射溶剂作对照。P16时用异硫氰酸荧光素-白蛋白渗漏法检测血管渗漏。化合物4在每眼注射0.75和1μg时抑制视网膜血管渗漏。图22B中，腹腔注射STZ(50mg/kg)诱导BN大鼠糖尿病。糖尿病发生2周后，糖尿病大鼠右眼玻璃体内注射化合物4、去炎松，左眼注射溶剂作为对照。注射后2周，用伊文思蓝渗漏法定量检测视网膜血管渗漏。所有被试剂量((0.5，0.75，and 1μg))的化合物4均使视网膜血管渗漏明显减少。特别是，1μg化合物4可使视网膜血管渗漏恢复至正常大鼠的基础水平。在同等剂量下，去炎松无效。*p＜0.05，n＝5。

实施例19：口服化合物4抑制STZ-糖尿病大鼠视网膜血管渗漏。

根据实例，图23的实验资料图示口服化合物4对STZ-糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的影响。STZ诱导糖尿病1周后，糖尿病大鼠灌食化合物4(每日一次，200mg/kg/天)7天；对照组糖尿病大鼠给予等量的溶剂(玉米油)。用伊文思蓝渗漏法检测视网膜血管渗漏。将化合物4处理组与对照组比较。*p＜0.05，n＝10。

实施例20：化合物4纳米颗粒的制备

根据实例，图24图示化合物4PLGA纳米颗粒的电镜扫描图像。化合物4PLGA纳米颗粒通过油包水乳液脱水法制备。将粘度在0.15～1.2dL/g的PLGA(含50，65，75，85％的乳酸)溶解于80％的二氯甲烷/20％二甲替甲酰胺，制成7％的溶液。分别以0～22mg/mL的浓度加入化合物4。然后以油∶水为1∶2的比例将PLGA化合物4溶液加入到1～5％的聚乙烯酸溶液中。将混合溶液在冰浴中以超声处理器(型号：VCX-750，1/2英寸探头)超声处理1分钟，振幅为30％。剧烈搅拌溶液过夜，使油蒸发。然后将纳米颗粒在15000g下离心两次，每次离心后用18兆欧的水清洗。最后将纳米颗粒用超声处理1分钟，使其在18兆欧水中重新悬浮。将纳米颗粒转移至1.7ml冷冻管中，在-80℃下冰冻过夜，然后冻干48小时。形成的颗粒呈圆滑球状。动态光散射分析法显示，所制备的纳米颗粒的平均流体动力学直径为239.1纳米，多分散指数为0.097(图25)。纳米颗粒中化合物4载药量在10～36％w/w之间。

实施例21：化合物4纳米颗粒对STZ诱导糖尿病大鼠视网膜血管渗漏有长效作用。

根据实例，图26图示化合物4纳米颗粒对STZ诱导糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的影响。图26A中，STZ诱导大鼠发生糖尿病2周后，糖尿病大鼠右眼玻璃体内注射化合物4纳米颗粒(载药量13％w/w；15、30、60g/眼，溶于PBS至3、6、12mg/ml，5ul/眼，分别相当于2g、4g、8g/眼化合物4)，左眼注射等量的PBS。注射2周后用伊文思蓝渗漏法检测视网膜血管渗漏，结果用视网膜总蛋白浓度和血中伊文思蓝浓度进行标准化(均数±标准差，n＝5)，以非糖尿病大鼠的血管渗漏作为基线水平。在每眼给予2、4、8g化合物4时，化合物4纳米颗粒抑制视网膜血管渗漏的作用呈剂量依赖性。图26B显示STZ糖尿病大鼠玻璃体内注射化合物4纳米颗粒(相当于8μg化合物4，2～4周，64μg化合物4，6周)的视网膜血管渗漏情况。分别于注射2，4和6周后用伊文思蓝渗漏法测定视网膜血管渗漏。每个实验组都配以相应的溶剂对照组。化合物4纳米颗粒对视网膜血管渗漏有长效的抑制作用，可持续6周(p＜0.05，n＝5)。

实施例22：化合物4纳米颗粒与未被包裹的化合物4对BRCEC生长的抑制作用

为研究化合物4纳米颗粒对内皮细胞生长的抑制作用，取24孔板于实验前24小时覆以明胶包被，将BRCEC接种于孔内，每组三孔。分别用不含药物的对照纳米颗粒或化合物4纳米颗粒(13％载药量)处理细胞，浓度分别为5、10、20、40和80μg/ml；以及用未包裹的化合物4处理细胞，浓度分别为2、4、8、16和32μM。在相对应的浓度组，每孔处理所用的化合物4纳米颗粒和未包裹的化合物4含有等量的化合物4。药物处理4小时后，换以不含纳米颗粒或化合物4的新鲜培养液。在药物处理1、3、5、7、9天后分别用MTT法定量计数活细胞数。结果显示，在40和80μg/ml的浓度下(分别相当于16和32μM化合物4)，化合物4纳米颗粒处理1天后显示对细胞增殖有显著的抑制作用，其抑制作用持续9天。在相同浓度下，对照纳米颗粒无任何抑制作用(数据未列出)。在浓度为8，16和32uM时，未包裹的化合物4处理1天后也对细胞生长有显著的抑制作用(n＝3，p＜0.05)，但细胞生长在药物处理3天后恢复生长(图27A)。以上结果表明，化合物4纳米颗粒对BRCEC的生长有显著而持续的抑制作用。

分别用对照纳米颗粒、化合物4纳米颗粒(13％w/w载药量)、和未包裹的化合物4处理BRCEC 4小时，在相对应的浓度组，每孔药物处理所用化合物4纳米颗粒和未包裹的化合物4所含化合物4的量相同。之后换新鲜培养液去除化合物。用MTT法在如图27A所示时间点定量测定活细胞数。如图27B所示，在浓度为8、16和32μM未包裹的化合物4处理1天后，细胞生长明显受到抑制(n＝3，p＜0.5)，但该抑制作用在3天后消失。而化合物4纳米颗粒(40和80μg/ml，分别相当于16和32μM化合物4)在所分析的所有时间点都显示了显著而持续的细胞生长抑制作用(n＝3，p＜0.5)。

实施例23：化合物4合成概况

如方案1所示，市售的4-硝基苯二甲酸酐(5)在乙酸中与2，6-二异丙基苯胺(6)发生偶联反应，生成(2，6-二异丙苯基)-5-硝基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮(7)，产出率为91％。中间产物(7)的硝基通过转移氢化反应被还原，生成纯度为99.2％的API(化合物4)，产出率为91％。

方案1

合成(2，6-二异丙苯基)-5-硝基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮的偶联反应已最优化，固体产物的产出率达91％，纯度大于99％(高效液相色谱法，a/a％)。并且，即使按比例扩大合成亦可得到一致的结果。已建立一种重结晶法用以纯化此中间产物。业已证明，当4-硝基苯二甲酸酐原料中含有3-硝基苯二甲酸酐时，该纯化方法可成功地除去该杂质。基于此，并无必要在使用前纯化4-硝基苯二甲酸酐。

通过催化氢化反应和转移氢化反应可以成功合成化合物4。催化氢化反应在45～50psi压力下进行，并需较长的反应时间(24小时)；该方法需专门设备。已证实在乙醇(标准酒精度为200)中加入10％的催化剂(加热)，转移氢化反应可在3小时完成。按比例扩大该反应可得到纯度为99.2％的产物，产出率为91％。预实验表明，在高温(70℃)下延长干燥时间(89小时)不会导致产物分解，且能成功地除去残余溶剂。

用乙醇/n-庚烷(1∶2)对化合物4重结晶，可成功得到纯度为100％的化合物，回收率为75％.

例24：通过化合物5和化合物6合成化合物7

方案2

根据实例，如方案2所示，将2，6-二异丙基苯胺(2.34mL，12.4mmol，1.2eq)加入4-硝基苯二甲酸酐(2.0g，10.4mmol)的乙酸(15mL)的混合物中。将反应混合物加热回流(形成溶液)，12小时后，将反应体系的温度缓慢降至室温。浓缩混浆至仅余残留物。加入甲醇(2×50mL)以除去乙酸。将残留物用乙酸乙酯/石油醚混合物结晶(1∶2，60mL)，过滤所获固形物，以石油醚(3～4mL)洗涤，风干后得到白色固体(2.43g，产出率66％)。质子核磁共振频谱证实了其结构。熔点168～169℃，(实际值：161～162℃)。

根据实例，如方案2所示，将2，6-二异丙基苯胺(2.34mL，12.4mmol，1.2eq)加入4-硝基苯二甲酸酐(2.0g，10.4mmol)的乙酸(15mL)的混合物中。将反应混合物加热回流(形成溶液)，12小时后，将反应体系的温度降到室温。通过过滤分离固体，并用3mLH₂O冲洗。将固体用乙酸乙酯/庚烷(1∶2，60mL)重结晶，得到2.23g白色粉末(产出率61％)。将滤液浓缩仅余残渣，加入甲醇(2×25mL)以去除乙酸。第二次加入甲醇时，将出现的固体通过过滤分离，用乙酸乙酯/庚烷(1∶2，3mL)重结晶，得到164mg白色固体。

根据实例，如方案2所示，将2，6-二异丙基苯胺(2.34mL，12.4mmol，1.2eq)加入4-硝基苯二甲酸酐(2.0g，10.4mmol)的乙醇(标准酒精度为200，40mL)的混合物中。将反应混合物加热回流(形成溶液)，12小时后，将反应体系的温度缓慢降至室温。薄板层析显示反应仅完成50％。将溶液重新加热回流，持续3小时后，未发现显著变化。将反应溶液温度降至室温。中间产物结晶后呈桔红色固体(0.93g，产出率25％)。

根据实例，如方案2所示，将2，6-二异丙基苯胺(9.4mL，49.72mmol，1.2eq)加入4-硝基苯二甲酸酐(工业级，纯度90％，8.0g，41.43mmol)的乙酸混合物中。反应体系加热至回流，形成溶液，12小时后，冷却至室温。将反应混合物浓缩至约原体积的一半。通过过滤收集固体并用8mL的甲醇冲洗。将得到的灰白色固体风干，得到13.2g(产出率90％，纯度99.7％，高效液相色谱法a/a％)。对反应中间产物取样(3.0g)并将其用乙酸乙酯/庚烷(1∶2，63mL)重结晶。通过过滤收集白色固体，得到2.17g纯化的中间产物(回收率72％，纯度99.9％，高效液相色谱法a/a％)。

根据实例，如方案2所示，将2，6-二异丙基苯胺(16.5g，93.2mmol，1.2eq)加入4-硝基苯二甲酸酐(15.0g，77.7mmo)的乙酸混合物(113mL)中。反应体系加热回流(形成溶液)，12小时后缓慢冷却至室温。将反应混合物浓缩约至原体积的一半。通过过滤收集固体并用15mL的甲醇冲洗。将得到的灰白色固体在真空环境，35℃下烘干至恒重，得到产物24.7g(产出率90％，纯度99.7％，高效液相色谱法，a/a％)。质子核磁共振波谱证实了其结构。

实施例25：通过化合物7合成化合物4的催化氢化反应

方案3

根据实例，如方案3所示，(2，6-二异丙苯基)-5-硝基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮(化合物7，1.0g，2.84mmol)和10％钯碳催化剂(10mg，1％(w/w))的乙酸乙酯(20mL)在8～9psi压力下进行氢化反应。用薄层层析法监测实验过程。2小时时添加催化剂(40mg，5％总量w/w)。氢化反应持续过夜。薄层层析(硅胶，λ＝254nm，庚烷∶乙酸乙酯为60∶40)显示两斑点混合，两斑点保留比相同，但紫外荧光不同。用硅藻土板过滤反应混合物，以乙醇(标准酒精度为200，2mL)冲洗滤板，然后将滤出液浓缩至仅余残留物。用乙醇(7mL)将残留物结晶，得到275mg黄色固体(产出率30％)。质子核磁共振光谱法和高效液相色谱法都证实其为两种化合物的混合物。

根据实例，如方案3所示，化合物7(0.5克)和10％钯碳催化剂(25mg，5％(w/w))的乙酸乙酯混合物(10mL)在8～9psi压力下进行氢化反应。2小时时用硅藻土板过滤反应混合物，以乙酸乙酯(3mL)冲洗滤板，然后将滤出液浓缩至仅余残留物。质子核磁共振色谱法显示，残留物为两种化合物的混合物(比例约为1∶1)。在新鲜催化剂(100mg)的乙酸乙酯(20mL)中进一步氢化此残留物(压力45psi)。氢化过夜后分离残留物，质子核磁共振色谱法显示第二个波峰显著减弱(支持产物转化)。

根据实例，如方案3所示，化合物7(1.0克)和10％钯碳催化剂(100mg，10％(w/w))的乙酸乙酯混合物(20mL)在45psi压力下进行氢化反应至23小时。用硅藻土板过滤反应混合物，以乙酸乙酯(6mL)冲洗滤板。将滤出液分为两等份，第一份浓缩至残留物，第二份以12当量浓度HCl处理后将溶液浓缩至残留物。质子核磁共振色谱下对比两份固体，经证实，两者分别为目的产物API和盐酸盐。

实施例25：通过化合物7合成化合物4--转移氢化反应。

根据实例，如方案3所示，在化合物7(1.0g，2.84mmol)和10％钯炭催化剂(0.5g，5％(w/w))的乙醇(标准酒精度为200，16mL)混合物中加入三乙胺(1.7mL，4.40eq)和甲酸(0.55g，4.22eq)。将混合液加热回流，以薄板层析监测反应过程。2小时时用硅藻土板过滤反应混合物，以乙醇(1.5ml)冲洗滤板2次。室温下搅拌混合物2小时，通过过滤分离固体，得到0.49克黄色荧光固体(产出率53％，纯度97.3％，高效液相色谱法a/a％)。质子核磁共振色谱法证实了其结构。重复过滤，得到第二批产物(0.11g，纯度与第一批同)

根据实例，如方案3所示，在化合物7(0.5g，1.42mmol)和10％钯炭催化剂(0.05g，10％(w/w))的乙醇(标准酒精度为200，8mL)混合物中加入三乙胺(0.9mL，4.40eq)和甲酸(0.2g，4.22eq)。反应在室温下进行(冷水浴)，以薄层层析法监测反应。40分钟时，将反应混合物通过硅藻土板过滤，并以乙醇(3×lmL)冲洗滤板。加入共溶剂并冷却滤液，但并未得到结晶。因此将滤液浓缩至仅余残留物，将后者从乙醇/庚烷(1∶2，6mL)中结晶。过滤提取固体，得到0.26克黄色固体(产出率56％，纯度99.2％，高效液相色谱法a/a％))。

根据实例，如方案3所示，在化合物7(1.0g，2.84mmol)和10％钯炭催化剂(0.5g，5％(w/w))的乙醇(标准酒精度为200，16mL)混合物中加入三乙胺(1.8mL，4.40eq)和甲酸(0.5g，4.22eq)。将混合液加热回流，以高效液相色谱法监测反应过程。3小时时用硅藻土板过滤反应混合物，以乙醇(标准酒精度为200，3×1ml)冲洗滤板。室温下搅拌混合物过夜。第二天将混合液冷却，0℃下搅拌1小时。过滤获得固体，在真空、35℃条件下将其干燥，得到488mg黄色固体(产出率53％，纯度99.6％)再次过滤获得第二批固体(138mg，纯度99.4％，高效液相色谱法a/a％)。

根据实例，如方案3所示，在化合物7(1.0g，2.84mmol)和10％钯炭催化剂(0.5g，5％(w/w))的乙醇(标准酒精度为200，16mL)混合物中加入三乙胺(1.8mL，4.40eq)和甲酸(0.5g，4.22eq)。在室温下搅拌反应混合物，以高效液相色谱法监控反应。3小时时用硅藻土板过滤反应混合物，以乙醇(标准酒精度为200，6×2ml)冲洗滤板(注：观察到一些产物在催化剂作用下结晶，故又追加清洗)。室温下搅拌混合物过夜。第二天将混合液冷却，于0℃搅拌1小时。过滤获得固体，在真空、35℃条件下将其干燥，得到327mg黄色固体(产出率36％，纯度99.7％)再次过滤获得第二批固体(154mg，纯度99.6％，高效液相色谱法a/a％)。

根据实例，如方案3所示，在化合物7(0.5g，1.42mmol)和10％钯炭催化剂(0.05g，10％(w/w))的乙醇(标准酒精度为200，8mL)混合物中加入三乙胺(0.9mL，4.40eq)和甲酸(0.2g，4.22eq)。在室温下搅拌反应混合物，以高效液相色谱法监测反应过程。2.5小时时用硅藻土板过滤反应混合物，以乙醇(标准酒度1×3mL)冲洗滤板。将滤液浓缩为油状物，以乙醇将其重结晶，得到247mg产物(产出率54％，纯度98.8％，高效液相色谱法a/a％))。

根据实例，如方案3所示，在化合物7(5.0g，14.19mmol)和10％钯炭催化剂(0.25g，5％(w/w))的乙醇(标准酒精度为200，80mL)混合物中加入三乙胺(6.32mL，4.40eq)。保持温度低于30℃，逐滴加入甲酸(2.76g，4.22eq)，整个过程不少于15分钟。加热混合液至回流，以高效液相色谱法监测。第二日补加催化剂(0.25克，两份)。当高效液相色谱证实反应完成时，以硅藻土板过滤反应混合物，以乙醇(标准酒精度为200，2×12.5mL)。向该溶液中添加水80mL。继续在室温下搅拌，持续2小时，然后在0℃下搅拌1小时。过滤分离固体并风干，得到橘黄色固体，即为粗制终产物(4.1克，产出率89％，纯度99.7％(a/a％))。质子核磁共振色谱证实了它的结构。

根据实例，粗制终产物用乙醇/水(1.6∶1，36mL)重结晶，得到暗黄色固体(1.3克，回收率65％，纯度100％(a/a％))。

根据实例，粗制终产物用乙醇/n-庚烷(1∶2，66mL)重结晶，得到浅黄色固体(1.5克，回收率75％，纯度100％(a/a％))。

实施例26：大规模合成化合物4

根据实例，5L三颈圆底烧瓶于氮气下配置完毕，加入4-硝基苯二甲酸酐(295.0g，1.53mol)，乙酸(2.21L，7.5mL/g)，和2，6-二异丙苯胺(326.2g，1.84mol，1.2eq)。混合液加热回流，持续12小时，然后缓慢冷却至室温过夜。将反应混合物浓缩至约原体积的一半(蒸馏法，去除约1.33kg)。冷却混合液至室温，过滤分离固体，用甲醇(3×100mL)冲洗。风干固体1～1.5小时，然后在真空、40℃条件下进一步干燥至恒重。产物(2，6-二异丙苯基)-5-硝基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮为灰白色固体(488.0g，产出率91％，纯度99.3％，高效液相色谱法a/a％))。质子核磁共振色谱法和¹³C核磁共振色谱法都证实了它的结构。熔点：167～169℃；元素分析：理论值：C(68.17，H(5.72)，N(7.95)；实测值：C(68.08)，H(5.77)，N(7.86)。

12L三颈圆底烧瓶于氮气下配备完毕，加入10％钯炭催化剂(24.5g，10％(w/w))的乙醇(标准酒精度为200，1L)混合液。向混合液中先后加入(2，6-二异丙苯基)-5-硝基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮(245.0g，0.70mol)、乙醇(标准酒精度为200，292L，共3.92L，16mL/g)和三乙胺(311.7g，3.08mol，4.40eq)。缓慢加入甲酸(135.8g，2.95mol，4.22eq)，时间不少于25分钟。混合液加热回流，以高效液相色谱法监测反应过程。经3.5小时，用硅藻土板过滤混合物以去除催化剂，以乙醇(标准酒精度为200，4×175mL)冲洗滤板。用Whatman滤纸去除滤液中所有微粒，使用乙醇(标准酒精度为200，2×150mL)作为洗剂。向溶液中加入去离子水3.92L，时间不少于45分钟。所得的混合液在室温下搅拌过夜。第二日冷却混合液至0～10℃，保持2小时。过滤分离固体，用预冷的(0～10℃)乙醇(标准酒精度为200，2×200mL)冲洗。在真空40℃下干燥固体至恒重。进程中质子核磁共振色谱显示有过量的乙醇存在，于是进行了一个小型试验以衡量在高温(70℃)下进一步干燥的效果。根据其结果(终产物未降解)，在真空、70℃条件下将固体进一步干燥至高效液相色谱法显示乙醇除尽，得到了黄色固体形态的(2，6-二异丙苯基)-5-氨基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮(206.0g，产出率91％，纯度99.2％，高效液相色谱法a/a％)，即化合物4。质子核磁共振色谱和13C核磁共振色谱证实了其结构。熔点：259～261℃；元素分析：理论值：C(74.51)，H(6.88)，N(8.69)；实测值：C(74.70)，H(6.86)，N(8.59)。

在此，对方法和试剂的描述都是依据现行被认为是最实用的实施例而进行的，但应认识到，信息披露并不仅限于这些公开的实施例。此处意在涵盖在所述权利要求的精神与范围之内的各种异构体及类似方法。所述权利要求的范围应被给予最广义的阐释以涵盖所有此类异构体及类似结构。