一种具有降血脂作用的普伐他汀钠组合物及其制备方法

摘要

利用曲霉CICC13005，CICC2345，CICC2355，CICC2218，CICC2203，CICC2207，CICC2136，CICC2078，CICC2388，CICC2436，CICC2400，CICC2308或CICC2348产酶水解普伐他汀钠，其中部分普伐他汀钠的结构发生了改变，即普伐他汀钠的结构类似物，原普伐他汀钠在酶的作用下形成含普伐他汀钠和普伐他汀钠结构类似物的组合物，该组合物降血脂水平优于同浓度普伐他汀钠。

说明书

技术领域

本发明涉及一种组合物，特别涉及一种具有降血脂作用的普伐他汀钠组合物及其制备方法。

背景技术

普伐他汀钠为一种高效调脂药，能使血浆总胆固醇下降25％、低密度脂蛋白胆固醇下降34％、甘油三酯下降24％、高密度脂蛋白胆固醇升高12％。能显著减缓动脉粥样硬化进程，有出色的耐受性、高度的安全性。用于高脂血症、家族性高胆固醇血症。

发明内容

本发明的一个目的在于公开一种普伐他汀钠组合物；本发明的另一个目的在于公开一种具有降血脂作用的普伐他汀钠组合物的制备方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

本发明普伐他汀钠组合物由如下固体发酵方法制备：

斜面菌种培养：选曲霉CICC13005，CICC2345，CICC2355，CICC2218，CICC2203，CICC2207，CICC2136，CICC2078，CICC2388，CICC2436，CICC2400，CICC2308或CICC2348进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 6-8的培养基，使得每体积份培养基含琼脂0.02-0.1重量份；在100-120℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在20℃--40℃条件下培养3-7天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1：0.5-2的比例混和，混匀后在100-120℃条件下，灭菌20-40分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的5-10％，在20-40℃，培养1-5天，在培养好的麸皮中加入0.01-0.5M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每体积份含普伐他汀钠0.03-0.2重量份，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶1.5-8混合，在转化温度为20-40℃，转化反应时间为12-48小时，即得组合物。

本发明普伐他汀钠的组合物固体发酵方法优选为：

斜面菌种培养：选CICC13005，CICC2345，CICC2355，CICC2218，CICC2203，CICC2207，CICC2136，CICC2078，CICC2388，CICC2436，CICC2400，CICC2308或CICC2348进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每体积份培养基含琼脂0.05重量份；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在30℃条件下培养5天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1的比例混和，混匀后在110℃条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的8％，在30℃，培养3天，在培养好的麸皮中加入0.3M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每体积份含普伐他汀钠0.1重量份，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶4混合，在转化温度为30℃，转化反应时间为24小时，即得组合物。

本发明普伐他汀钠组合物还可以由如下液体发酵方法制备：

斜面菌种培养：选CICC13005，CICC2345，CICC2355，CICC2218，CICC2203，CICC2207，CICC2136，CICC2078，CICC2388，CICC2436，CICC2400，CICC2308或CICC2348进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是6-8的培养基，使得每体积份培养基含琼脂0.02-0.1重量份；在100-120℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在20℃-40℃条件下培养3-7天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为6-8的培养基，使得每体积份培养基含葡萄糖0.01-0.1重量份，牛肉膏0.01-0.1重量份，蛋白胨0.01-0.06重量份，硝酸铵0.01-0.05重量份，硫酸镁0.01-0.08重量份；20-100体积份的培养基，在100-120℃条件下，灭菌20-40分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的5-10％，在20-40℃，转速100-250r/min条件下进行发酵，培养1-5天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每体积份含普伐他汀钠0.03-0.2重量份，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每体积份发酵培养液中含底物0.00003-0.0001重量份，在转化温度为20-40℃，转化时间为5-48小时，即得组合物。

本发明普伐他汀钠组合物液体发酵方法优选为：

斜面菌种培养：选CICC13005，CICC2345，CICC2355，CICC2218，CICC2203，CICC2207，CICC2136，CICC2078，CICC2388，CICC2436，CICC2400，CICC2308或CICC2348进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每体积份培养基含琼脂0.05重量份；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在30℃条件下培养5天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为7的培养基，使得每体积份培养基含葡萄糖0.05重量份，牛肉膏0.05重量份，蛋白胨0.04重量份，硝酸铵0.03重量份，硫酸镁0.04重量份；50体积份的培养基，在110℃条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的8％，在30℃，转速150r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每体积份含普伐他汀钠0.1重量份，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每体积份发酵培养液中含底物0.00008重量份，在转化温度为30℃，转化时间为28小时，即得组合物。

上述重量份与体积份的关系为克与毫升的关系，即g/ml。

利用曲霉CICC13005，CICC2345，CICC2355，CICC2218，CICC2203，CICC2207，CICC2136，CICC2078，CICC2388，CICC2436，CICC2400，CICC2308或CICC2348产酶水解普伐他汀钠，其中部分普伐他汀钠的结构发生了改变，即普伐他汀钠的结构类似物。原普伐他汀钠在酶的作用下形成含普伐他汀钠和普伐他汀钠结构类似物的组合物，该组合物降血脂水平优于同浓度普伐他汀钠。

附图说明

图1固体发酵对照品一

图2固体发酵对照品二

图3固体发酵CICC 13005，CICC 2345，CICC 2355，CICC 2218，CICC2203，CICC 2207，CICC 2136，CICC 2078，CICC 2388，CICC 2436，CICC 2400，CICC 2308或CICC 2348酶水解普伐他汀钠的供试品

图4固体发酵无新生物产生

图5液体发酵对照品一

图6液体发酵对照品二

图7液体发酵CICC 13005，CICC 2345，CICC 2355，CICC 2218，CICC2203，CICC 2207，CICC 2136，CICC 2078，CICC 2388，CICC 2436，CICC 2400，CICC 2308或CICC 2348酶水解普伐他汀钠的供试品

图8液体发酵无新生物产生

下面实验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1菌种筛选(固体发酵)

本发明的关键在于筛选到对普伐他汀钠有转化作用的菌种，筛选实验的过程为：筛选菌种为CICC 13005，CICC 2345，CICC 2355，CICC 2218，CICC2203，CICC 2207，CICC 2136，CICC 2078，CICC 2388，CICC 2436，CICC2400，CICC2308，CICC2348，CICC13026，CICC 3113，CICC 2041，CICC 2255或CICC 2168。

供试品制备：将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每体积份培养基含琼脂0.05g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在30℃条件下培养5天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1的比例混和，混匀后在110℃条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的8％，在30℃，培养3天，在培养好的麸皮中加入0.3M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶4混合，在转化温度为30℃，转化反应时间为24小时，即得组合物。

对照品一制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后，取滤液0.5ml，加0.25ml水，20-40℃反应24h，即得作为对照品一。对照品二制备：用18种筛选菌种分别按照供试品制备中的方法制备粗酶液，每种粗酶液0.25ml加0.5ml水，20-40℃反应24h。色谱柱：COSMOSIL ODS-C18(250×4.6mm)；检测器：UV(λ＝238nm)流动相A为含0.01M醋酸胺的水溶液，流动相B为甲醇。试验结果可知，图一显示普伐他汀钠标品；图二显示18个菌分别制备的酶液对照品二，液相图谱表明，18个菌分别制备的酶液液相图大体相同；图三显示CICC 13005，CICC2345，CICC2355，CICC2218，CICC2203，CICC2207，CICC2136，CICC2078，CICC2388，CICC2436，CICC2400，CICC2308，CICC2348与普伐他汀钠的酶解反应组合物即本发明组合物的液相图大体相同，均有新生成物出现(箭头处)，其它菌种与普伐他汀钠酶转化反应后无新物质出现。

实验例2菌种筛选(液体发酵)

本发明的关键在于筛选到对普伐他汀钠有转化作用的菌种，筛选实验的过程为：筛选菌种为CICC 13005，CICC 2345，CICC 2355，CICC 2218，CICC2203，CICC 2207，CICC 2136，CICC 2078，CICC 2388，CICC 2436，CICC2400，CICC2308，CICC2348，CICC13026，CICC 3113，CICC 2041，CICC 2255或CICC 2168。

供试品制备：斜面菌种培养：将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每体积份培养基含琼脂0.05g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在30℃条件下培养5天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为7的培养基，使得每体积份培养基含葡萄糖0.05g，牛肉膏0.05g，蛋白胨0.04g，硝酸铵0.03g，硫酸镁0.04g；在250ml的三脚瓶中装入50ml的培养基，在110℃条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的8％，在30℃，摇瓶转速150r/min条件下进行摇瓶发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00008g，在转化温度为30℃，转化时间为28小时，即得组合物。

对照品一制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后，取滤液0.5ml，加0.25ml水，20-40℃反应24h，即得作为对照品一。对照品二制备：用18种筛选菌种分别按照供试品制备中的方法制备液体发酵培养液，每种液体发酵培养液0.25ml加0.5ml水，20-40℃反应24h。色谱柱：COSMOSIL ODS-C18(250×4.6mm)；检测器：UV(λ＝238nm)流动相A为含0.01M醋酸胺的水溶液，流动相B为甲醇。试验结果可知，图四显示普伐他汀钠标品；图6液体发酵显示18个菌分别制备的酶液对照品二，液相图谱表明，18个菌分别制备的酶液液相图大体相同；图7液体发酵显示CICC 13005，CICC2345，CICC2355，CICC2218，CICC2203，CICC2207，CICC2136，CICC2078，CICC2388，CICC2436，CICC2400，CICC2308，CICC2348与普伐他汀钠的酶解反应组合物即本发明组合物的液相图大体相同，均有新生成物出现(箭头处)，其它菌种与普伐他汀钠酶转化反应后无新物质出现。

实验例3药效学实验

比较同一浓度普伐他汀钠和本发明普伐他汀钠组合物对大鼠降脂能力的对比实验，实验方案如下：

1、试验动物雄性SD大鼠，体重180～220g。试验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

2、试验药物(实施例1组合物)：

A、普伐他汀钠底物加酶液培养12-48h后的混合物(实施例1组合物)

B、与A同浓度普伐他汀钠底物加与酶液体积相同的水培养12-48h的混合物)

3、血脂测定  用OLYMPUS AU1000自动生化仪对血总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)分别以胆固醇氧化酶法、甘油磷酸氧化酶法、酶法及选择遮蔽酶法测定。

4、健康成年雄性SD大鼠70只，观察10天后在乙醚麻醉下眼球后静脉丛采血测定血脂基础水平，然后分组，每组10只，开始喂高脂饲料(胆固醇1％，猪油5％，基础饲粒94％)并同时给予下列药物每日2次灌胃：A组和B组给药量均为：167ug/kg/次；给药后第14天乙醚麻醉下眼球后静脉丛采血复查血脂。试验前各组大鼠血脂无显著差异，见表1。高脂饮食同时给药结果表明A组和B组灌胃2周都可以显著降低大鼠血清总胆固醇水平及甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平，并能提高高密度脂蛋白胆固醇的水平；以下实验数据还表明：A组的降总胆固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的能力要高于B组，这表明A组中酶转化普伐他汀钠后得到的普伐他汀钠的结构类似物体内降总胆固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的能力要优于普伐他汀钠。

表1A和B降血脂水平比较试验(x±s，n＝10)

注：上述各指标单位均为mmol/L

实验例4药效学实验

同实验例3的实验方法，试验药物A为普伐他汀钠底物加酶液培养12-48h后的混合物(实施例14组合物)，实验数据表明：A组的降总胆固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的能力要高于B组，这表明A组中酶转化普伐他汀钠后得到的普伐他汀钠的结构类似物体内降总胆固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的能力要优于普伐他汀钠。

表2A和B降血脂水平比较试验(x±s，n＝10)

注：上述各指标单位均为mmol/L

应用微生物酶或微生物细胞进行的合成技术被称为微生物转化，它们在迅猛发展的化合物的合成和转化方面扮演着越来越重要的角色，而且微生物酶转化技术普遍具有环境友好，作用条件温和等优势；此外，生物催化剂具有高度的选择性，包括化学选择性，区域选择性，对映体选择性和非对映体选择性；微生物转化较化学手段转化有以下优点：条件温和，设备简单，公害少，反应速率较快，比较环保。

下述实施例均能实现本发明所述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC13005进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.05g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在30℃条件下培养5天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1的比例混和，混匀后在110℃条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的8％，在30℃，培养3天，在培养好的麸皮中加入0.3M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶4混合，在转化温度为30℃，转化反应时间为24小时，即得组合物。

实施例2：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2345进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.05g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在30℃条件下培养5天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1的比例混和，混匀后在110℃条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的8％，在30℃，培养3天，在培养好的麸皮中加入0.3M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶4混合，在转化温度为30℃，转化反应时间为24小时，即得组合物。

实施例3：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2355进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.05g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在30℃条件下培养5天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1的比例混和，混匀后在110℃条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的8％，在30℃，培养3天，在培养好的麸皮中加入0.3M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶4混合，在转化温度为30℃，转化反应时间为24小时，即得组合物。

实施例4：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2218进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 6的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.03g；在105℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在35℃条件下培养4天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1.5的比例混和，混匀后在105℃条件下，灭菌35分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的6％，在35℃，培养2天，在培养好的麸皮中加入0.5M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.04g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶7混合，在转化温度为25℃，转化反应时间为40小时，即得组合物。

实施例5：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2203进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 6的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.03g；在105℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在35℃条件下培养4天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1.5的比例混和，混匀后在105℃条件下，灭菌35分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的6％，在35℃，培养2天，在培养好的麸皮中加入0.5M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.04g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶7混合，在转化温度为25℃，转化反应时间为40小时，即得组合物。

实施例6：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2207进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 6的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.03g；在105℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在35℃条件下培养4天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1.5的比例混和，混匀后在105℃条件下，灭菌35分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的6％，在35℃，培养2天，在培养好的麸皮中加入0.5M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.04g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶7混合，在转化温度为25℃，转化反应时间为40小时，即得组合物。

实施例7：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2136进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 6的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.03g；在105℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在35℃条件下培养4天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1.5的比例混和，混匀后在105℃条件下，灭菌35分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的6％，在35℃，培养2天，在培养好的麸皮中加入0.5M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.04g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶7混合，在转化温度为25℃，转化反应时间为40小时，即得组合物。

实施例8：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2078进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.08g；在115℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在25℃条件下培养6天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1.8的比例混和，混匀后在120℃条件下，灭菌25分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的9％，在25℃，培养2天，在培养好的麸皮中加入0.4M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.09g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶3混合，在转化温度为25℃，转化反应时间为18小时，即得组合物。

实施例9：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2388进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.08g；在115℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在25℃条件下培养6天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1.8的比例混和，混匀后在120℃条件下，灭菌25分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的9％，在25℃，培养2天，在培养好的麸皮中加入0.4M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.09g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶3混合，在转化温度为25℃，转化反应时间为18小时，即得组合物。

实施例10：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2436进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.08g；在115℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在25℃条件下培养6天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶1.8的比例混和，混匀后在120℃条件下，灭菌25分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的9％，在25℃，培养2天，在培养好的麸皮中加入0.4M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.09g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶3混合，在转化温度为25℃，转化反应时间为18小时，即得组合物。

实施例11：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2400进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 8的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.1g；在104℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在38℃条件下培养4天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶0.7的比例混和，混匀后在117℃条件下，灭菌32分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的6％，在38℃，培养3天，在培养好的麸皮中加入0.07M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶3混合，在转化温度为28℃，转化反应时间为38小时，即得组合物。

实施例12：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2308进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 8的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.1g；在104℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在38℃条件下培养4天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶0.7的比例混和，混匀后在117℃条件下，灭菌32分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的6％，在38℃，培养3天，在培养好的麸皮中加入0.07M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶3混合，在转化温度为28℃，转化反应时间为38小时，即得组合物。

实施例13：普伐他汀钠的组合物固体发酵

斜面菌种培养：选CICC2348进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph 8的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.1g；在104℃条件下灭菌，灭菌后冷却，常规方法制得斜面并接种，在38℃条件下培养4天，作为斜面菌种；固体发酵培养：将麸皮与麦芽汁按照重量体积比为1∶0.7的比例混和，混匀后在117℃条件下，灭菌32分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基体积的6％，在38℃，培养3天，在培养好的麸皮中加入0.07M ph7pbs缓冲液浸泡过夜，得固体发酵培养液；粗酶液的制备：固体发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4℃条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶转化反应：将粗酶液与底物以体积比为1∶3混合，在转化温度为28℃，转化反应时间为38小时，即得组合物。

实施例14：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC13005进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.05g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在30℃条件下培养5天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为7的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.05g，牛肉膏0.05g，蛋白胨0.04g，硝酸铵0.03g，硫酸镁0.04g；50ml的培养基，在110℃条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的8％，在30℃，转速150r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00008g，在转化温度为30℃，转化时间为28小时，即得组合物。

实施例15：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2345进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.05g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在30℃条件下培养5天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为7的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.05g，牛肉膏0.05g，蛋白胨0.04g，硝酸铵0.03g，硫酸镁0.04g；50ml的培养基，在110℃条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的8％，在30℃，转速150r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00008g，在转化温度为30℃，转化时间为28小时，即得组合物。

实施例16：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2355进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.05g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在30℃条件下培养5天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为7的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.05g，牛肉膏0.05g，蛋白胨0.04g，硝酸铵0.03g，硫酸镁0.04g；50ml的培养基，在110℃条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的8％，在30℃，转速150r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00008g，在转化温度为30℃，转化时间为28小时，即得组合物。

实施例17：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2218进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是6.5的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.09g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在22℃条件下培养6天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为6.5的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.02g，牛肉膏0.9g，蛋白胨0.04g，硝酸铵0.02g，硫酸镁0.07g；60ml的培养基，在102℃条件下，灭菌38分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的7％，在24℃，转速220r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.05g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00008g，在转化温度为29℃，转化时间为9小时，即得组合物。

实施例18：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2203进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是6.5的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.09g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在22℃条件下培养6天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为6.5的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.02g，牛肉膏0.9g，蛋白胨0.04g，硝酸铵0.02g，硫酸镁0.07g；60ml的培养基，在102℃条件下，灭菌38分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的7％，在24℃，转速220r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.05g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00008g，在转化温度为29℃，转化时间为9小时，即得组合物。

实施例19：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2207进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是6.5的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.09g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在22℃条件下培养6天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为6.5的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.02g，牛肉膏0.9g，蛋白胨0.04g，硝酸铵0.02g，硫酸镁0.07g；60ml的培养基，在102℃条件下，灭菌38分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的7％，在24℃，转速220r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.05g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00008g，在转化温度为29℃，转化时间为9小时，即得组合物。

实施例20：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2136进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是6.5的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.09g；在110℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在22℃条件下培养6天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为6.5的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.02g，牛肉膏0.9g，蛋白胨0.04g，硝酸铵0.02g，硫酸镁0.07g；60ml的培养基，在102℃条件下，灭菌38分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的7％，在24℃，转速220r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.05g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00008g，在转化温度为29℃，转化时间为9小时，即得组合物。

实施例21：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2078进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7.5的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.04g；在108℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在37℃条件下培养4天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为7.5的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.08g，牛肉膏0.05g，蛋白胨0.03g，硝酸铵0.04g，硫酸镁0.02g；70ml的培养基，在117℃条件下，灭菌24分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的7％，在36℃，转速105r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00004g，在转化温度为34℃，转化时间为43小时，即得组合物。

实施例22：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2388进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7.5的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.04g；在108℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在37℃条件下培养4天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为7.5的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.08g，牛肉膏0.05g，蛋白胨0.03g，硝酸铵0.04g，硫酸镁0.02g；70ml的培养基，在117℃条件下，灭菌24分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的7％，在36℃，转速105r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00004g，在转化温度为34℃，转化时间为43小时，即得组合物。

实施例23：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2436进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7.5的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.04g；在108℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在37℃条件下培养4天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为7.5的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.08g，牛肉膏0.05g，蛋白胨0.03g，硝酸铵0.04g，硫酸镁0.02g；70ml的培养基，在117℃条件下，灭菌24分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的7％，在36℃，转速105r/min条件下进行发酵，培养3天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00004g，在转化温度为34℃，转化时间为43小时，即得组合物。

实施例24：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2400进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.04g；在116℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在34℃条件下培养3天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为8的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.05g，牛肉膏0.01g，蛋白胨0.06g，硝酸铵0.04g，硫酸镁0.02g；100ml的培养基，在108℃条件下，灭菌21分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的10％，在30℃，转速105r/min条件下进行发酵，培养5天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00004g，在转化温度为40℃，转化时间为25小时，即得组合物。

实施例25：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2308进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.04g；在116℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在34℃条件下培养3天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为8的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.05g，牛肉膏0.01g，蛋白胨0.06g，硝酸铵0.04g，硫酸镁0.02g；100ml的培养基，在108℃条件下，灭菌21分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的10％，在30℃，转速105r/min条件下进行发酵，培养5天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00004g，在转化温度为40℃，转化时间为25小时，即得组合物。

实施例26：普伐他汀钠的组合物液体发酵

斜面菌种培养：选CICC2348进行菌种培养，将琼脂加入4度的麦芽汁，制得Ph是7的培养基，使得每ml培养基含琼脂0.04g；在116℃条件下灭菌，灭菌后冷却，制得斜面并接种，在34℃条件下培养3天，作为斜面菌种；液体发酵：将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制得pH为8的培养基，使得每ml培养基含葡萄糖0.05g，牛肉膏0.01g，蛋白胨0.06g，硝酸铵0.04g，硫酸镁0.02g；100ml的培养基，在108℃条件下，灭菌21分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的10％，在30℃，转速105r/min条件下进行发酵，培养5天，作为液体发酵培养液；底物的制备：用水溶液溶解普伐他汀钠，制成的溶液每ml含普伐他汀钠0.1g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物；酶反应：利用液体发酵培养液作为酶源，将底物添加到液体发酵培养液中，至每ml发酵培养液中含底物0.00004g，在转化温度为40℃，转化时间为25小时，即得组合物。