用于检测小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及一种用二重PCR技术对感染番鸭群中小鹅瘟病毒(Goose Parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy Duck Parvovirus，MDPV)进行快速鉴别诊断的试剂盒及检测方法。本发明含有Taq DNA聚合酶(5U/μL)、10×PCR buffer、Mg

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的检测试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的方法。

背景技术

小鹅瘟(Gosling Plague，GP)又称鹅细小病毒病，最早由我国学者方定一1956年在扬州发现，并于1961年用鹅胚分离该病病毒(Goose Parvovirus，GPV)。该病主要发生于1月龄内雏鹅和雏番鸭，是一种传播快、死亡率高的高度接触性传染病。10日龄雏鹅发病率和死亡率可达100％，在易感群中的致死率高达70％。本病在世界各地均有不同程度的流行，广泛发生于中国、欧洲各国、以色列、日本等国，是目前危害养鹅业的主要疾病之一。

番鸭细小病毒(Muscovy Duck Parvovirus，MDPV)病，我国1985年报道，法国1989年报道。主要侵害3周龄以内的雏番鸭(三周病)，发病率和死亡率高，是以肠炎、腹泻、软脚和喘气为临诊特征的急性和亚急性传染病。

两种病的病原鹅细小病毒和番鸭细小病毒都属于细小病毒科、细小病毒属。在电镜下病毒呈晶格排列，有实心和空心两种粒子，无囊膜，直径20～24nm；核酸单链DNA，5.1kbp大小。

由于两种病毒均能感染雏番鸭，且症状和病理变化相似，都能造成死亡。因而，如何对两种病原进行快速鉴别对诊断疾病是一个重要方面。

发明内容

本发明的目的就在于研制一种鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的检测试剂盒及其检测方法。

本发明的技术方案是：一种用于检测小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的试剂盒，包括以下成分：

10×PCR buffer、Mg2+(10mmol/L)、dNTP(10mmol/L)、Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2对特异性引物。其中：

第一对引物仅仅是小鹅瘟病毒基因组特异的，而番鸭细小病毒基因组是非互补的：

F1：5’-gcagg aacaa ttacc ag-3’

R1：5’-acc acctc ccgca ctgac-3’

第二对引物是两种水禽细小病毒基因组都共有的片段：

F2：5’-cggaa ggcac catgc cgccg-3’

R2：5’-cagaa tttac agatt ttgag-3’

本发明的另一技术方案是：

使用上述试剂盒检测小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的方法，其步骤包括：

(1)从待测样本中提取病毒基因组：采用DNA提取试剂盒进行；

(2)用两对引物同时进行PCR，体系如下：

10×pCR buffer            5μL

Mg2+10mmol/L              3μL

dNTP 10mmol/L             1μL

Taq DNA聚合酶5U/μL       1μL

引物F1                    1μL

引物R1                    1μL

引物F2                    1μL

引物R2                    1μL

扩增条件为：95℃变性5分钟，94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟。

(3)电泳鉴定：取10微升PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，如果电泳结果同时出现大小约为774bp和1145bp大小的两条带，则判定为小鹅瘟病毒感染；如果电泳结果只出现大小约为1145bp大小的条带，则判定为番鸭细小病毒感染；如果电泳结果未扩增出条带，则判定没有这两种病毒感染。

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：本发明建立了快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的检测试剂盒及其检测方法，本试剂盒根据水禽细小病毒基因序列特点的设计了两对引物，一对只能扩增鹅细小病毒特有的基因片段，另一对能扩增两种病毒共同的基因片段。本发明建立的鉴别诊断技术，特异性强，有很高的灵敏度，可用于小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的鉴别诊断。

本发明解决了现有技术中无法快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒缺陷，提供的鉴别诊断试剂盒及其检测方法，快速、准确性高、灵敏性好，可应用于兽医临床领域。

附图说明

图1是二重PCR鉴定GPV和MDPV电泳图，其中M为DL2000标准分子量Marker，第1泳道为阳性GPV对照，第2泳道为阳性MDPV对照，第3泳道为阴性对照，第4、5泳道为GPV感染病料，第6泳道为MDPV感染病料。

具体实施方式

下列实例进一步说明本发明，但不应该当作对本发明的限制。

实施例1：按下列配方制作快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的检测试剂盒：

10×PCR buffer、Mg2+(10mmol/L)、dNTP(10mmol/L)、Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2对特异性引物(引物由Invitrogen公司合成)。其中：

第一对引物仅仅是小鹅瘟病毒基因组特异的，而番鸭细小病毒基因组是非互补的：

F1：5’-gcagg aacaa ttacc ag-3’(SEQ ID NO.1)

R1：5’-acc acctc ccgca ctgac-3’(SEQ ID NO.2)

第二对引物是两种水禽细小病毒基因组都共有的片段：

F2：5’-cggaa ggcac catgc cgccg-3’(SEQ ID NO.3)

R2：5’-cagaa tttac agatt ttgag-3’(SEQ ID NO.4)

实施例2：利用快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的检测试剂盒检测番鸭群中细小病毒感染情况

(1)从病料(2份小鹅瘟病毒感染病料、1份番鸭细小病毒感染病料)及未感染组织(阴性对照)中提取病毒基因组：采用Quiagen公司DNA提取试剂盒进行；

(2)用两对引物同时进行PCR，同时设置取GPV和MDPV核酸做阳性模板对照，体系如下：

10×PCR buffer            5μL

Mg2+10mmol/L              3μL

dNTP 10mmol/L             1μL

Taq DNA聚合酶5U/μL       1μL

引物F1                    1μL

引物R1                    1μL

引物F2                    1μL

引物R2                    1μL

扩增条件为：95℃变性5分钟，94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟。

(3)电泳鉴定：如图1所示，小鹅瘟病毒感染病料(第4、5泳道)同时出现大小约为774bp和1145bp大小的两条带；番鸭细小病毒感染病料(第6泳道)只出现大小约为1145bp大小的条带；而阴性对照(阴性对照)未未扩增出条带。

SEQUENCE LISTING

<110>扬州大学

<120>用于检测小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的试剂盒及其检测方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

gcaggaacaa ttaccag                     17

 

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

accacctccc gcactgac                    18

 

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cggaaggcac catgccgccg    20

 

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>4

cagaatttac agattttgag    20