超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法

摘要

本发明提供了一种超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法。所述的组织蛋白酶B抑制剂是天然产物提取物或单体。本发明用超高效液相色谱和质谱联用的方法，用于分析天然产物提取物或单体对组织蛋白酶B体外抑制率以及组织蛋白酶催化活性。本发明将超高效液相色谱和质谱联用方法应用到酶抑制剂筛选中，样品检测快速、准确，线性方程相关系数达到0.997，质谱针对化合物质量电荷比进行检测，精确度高，特异性好，避免了光谱法筛选中的假阳性和假阴性结果，可用于组织蛋白酶B抑制剂的筛选，并且可用于组织蛋白酶B的动力学研究。

说明书

发明领域

本发明属于分析化学领域，涉及超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法，具体而言，涉及天然产物提取物或单体对组织蛋白酶B体外抑制率以及组织蛋白酶催化活性的超高效液相色谱和质谱联用的方法。

技术背景

组织蛋白酶B是溶酶体内半胱氨酸蛋白水解酶，属于木瓜蛋白酶家族，在pH值3.0～7.0都具有催化活性，其特异性底物为Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，组织蛋白酶B催化底物肽键断裂生成7-氨基-4-甲基香豆素。近年来研究表明组织蛋白酶B在肿瘤的发展中起作用的一类关键酶，组织蛋白酶B通过多种机制促进血管形成，从而促进肿瘤生长，同时降解基底膜主要成分以及激活胶原酶、尿激酶等其他蛋白酶发生协同作用使肿瘤易侵袭、转移和扩散，在肿瘤组织中还发现组织蛋白酶B与组织蛋白酶B抑制剂平衡作用也参与肿瘤的发生发展过程。在多种人类肿瘤中都已经发现组织蛋白酶B表达水平上调。组织蛋白酶B已成为肿瘤细胞侵袭和转移相关的重要靶点，有关其抑制剂的研究可能为肿瘤的治疗提供新的手段。

组织蛋白酶B抑制剂的筛选一般使用光谱法，其不足之处在于光谱法易受到背景干扰，可能得到假阳性或假阴性结果(Arjen R.de Boer，Henk Lingeman，Wilfried M.A.Niessen，Hubertus Irth.Trends in Analytical Chemistry，Vol.26，No.9，2007.)。质谱方法最大的优势在于它的检测本质是基于一个分子的质荷比。现代质谱仪的高精确度和灵敏度为我们提供了不受干扰的分子指纹图谱，串联质谱高度特异性和精确性揭示待分析化合物的结构信息，且质谱方法可以同时检测和定量多种组分(Gejing Deng，Gautam Sanyal.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40(2006)528-538)。酶促反应缓冲液中往往含有不挥发的盐和为保持酶活性稳定的添加物，盐和添加物可能会污染质谱仪的离子源并导致离子化抑制，样品进入质谱前使用高效液相进行分离可以避免反应体系中的盐和添加物对检测的影响(Arjen R.de Boer，Thomas Letzel，Danny A.van Elswijk，Henk Lingeman，Wilfried M.A.Niessen，and Hubertus Irth.Anal.Chem.2004，76，3155-3161)。

发明内容

本发明的目的是提供超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法。本发明可用于分析天然产物提取物或单体对组织蛋白酶B体外抑制率以及组织蛋白酶催化活性的超高效液相色谱和质谱联用的方法。

本发明所述的天然产物提取物或单体对组织蛋白酶B的体外抑制是指天然产物提取物或单体抑制组织蛋白酶B的活性从而导致酶促反应产物7-氨基-4-甲基香豆素的量减少；

本发明所述的组织蛋白酶催化活性是指在37℃，组织蛋白酶催化底物生成7-氨基-4-甲基香豆素的量。

本发明包括以下内容：以Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素为底物，组织蛋白酶B在37℃催化底物生成7-氨基-4-甲基香豆素，用超高效液相色谱和质谱联用对7-氨基-4-甲基香豆素进行定量。

本发明提供的超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法，所述的组织蛋白酶B抑制剂是天然产物提取物或单体，其包括以下步骤：

(1)酶促反应缓冲液的配制

缓冲液包括0.4摩尔/升醋酸钠，4毫摩尔/升乙二胺四乙酸，8毫摩尔/升二硫苏糖醇，用醋酸调pH值为5.5；

(2)标准品的配制

用甲醇将标准品分别配成浓度为100纳摩尔/升、200纳摩尔/升、500纳摩尔/升、1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素作为内标；所述的标准品为7-氨基-4-甲基香豆素；

(3)对照品和样品的酶促反应

对照品：反应总体积100微升，终浓度8纳摩尔/升的组织蛋白酶B，在37℃孵育30分钟，加入终浓度20微摩尔/升的底物Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，37℃反应20分钟后，加入1％(v/v)三氟乙酸终止反应，同时加入终浓度为1微摩尔/升的内标7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素，作为对照品；供超高效液相色谱/质谱测定；

样品：反应总体积100微升，终浓度8纳摩尔/升的组织蛋白酶B与终浓度为2微摩尔/升的组织蛋白酶B抑制剂于37℃孵育30分钟，加入终浓度20微摩尔/升的底物Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，37℃反应20分钟后，加入1％(v/v)三氟乙酸终止反应，同时加入终浓度为1微摩尔/升的内标7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素，作为样品；供超高效液相色谱/质谱测定；

(4)标准品、对照品和样品的检测

对标准品检测：采用7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取7-氨基-4-甲基香豆素m/z＝176.0712及7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素m/z＝206.0817的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以7-氨基-4-甲基香豆素与7-氨基-4-甲氧基香豆素峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为100纳摩尔/升至20微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到7-氨基-4甲基香豆素的线性方程：

y＝ax+b

式中，y为所述的标准品7-氨基-4-甲基香豆素与内标7-氨基-4-甲氧基香豆素峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔/升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R²；

超高效液相色谱的检测条件：

超高效液相色谱仪：安捷伦RRLC1200SL；

色谱柱：安捷伦ZORBAX Extend-C18(2.1*50毫米，1.8微米)；

流动相：甲醇(A)和水(B)；

梯度洗脱程序：0～8分钟，30％A～55％A；8～8.1分钟，55％A～30％A；8.1～13分钟，30％A；

流速：0.7毫升/分钟；

进样量：10微升；

质谱条件：

质谱仪：安捷伦6520；

离子源：大气压化学电离源(APCI)正离子模式；

毛细管电压：3500伏特；

气体温度：350摄氏度；

雾化器温度：350摄氏度；

干燥气流速：5升/分钟；

雾化气气压：275.8千帕；

碎裂电压：175伏特；

锥孔电压：65伏特；

对照品和样品均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；

(5)抑制剂对组织蛋白酶的抑制率

分别根据对对照品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品和样品中7-氨基-4-甲基香豆素浓度，抑制剂对组织蛋白酶的抑制率按照以下公式计算：

I_样品＝(C_对照-C_样品)/C_对照×100％

式中，I为抑制剂对组织蛋白酶的抑制率，C_对照为根据线性方程求得的对照品中7-氨基-4-甲基香豆素浓度，量纲为微摩尔/升、C_样品为根据线性方程求得的样品中7-氨基-4-甲基香豆素浓度，量纲为微摩尔/升。

有益效果：本发明提供了超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法，所述的组织蛋白酶B抑制剂是天然产物提取物或单体。本发明用超高效液相色谱和质谱联用的方法，用于分析天然产物提取物或单体对组织蛋白酶B体外抑制率以及组织蛋白酶催化活性。本发明将超高效液相色谱和质谱联用方法应用到酶抑制剂筛选中，样品检测快速、准确，线性方程相关系数高于0.997，质谱针对化合物质量电荷比进行检测，精确度高，特异性好，避免了光谱法筛选中的假阳性和假阴性结果，可用于组织蛋白酶B抑制剂的筛选，并且可用于组织蛋白酶B的动力学研究。

附图说明

图1为实施例1中1微摩尔/升的标准品7-氨基-4-甲基香豆素和1微摩尔/升的内标7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素的总离子流色谱图。

图2为实施例1中1微摩尔/升标准品7-氨基-4-甲基香豆素(较高的峰)和1微摩尔/升内标7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素(较低的峰)的提取色谱图。

图3为实施例1中不同浓度7-氨基-4-甲基香豆素标准品的标准曲线及线性公式。

图4为实施例1中对照品的提取色谱图。

图5为实施例1中样品的提取色谱图。

图6为实施例2中样品的提取色谱图。

图7为实施例3中样品的提取色谱图。

图8为实施例4中样品的提取色谱图。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例来描述发明。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。

实施例1

本发明提供的超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法，其包括以下步骤：

(1)酶促反应缓冲液的配制

缓冲液包括0.4摩尔/升醋酸钠，4毫摩尔/升乙二胺四乙酸，8毫摩尔/升二硫苏糖醇，用醋酸调pH值为5.5；

7-氨基-4-甲基香豆素标准品的配制：用甲醇将7-氨基-4-甲基香豆素标准品分别配成浓度为100纳摩尔/升、200纳摩尔/升、500纳摩尔/升、1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品均含1微摩尔/升7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素作为内标；

(2)标准品的配制

用甲醇将标准品分别配成浓度为100纳摩尔/升、200纳摩尔/升、500纳摩尔/升、1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素作为内标；所述的标准品为7-氨基-4-甲基香豆素；

(3)对照品和样品的酶促反应

对照品：反应总体积100微升，终浓度8纳摩尔/升组织蛋白酶B在37摄氏度孵育30分钟，加入终浓度20微摩尔/升底物，37摄氏度反应20分钟后，加入1％三氟乙酸终止反应，同时加入1微摩尔/升内标，为对照品，供超高效液相色谱/质谱测定；

样品：反应总体积100微升，终浓度8纳摩尔/升组织蛋白酶B与终浓度10纳摩尔/升组织蛋白酶抑制剂E64(购自Sigma公司)在37摄氏度孵育30分钟，加入终浓度20微摩尔/升底物，37摄氏度反应20分钟后，加入1％三氟乙酸终止反应，同时加入1微摩尔/升内标，为样品，供超高效液相色谱/

(4)对标准品、照品和样品检测

对标准品检测：采用7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素为内标，以内标法定量，在下述的超高效液相色谱和质谱条件下，对步骤(2)的系列标准品溶液进行测定，从总离子流图中提取7-氨基-4-甲基香豆素m/z＝176.0712及7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素m/z＝206.0817的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以7-氨基-4-甲基香豆素与7-氨基-4-甲氧基香豆素峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为100纳摩尔/升至20微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到7-氨基-4甲基香豆素的线性方程：

y＝0.808x+0.043

式中，y为所述的标准品7-氨基-4-甲基香豆素与内标7-氨基-4-甲氧基香豆素峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔/升；相关系数r²＝0.997；

超高效液相色谱的检测条件：

超高效液相色谱仪：安捷伦RRLC1200SL；

色谱柱：安捷伦ZORBAX Extend-C18(2.1*50毫米，1.8微米)；

流动相：甲醇(A)和水(B)；

梯度洗脱程序：0～8分钟，30％A～55％A；8～8.1分钟，55％A～30％A；8.1～13分钟，30％A；

流速：0.7毫升/分钟；

进样量：10微升；

质谱条件：

质谱仪：安捷伦6520；

离子源：大气压化学电离源(APCI)正离子模式；

毛细管电压：3500伏特；

气体温度：350摄氏度；

雾化器温度：350摄氏度；

干燥气流速：5升/分钟；

雾化气气压：275.8千帕；

碎裂电压：175伏特；

锥孔电压：65伏特；

对照品和样品均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；

(5)数据处理

分别根据对对照品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品和样品中7-氨基-4-甲基香豆素浓度，抑制剂对组织蛋白酶的抑制率按照以下公式计算：

I_样品＝(C_对照-C_样品)/C_对照×100％

式中，I为抑制剂对组织蛋白酶的抑制率，C_对照为根据线性方程求得的对照品中7-氨基-4-甲基香豆素浓度，量纲为微摩尔/升、C_样品为根据线性方程求得的样品中7-氨基-4-甲基香豆素浓度，量纲为微摩尔/升。

经计算得到10纳摩尔/升E64对组织蛋白酶B的抑制率I为40％。结果参见图1-5。

实施例2

所述的样品如下：反应总体积100微升，终浓度8纳摩尔/升组织蛋白酶B与终浓度100微摩尔/升川芎嗪标准品在37摄氏度孵育30分钟，加入终浓度20微摩尔/升底物，37摄氏度反应20分钟后，加入1％三氟乙酸终止反应，同时加入1微摩尔/升内标，为样品，供超高效液相色谱/质谱测定；

其余的同实施例1；

按照实施例1的检测步骤检测并计算得到1微摩尔/升川芎嗪标准品对组织蛋白酶的抑制率为9％。图6为实施例2中样品的提取色谱图。

实施例3

所述的样品如下：反应总体积100微升，终浓度8纳摩尔/升组织蛋白酶B与终浓度100微摩尔/升丹参酮IIA标准品在37摄氏度孵育30分钟，加入终浓度20微摩尔/升底物，37摄氏度反应20分钟后，加入1％三氟乙酸终止反应，同时加入1微摩尔/升内标，为样品，供超高效液相色谱/质谱测定；

其余的同实施例1；

按照实施例1的检测步骤检测并计算得到1微摩尔/升丹参酮IIA标准品对组织蛋白酶的抑制率为1％。图7为实施例3中样品的提取色谱图。

实施例4

所述的样品如下：反应总体积100微升，终浓度8纳摩尔/升组织蛋白酶B与终浓度100微摩尔/升姜黄素标准品在37摄氏度孵育30分钟，加入终浓度20微摩尔/升底物，37摄氏度反应20分钟后，加入1％三氟乙酸终止反应，同时加入1微摩尔/升内标，为样品，供超高效液相色谱/质谱测定；

其余的同实施例1；

按照实施例1的检测步骤检测并计算得到1微摩尔/升姜黄素标准品对组织蛋白酶的抑制率为10％。图8为实施例4中样品的提取色谱图。