一种培育猪生长激素表达量增强的转基因动物的方法

摘要

本发明公开了一种培育猪生长激素表达量增强的转基因动物的方法。本发明还公开了培育转基因胚胎的方法，是将如下1)或2)的重组表达载体导入目的胚胎中，得到猪生长激素表达量高于所述目的胚胎的转基因胚胎：1)TRE-GH和TET-ON；2)TRE-GH-TET-ON，其中TRE-GH是将序列表中序列2所示的DNA片段插入TRE载体的多克隆位点构成的重组表达载体，所述TRE载体是将序列表中序列1所示的DNA片段插入pUC19质粒的多克隆位点构成的重组载体；TRE-GH-TET-ON是将Nhel和HindIII双酶切TET-ON得到2.5Kb大小的片段与Nhel和HindIII双酶切TRE-GH得到的3.3KB大小的片段连接，得到的重组表达载体。将该胚胎移植至动物中即可获得转基因动物。实验证明加DOX后转基因猪血液内GH急剧增加。

说明书

技术领域

本发明涉及一种培育猪生长激素表达量增强的转基因动物的方法。

背景技术

上世纪70年代，Jaenich等将SV40的DNA导入小鼠囊胚，并在子代小鼠组织中检测到了SV40 DNA，证明了外源性基因导入胚胎细胞并实现整合是可能的，上世纪80年代，Gordon等又建立了显微注射转基因动物技术。此后，该技术迅速发展，先后出现了多种建立转基因动物的方法，其应用渗透到多个研究领域，成为人们深入了解生物的遗传物质、研究基因功能、建立人类疾病的动物模型以研究疾病的诊断与治疗的一个有力工具。虽然转基因动物具有诱人的应用前景，但早期得到的转基因阳性动物，转入基因在胚胎早期即得到持续性表达，无法保证转基因表达的组织和/或发育阶段特异性，当所研究的基因对胚胎发育具有毒性或致死作用时，胚胎在发育早期即发生死亡，致使后续研究无法进行。因而，要实现转基因动物的应用价值，实现转基因表达的阶段及组织特异性就成为一个关键问题。为此，人们在深入了解生物基因调控机制的基础上，构建出一系列可调控转基因表达的系统，使所转基因可按研究者的意愿以时空特异的方式进行表达。目前存在的调控系统很多，其中研究较多、应用最为广泛的是四环素调控系统(简称tet调控系统)。将该系统用于制备转基因家畜(猪、牛及羊)能在家畜体内实现定时表达外源基因，可以实现外源基因在家畜体内的定时整合，为制备能随时调控外源基因表达转基因家畜的一种新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培育猪生长激素表达量增强的转基因胚胎的方法。

本发明提供的培育猪生长激素表达量增强的转基因胚胎的方法，是将如下1)或2)的重组表达载体导入目的胚胎中，得到猪生长激素表达量高于所述目的胚胎的转基因胚胎：

1)TRE-GH和TET-ON；

2)TRE-GH-TET-ON，

其中，TRE-GH是将序列表中序列2所示的DNA片段插入TRE载体的多克隆位点构成的重组表达载体，所述TRE载体是将序列表中序列1所示的DNA片段插入pUC19质粒的多克隆位点构成的重组载体；

TRE-GH-TET-ON是将Nhel和HindIII双酶切TET-ON得到2.5Kb大小的片段与Nhel和HindIII双酶切TRE-GH得到的3.3KB大小的片段连接，得到的重组表达载体。

TET-ON载体是pTet-On-Advanced的简称，购自clontech公司，货号630930。

上述胚胎为原核期胚胎。

上述胚胎可以是除人以外的任何一种动物的胚胎，具体可为猪、牛、羊、猫、狗、兔或鼠的胚胎。

本发明的另一目的在于提供一种培育猪生长激素表达量增强的转基因动物的方法。

本发明提供的培育转基因动物的方法，是将上述的方法制备的转基因胚胎移植到雌性的目的动物的体内，得到猪生长激素表达量高于所述目的动物的转基因动物。

上述目的动物为除人以外的任何一种动物，具体可为猪、牛、羊、猫、狗、兔或鼠。

实验证明：4号，22号，37号，55号转基因猪在加DOX前血液中GH的表达值分别为36，32，40，34，而加DOX后血液中GH的表达值分别为225，318，265，423，加DOX后转基因猪血液内GH急剧增加。结果表明分开型四环素诱导系统及整合型四环素诱导系统均能有效制备转基因家畜。

附图说明

图1：TRE-GH质粒图谱。

图2：胚胎水平诱导GH的表达。

图3：TRE-GH和TET-ON转基因猪基因组DNA的PCR检测，M为100bp ladder DNAmark；1-23为制备的待检测后代猪；+为阳性对照(以TRE-GH质粒、TET-ON为模板)。

图4：半定量检测转TRE-GH和TET-ON基因猪以及转TRE-GH-TET-ON基因猪中rtTA的表达，M为100bp ladder DNA mark、1、4、7、11、13、15、18、19、22为转TRE-GH和TET-ON基因猪；37、38、39、43、48、49、52、55、57、58为转TRE-GH-TET-ON基因猪；Y1、Y2、Y3、Y4为非转基因猪；K为空白对照(以水为模板扩增)。

图5：TRE-GH-TET-ON图谱。

图6：TRE-GH-TET-ON转基因猪基因组DNA的PCR检测(M为100bp ladder DNAmark；1-23为制备的待检测后代猪；+为阳性对照(以TRE-GH-TET-ON为模板))。

图7：强力霉素(DOX)诱导正常猪及转基因猪GH的表达，22、37、4、55表示不同的转基因猪未经强力霉素处理的GH表达；22+DOX、37+DOX等表示不同的猪经强力霉素处理后的GH表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、转基因胚胎的获得

一、重组表达载体的获得

1、线性化的TRE-GH和TET-ON的获得

合成含TRE启动子，多克隆位点及SV40 polyA的DNA片段(命名为TRE-MSC-SV40 polyA基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，北京奥科生物技术有限公司合成)。上述合成的DNA片段在95℃10分钟，立即置于冰水中，处理后用ZraI.(购自NEB公司，货号R0659L)及PciI(购自NEB公司，货号R0655L)双酶切后备用；pUC19质粒(购自宝生物，货号FD3219)ZraI.及PciI双酶切后和前述TRE-MSC-SV40polyA片段进行连接(连接酶购自promega公司，货号M1804)；按公司要求操作步骤转化DH5α(购自北京全式金公司，货号CD201)感受态大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37℃培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序(invitrogen北京公司)；选取测序结果正确的载体(命名为TRE载体)备用。

提取猪(大白猪品系，购自唐山市新基源种猪有限公司)耳静脉血，按照试剂盒操作程序提取总RNA(购自百泰克，货号RP4002)；按照试剂盒操作程序将总RNA反转录成cDNA(购自TOYOBO公司，货号TRT-101)以表1中列举的扩增GH的引物扩增猪生长激素基因(GH)片段(核苷酸序列如序列表中序列2)。反应体系为反应体系为50μl，5μL 10×Buffer、8μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物GH cDNA-L1、1μL 20μM引物GH-R1(序列见表1)、0.5μL 5U/μL高保真Tag聚合酶，100ng猪cDNA为模板，加超纯水至50μL(高保真酶购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩增程序：98℃10s，68℃2min，循环30次。

PCR扩增产物送公司测序(invitrogen北京公司)正确后PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)，用KpnI、MluI双酶切纯化产物；同时用KpnI、MluI双酶切上述制备的TRE载体；将PCR扩增产物和酶切后的载体连接、转化(操作步骤及试剂同前)，挑取单菌落送公司测序，选取测序正确的载体(命名为TRE-GH)备用(载体图件图1)。

本发明中TET-ON载体购自clontech公司，货号630930。

上述两质粒TET-ON和TRE-GH载体进行质粒去内毒素大提(购自OMEGA公司，货号：D6948)，质粒提取后，ScaI(购自Fermanta公司，货号：ER0431)酶切线性化后按照说明书对基因纯化回收(购自QIAGEN公司，货号：12562)，至此得到线性化的TRE-GH和TET-ON。

2、TRE-GH-TET-ON(见图5)的获得

线性化的TRE-GH-TET-ON载体的构建：将TET-ON载体用NheI(购自NEB公司，货号：R0131S)和HindIII(购自NEB公司，货号：R0104V)双酶切，胶回收2.5Kb大小处的条带；同时用NheI和HindIII双酶切步骤1中的TRE-GH载体，回收3.3Kb大小处的条带，和上述回收的片段进行连接、转化(操作步骤及试剂同前)。挑单菌落，质粒小提试剂盒进行质粒提取(购自百泰克公司，货号DP1002)NheI、HindIII双酶切鉴定重组质粒。选取酶切以及测序鉴定结果和预期一致的重组质粒，进行质粒去内毒素大提，质粒提取后，ScaI酶切线性化后按照说明书对基因纯化回收，得到线性化的TRE-GH-TET-ON载体。

二、转基因胚胎的获得

1、线性化的TRE-GH和TET-ON注射胚胎

通过传统原核期胚胎显微注射法注射将含有线性化的TRE-GH和TET-ON(摩尔比为1∶1)的混合液到原核期猪(大白猪品系)胚胎原核内，在NCSU 23培养基中(购自millipore公司，货号MR-182-D)培养至8细胞期。

取正常胚胎及显微注射双基因的胚胎，在NCSU 23培养液中加入600ng/ml的强力霉素(DOX)，36小时后以胚胎为模板按照ProtoScript M-MuLV Taq RT-PCR试剂盒(购自NEB公司，货号E6400S)操作说明(引物为表1所列举检测GH定量引物)，扩增反应为28个循环，将PCR产物取5微升进行1％琼脂糖凝胶电泳，通过比较电泳条带亮度来初步比较GH的表达水平。可见相比较正常胚胎的GH表达水平而言，显微注射双基因后的胚胎内3号和5号胚胎的GH表达水平在DOX诱导后有了极大提高(结果见图2，M：mark；1-10：为显微注射TRE-GH、TET-ON混合基因后加入强力霉素后的GH表达；11-20：为显微注射TRE-GH-TET-ON混合基因后加入DOX后的GH表达；21-24：正常胚胎加入DOX后的GH表达)。

2、线性化的TRE-GH-TET-ON注射胚胎

通过显微注射法将线性化的TRE-GH-TET-ON注射到原核期猪(大白猪品系)胚胎原核内，在NCSU 23培养基中(购自millipore公司，货号MR-182-D)培养至8细胞期。

取部分正常胚胎及显微注射的胚胎，在NCSU 23培养液中加入600ng/ml的DOX，36小时后以胚胎为模板按照ProtoScript M-MuLV Taq RT-PCR试剂盒(购自NEB公司，货号E6400S)操作说明(引物为表1所列举检测GH定量引物)，直接检测胚胎中GH的表达。可见相比较正常胚胎的GH表达水平而言，显微注射TRE-GH-TET-ON基因后的第12，17号胚胎内的GH在DOX诱导后有了极大提高(结果见图2，M：mark；1-10：为显微注射TRE-GH、TET-ON混合基因后加入强力霉素后的GH表达；11-20：为显微注射TRE-GH-TET-ON混合基因后加入DOX后的GH表达；21-24：正常胚胎加入DOX后的GH表达)。

实施例2、转基因动物的获得及其检测

一、转基因动物的获得

1、转TRE-GH和TET-ON基因猪

重复实施例1步骤二中步骤1，将线性化的TRE-GH和TET-ON注射原核期猪胚胎，培养至8细胞期。在体外通过阴道子宫颈移植到发情同步的母猪子宫角。

按照试剂盒操作说明(购自百泰克，货号：DP1901)提取转基因猪耳组织基因组DNA，经PCR筛选出同时整合有TRE-GH及TET-ON的猪。PCR反应体系为50μl，5μL 10×Buffer、8μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物PL、1μL 20μM引物PR、0.5μL 5U/μL高保真Tag聚合酶，加超纯水至50μL，以获得的猪基因组DNA为待检测模板，PCR扩增程序：95℃5min；94℃20s，退火温度56℃，72℃1m，循环30次，最后72℃延伸5min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出分别能扩增出TRE-GH基因及rt-TA基因的阳性猪(图3中的1、4、7、11、13、15、18、19和22)，两基因的检测引物见表1(检测引物分别是表1中rtTA：的rtTA-RTL1和rtTA-RTR1；TRE-GH：TRE-L1和TRE-L2)。

提取上述转基因阳性猪(1、4、7、11、13、15、18、19和22)的猪耳静脉采200微升血液，提取总RNA，反转录成cDNA(操作步骤及试剂同前)，以猪GAPDH基因为内参(引物为mGAPDH-L1和mGAPDH-R1)，进行半定量PCR测定rtTA的表达，PCR加样体系及反应体系同转基因检测rtTA(rtTA引物为表1所示的rtTA-RTL1和rtTA-RTR1)。将所筛选出能表达rtTA的转基因猪4号及22号进行转基因猪强力霉素诱导实验(图4)。

2、转TRE-GH-TET-ON基因猪

重复实施例1步骤二中步骤2，将线性化的TRE-GH和TET-ON注射原核期猪胚胎，培养至8细胞期。在体外通过阴道子宫颈移植到发情同步的母猪子宫角。

按照试剂盒操作说明提取转基因猪耳组织基因组DNA(试剂盒及操作步骤同前)，经PCR筛选出同时整合有TRE-GH-TET-ON基因的猪。PCR反应体系为50μl，5μL 10×Buffer、8μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物PL、1μL 20μM引物PR、0.5μL 5U/μL高保真Tag聚合酶，加超纯水至50μL，以获得的猪基因组DNA为待检测模板，PCR扩增程序：95℃5min；94℃20s，退火温度56℃，72℃1m，循环30次，最后72℃延伸5min(检测引物分别是表1中rtTA：的rtTA-RTL1和rtTA-RTR1；TRE-GH：TRE-L1和TRE-L2)。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出分别能扩增出TRE-GH基因及rt-TA基因的阳性猪(图6中的37、38、39、43、48、49、52、55、57和58)，两基因的检测引物见表1。

提取转基因阳性猪(37、38、39、43、48、49、52、55、57和58)的猪耳静脉采200微升血液，提取总RNA，反转录成cDNA(操作步骤及试剂同前)，以猪GAPDH基因为内参(引物为mGAPDH-L1和mGAPDH-R1)，进行半定量PCR测定rtTA的表达(图4)，PCR加样体系及反应体系同转基因检测rtTA(rtTA引物为表1所示的rtTA-RTL1和rtTA-RTR1)。将所筛选出能表达rtTA的转基因猪37号及55号进行转基因猪强力霉素诱导实验。

二、转基因猪进行强力霉素诱导实验

开展对上述鉴定的转基因猪(4号、22号、37号及55号)进行强力霉素诱导实验，在饮水中添加强力霉素(购自clontech公司，货号：631311终浓度600ng/毫升)，分别在加强力霉素之前及之后36小时，通过耳静脉采200微升血液，提取总RNA，反转录成cDNA(操作步骤及试剂同前)，以猪GAPDH基因为内参(引物为表1中的mGAPDH-L1和mGAPDH-R1)，进行实时荧光定量PCR测定GH(GH引物为表1所示的pGH-RTL1和pGH-RTR1)表达量，上样体系按照ABI定量试剂说明书上样，反应体系为20μl，10μL 2×Mixturer(TAKARA，货号DRR041A)、1μL 20μM上游引物、1μL 20μM下游引物、1微升cDNA，加超纯水至20μL。PCR扩增程序：95℃ 5min；94℃ 20s，退火温度56℃，72℃ 1m，循环40次，最后72℃延伸5min。三只正常猪在加强力霉素前生长激素表达值分别为21，18，20，加强力霉素DOX后血液中GH的表达值分别为25，22，22，加DOX前后血液中GH的表达无明显差异(P＜0.05)；4号，22号，37号，55号转基因猪在加DOX前血液中GH的表达值分别为36，32，40，34，而加DOX后血液中GH的表达值分别为225，318，265，423，加DOX后转基因猪血液内GH急剧增加(见图7)。结果表明分开型四环素诱导系统及整合型四环素诱导系统均能有效制备转基因家畜。

表1：本发明中用于扩增载体构件的引物

注：表中带*的序列中斜体字部分为kozak序列。

                            序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>一种培育猪生长激素表达量增强的转基因动物的方法

<130>CGGNARL102062

<160>2

<210>1

<211>792

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc  60

tttcgtcttc actcgagttt actccctatc agtgatagag aacgtatgtc gagtttactc  120

cctatcagtg atagagaacg atgtcgagtt tactccctat cagtgataga gaacgtatgt  180

cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag tttactccct atcagtgata  240

gagaacgtat gtcgagttta tccctatcag tgatagagaa cgtatgtcga gtttactccc  300

tatcagtgat agagaacgta tgtcgaggta ggcgtgtacg gtgggaggcc tatataagca  360

gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagaattcg agctcggtac ccggggatcc  420

tctagtcagc tgacgcgtgc tagcgcggcc gcatcgataa gcttgtcgac gatatctcta  480

gaggatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc  540

acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat  600

tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt  660

tttttcactg cctcgagctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg  720

gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa  780

cgcaggaaag aa                                                      792

<210>2

<211>657

<212>DNA

<213>猪(Sus serofa)

<400>2

ccaccatggc tgcaggccct cggacctccg tgctcctggc tttcgccctg ctctgcctgc    60

cctggactca ggaggtgggc gccttcccag ccatgccctt gtccagccta tttgccaacg    120

ccgtgctccg ggcccagcac ctgcaccaac tggctgccga cacctacaag gagtttgagc    180

gcgcctacat cccggaggga cagaggtact ccatccagaa cgcccaggct gccttctgct    240

tctcggagac catcccggcc cccacgggca aggacgaggc ccagcagaga tcggacgtgg    300

agctgctgcg cttctcgctg ctgctcatcc agtcgtggct cgggcccgtg cagttcctca    360

gcagggtctt caccaacagc ctggtgtttg gcacctcaga ccgcgtctac gagaagctga    420

aggacctgga ggagggcatc caggccctga tgcgggagct ggaggatggc agcccccggg    480

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cgctgcttaa gaactacggg ctgctctcct gcttcaagaa ggacctgcac aaggctgaga    600

catacctgcg ggtcatgaag tgtcgccgct tcgtggagag cagctgtgcc ttctagt       657