一种枯草芽孢杆菌GU及其在制备高效生物复合磷肥中的应用

摘要

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌GU及其在制备高效生物复合磷肥中的应用。该枯草芽孢杆菌GU的菌种保藏号为：CCTCC No：M 209228，其具有高效解磷能力，可用于制备高效生物复合磷肥。本发明还公开了一种高效生物复合磷肥，该高效生物复合磷肥中含有有机载体、磷素原料、以及强化刺激因子，所述有机载体中含有本发明的枯草芽孢杆菌GU的菌粉。本发明的高效生物复合磷肥，将本发明的枯草芽孢杆菌GU的菌粉，与磷矿粉和增强刺激因子按比例进行配伍，具有很强的供磷能力，一次施肥后可保持土壤中可溶磷含量大于25mg/kg并持续6个月，对促进我国种植业增产具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可用于生产高效生物复合磷肥的土壤解磷芽孢杆菌及一种用该菌株生产的高效生物复合磷肥。

技术背景

磷是植物生长必需的矿质元素之一，是植物体内核酸的重要组成元素，而核酸又是形成核蛋白的重要组成部分，核酸广泛地参与原生质及细胞器的组成。土壤中的磷，95％以上为无效形式，主要与一些金属离子形成矿物磷酸盐类化合物，植物很难直接吸收利用，化肥磷肥在当季作物中的利用率仅为5％～25％。我国缺磷土壤面积很大，有74％的耕地土壤缺磷，即使经过多年不断的施用磷肥也没有明显的改善。土壤中的磷元素并不缺乏，经过常年施用化肥的积累，磷元素在土壤中的含量很高，但植物无法吸收利用这些磷，如能提高土壤中磷的利用效率将为中国农业带来巨大变化。由于土壤磷主要存在于土壤矿物或有机质中，在自然状况下其释放速度很慢，很难满足植物生长发育的需要。某些微生物具有很强的解磷功能，通过其分泌物或吸收作用把土壤中无效磷转化成有效磷，从而提高植物对磷的利用率。筛选解磷微生物并生产，是解决植物缺磷问题的有效途径。解磷微生物除了能够提高植物对磷的吸收率外还有其他优点，可促进植物生长，提高其他元素的吸收率，肥效高，缓解环境等。

目前农业上普遍使用的磷肥的磷元素利用率普遍不高，现有的生物肥料不但价格贵、见效慢，而且活力损失快。筛选一种能够在田间存留时间长、解磷效果好高效的解磷微生物，是解决此问题的关键，并用其生产一种速效、稳定、廉价的生物复合磷肥对我国种植业具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有良好解磷效果、田间存留时间长的枯草芽孢杆菌GU，以克服现有生物复合磷肥在价格、肥效和活力方面的缺点。

本发明的目的还在于提供上述枯草芽孢杆菌GU在制备高效生物复合磷肥中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种高效生物复合磷肥，其具有速效、稳定、廉价的优点，用于提高肥料中的磷素原料的利用率，并增加土壤中的可溶磷含量。

为了实现上述目的，本发明提供的一种枯草芽孢杆菌GU(Bacillus subtilisGU)，该菌株于2009年10月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 209228，该菌株具有高效解磷能力。

上述菌种具有如下性质：

1、形态及生理特征：

单个细胞为0.7～0.8×2～3微米，芽孢为0.6～0.9×1.0～1.5微米，革兰氏阳性菌，无荚膜，全身鞭毛，能活动。芽孢位於菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。在液体培养基中静置培养时形成菌膜，兼性好氧。可在营养肉汤培养基和LB培养基上生长，24小时可形成3～5mm直径菌落，菌落表面粗糙不透明，白色或微黄色。

2、采用的培养基：

固体斜面分离及计数培养基：蛋白胨0.6％，牛肉膏0.3％，琼脂1.8％，pH值6.8，121℃灭菌20min。

液体种子培养基：蛋白胨0.8％，牛肉膏0.3％，酵母膏0.1％，NaCl 0.5％，KCl 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，CaCl₂ 0.002％，MnSO₄·H₂O 0.001％g，pH值6.8，121℃灭菌20min。

筛选及解磷性能测定培养基：葡萄糖0.8％，(NH₄)₂SO₄ 0.05％，NaCl 0.02％，KCl 0.02％，Ca₃(PO₄)₂1％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，MnSO₄·4H₂O 0.003％，琼脂1.6％，pH 7.0，115℃灭菌20min。

发酵生产培养基：玉米淀粉0.5％～2％，玉米浆干粉1％～5％，酵母膏0.01％～0.3％，蛋白胨0.05％～0.5％，KH₂PO₄ 0.1％～0.4％，Na₂HPO₄ 0.2％～0.8％，MgSO₄·7H₂O 0.01％～0.04％，CaCl₂ 0.01％～0.04％，MnSO₄·H₂O 0.001％～0.008％g，pH值6.0～7.5。

3、培养条件：

培养温度：35℃～40℃；培养pH6.5～7.2

4、鉴定方法：

将筛选出的菌株样品分别按SDS方法提取总DNA，PCR扩增后对ITS序列进行测定，使用Blast工具将测序结果与NCBI数据库进行对比，确定所分离得到的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Identities＝96％，Gaps＝1％。

5、本发明所用的分析方法：

使用平板计数法测定产品的活菌总数。

使用筛选培养基测量溶磷圈的大小判断菌株的解磷能力。

使用国标GB/T 8573-1999的方法进行可溶磷的测定，并检测菌株的性能。

相应地，本发明提供了上述菌株筛选、驯化方法：

将采集的样品(磷肥厂采集)称量10g，置于250ml锥形瓶中，加入100ml生理盐水，室温摇晃20min，吸取悬液1ml至装有9ml生理盐水的试管中，充分震荡摇匀；吸取0.2ml稀释液转移至上述固体培养基平板上，用三角玻璃棒涂布；将其置于30℃培养箱中培养30小时。挑取长势良好的单一菌落，再上述固体培养基平板上进行划线，将其置于30℃培养箱中培养30小时。用无菌牙签挑取长势良好的单一菌落，在上述筛选培养基上进行点样，于30℃下培养3天，挑取溶磷圈较大的菌株至试管斜面培养基上培养保存；将试管菌种接种到250ml锥形瓶(装液50ml)液体培养基中，培养基为上述液体培养基，将刚接种的培养基取样用国标GB/T 8573-1999的方法进行可溶磷的测定，其结果作为空白，将锥形瓶至于30℃下摇床培养，转速为200rpm，培养3天，再取样测定可溶磷的含量，将结果减去空白得到菌株的解磷性能；筛选出的最优菌株。

进一步地，本发明通过以下技术方案实现上述菌株菌粉的生产：

1、从斜面接种至摇瓶种子培养基中，36℃～38℃培养18～24小时后以0.2％～1％的接种量接入发酵罐中。发酵培养条件为：37℃培养48～56小时。

2、培养完成后添加吸附载体：0.5％～1％CaCO₃、1％～2％麸皮及助滤剂：2％珍珠岩、1％沸石粉。使用板框压滤机过滤。

3、在滤渣中加入2.3％的蔗糖均匀混合后进行闪蒸干燥，制得菌粉。

4、菌粉芽孢率为89％～97％，总菌数为380×10⁸～460×10⁸cfu/g。

另外，本发明还提供了一种高效生物复合磷肥，该高效生物复合磷肥中含有有机载体、磷素原料、以及强化刺激因子，所述有机载体中含有上述枯草芽孢杆菌GU的菌粉。

其中，所述菌粉占所述有机载体的3％～5％(重量百分比)。

优选地，所述有机载体中还包含占该高效生物复合磷肥重量百分比如下的成分：麸皮2％～10％，稻壳粉5％～15％，花生壳粉2％～4％。

优选地，所述磷素原料为磷矿粉。

优选地，所述强化刺激因子中含有占该高效生物复合磷肥重量百分比如下的成分：硫酸锰0.15％～0.2％、硫酸铜0.18％～0.21％、尿素1.2％～1.8％、柠檬酸铵1.3％～1.6％，蛋白胨0.1％～0.3％。

在本发明高效生物复合磷肥的配置和组分优化过程中，将所得到的上述枯草芽孢杆菌GU的菌粉与有机载体充分混合，菌粉占有机载体的3～5％(重量比)，再将混合后的有机载体与强化刺激因子充分混合，再与磷素原料磷矿粉混合，最后造粒。

本发明设计了强化刺激因子配方组分，以加强在田中的应用效果。强化刺激因子的组要成分是：硫酸锰、硫酸铜、尿素、柠檬酸铵、及生长因子。

通过各种实验进行优化后的强化刺激因子的成分为：硫酸锰0.15％～0.2％、硫酸铜0.18％～0.21％、尿素1.2％～1.8％、柠檬酸铵1.3％～1.6％，蛋白胨0.1％～0.3％，其中各百分比含量是指占该高效生物复合磷肥重量百分比。

采用本发明的菌种和生产方法生产出的生物复合磷肥，可直接施用于缺磷土壤中，有效解决因缺磷造成的植物生长缓慢、苍老、无光泽、成熟延迟、抗病性差、产量和品质下降等症状。且生产成本低廉，磷素原料粗放简单。采用本发明的菌种，可使施用后土壤中的可溶磷含量维持在一定的浓度，在酸性土壤中可维持可溶磷含量大于25mg/kg，并可持续。采用本发明的生物复合磷肥，不但可以长期为植物提供磷素，还可速效解决植物的缺磷问题。在实验中，本发明中的生物复合磷肥可消除香蕉叶片出现的斑点，促进生长，抗病能力增加。

通过借助以下实施例将更详细地说明本发明，需要指出地是，以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。

具体实施方式：

实施例一：菌粉的生产

1、从斜面接种至液体种子培养基中，37℃培养24小时。

其中固体斜面培养基为：蛋白胨0.6％，牛肉膏0.3％，琼脂1.8％，pH值6.8，121℃灭菌20min。

液体种子培养基为：蛋白胨0.8％，牛肉膏0.3％，酵母膏0.1％，NaCl 0.5％，KCl 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，CaCl₂ 0.002％，MnSO₄·H₂O 0.001％g，pH值6.8，121℃灭菌20min。

2、种子培养完成后以0.2％的接种量接入发酵罐中。

发酵培养基为：玉米淀粉1.1％，玉米浆干粉3％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.2％，KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄ 0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，CaCl₄ 0.02％，MnSO₄·H₂O0.005％g，pH值6.8。

发酵培养条件为：37℃培养50小时，转速250rpm，溶氧含量保持在30％～50％之间。

3、培养完成后添加吸附载体：1％ CaCO₃、2％麸皮和助滤剂：2％珍珠岩、1％沸石粉。使用板框压滤机过滤。

4、在滤渣中加入2.3％的蔗糖均匀混合后进行闪蒸干燥，干燥工艺为：进口风温度为160℃，出口风温度为140℃。

5、收集菌粉，检测菌粉的芽孢率为95％，总菌数为434×10⁸cfug。

6、菌种解磷检测，使用解磷性能测定培养基：葡萄糖0.8％，(NH₄)₂SO₄0.05％，NaCl 0.02％，KCl 0.02％，Ca₃(PO₄)₂ 1％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，MnSO₄·4H₂O 0.003％，琼脂1.6％，pH 7.0，115℃灭菌20min。在平板上点样，30℃培养72小时，测得溶磷圈为6mm。

实施例二：生物复合磷肥的生产

1、选用有机载体麸皮、稻壳粉、花生壳粉比例为2∶3∶1，添加按质量比添加3％的菌粉，充分混合。

2、将混合载体后的菌粉按1∶7与磷矿粉混合，添加强化刺激因子。

3、强化刺激因子的成分为：硫酸锰0.16％、硫酸铜0.18％、尿素1.4％、柠檬酸铵1.5％，蛋白胨0.15％。

4、混合后造粒。

5、充分混合后阴凉干燥处保存。

6、经检验此生物复合磷肥的活菌数为1.2×10⁸，总磷含量为11.2％，水溶性溶磷含量为0.6％。

实施例三：应用试验

实验作物：香蕉

试验样品：在实验中使用了两种其他磷肥作为对照，并用清水做空白对照。

土壤类型：砖红壤

试验方法：

一次施用磷肥后跟踪土壤中的可溶磷含量变化并对照亩产量。实验结果如下：

表1：土壤中可溶磷的含量测定(mg/kg)

  时间  初始  1月  2月  3月  4月  5月  6月  样品  46  38  33  30  27  26  25  对照1  53  39  27  16  11  6  4

  对照2  44  35  26  17  14  10  8  空白  16  10  3  0.8  0.7  0.4  0.3

表2：亩产量对比试验

  项目  样品  对照1  对照2  空白  亩产(kg)  3400  2600  2900  1890

实验证明使用本发明生物复合肥料可保持土壤较高的可溶磷含量，并对植物生长具有良好的促进作用。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。