复合微生物制剂及其在作物秸秆的微生物降解中的应用

摘要

本发明涉及一种复合微生物制剂及其应用。本发明所述的复合微生物制剂是纤维素分解菌和表面活性剂配制而成，所述纤维素分解菌属于木霉属。将所述复合微生物制剂加入到鲜秸秆中，通过降解秸秆中的纤维素、木质素和半纤维素，增加秸秆的降解效率，从而缩短秸秆降解时间，促进秸秆还田，修复退化的土壤。

说明书

方法领域

本发明涉及一种复合微生物制剂，具体涉及一种由纤维素分解菌和表面活性剂组成的复合微生物菌剂，还涉及该复合微生物制剂在作物秸秆的微生物降解中的应用。

背景方法

加强能源资源节约和生态环境保护，增强可持续发展能力，关系到人民群众切身利益和中华民族生存发展。随着世界各国对全球气候的变化的重视以及能源危机的出现，各国联合讨论节污减排的需要，在这个背景下秸秆在能源化、肥料化、饲料化等方面都具有较大前景。

秸秆是一种生物质能资源，是当今世界上仅次于煤炭、石油和天然气的第四大能源，是唯一可再生的能源。但是我国秸秆资源45％～47％作为农村燃料，15％以烧荒形式烧掉，只有很少一部分过腹还田或直接还田。秸杆直接焚烧不仅污染环境，而且造成资源浪费。

利用微生物发酵降解秸秆是肥料化的优良途径，但是秸秆直接还田，存在很多具体问题，如秸杆利用率低，不易腐烂，影响下茬播种，容易浮出土面飘的到处都是等，还有报道表明秸秆直接还田更容易引起作物烂根和病害。秸秆间接还田技术是将作物秸秆堆腐沤制后还田，包括秸秆堆腐、高温堆腐、秸秆腐熟剂堆腐等形式；秸秆作基料生产食用菌，再将废渣还田以及沼肥还田等。

这些技术同样存在各种具体问题和不足，例如技术不成熟，效率不高，菌种不优良等。因此，为了修复退化的土壤，发展循环经济，实现可持续发展，必须研制一种高效优良的微生物菌剂。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明的目的在于研制一种复合的微生物菌剂，提高秸秆的降解效率，促进秸秆还田，以图修复退化的土壤。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种复合的微生物制剂，是由纤维素分解菌和表面活性剂按1∶2～2∶1的体积比配制而成。

其中，所述纤维素分解菌属于木霉(Trichoderma sp.)属丝状真菌，该菌株于2010年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为CGMCC No.3662，是通过如下方法制备得到的：将秸秆用土壤或者堆肥浸渍至接近腐烂，用酒精对接近腐烂秸秆进行表面灭菌后，剪成1～3cm长小片段，将半腐熟秸杆小片段用灭菌金属镊子转入装有25mL 95％乙醇的平板中，浸90s后取出转入新的灭菌平皿内侧，待表面酒精晾干(5～10min)后用灭菌金属镊子转入PDA固体培养基(土豆葡萄糖琼脂培养基，成品32-34g、琼脂粉8-10g)平皿中，用塑料薄膜密封平皿，将平皿顺置培养8d后倒置培养5～10d，在生长真菌菌落边缘挑取小块菌落，转入PDA固体培养基平皿中培养，若发现生长有杂菌，挑取菌落边缘转入新的装有PDA固体培养基的平皿中继续纯化，得到纤维素分解菌。

其中所述PDA固体培养基为：土豆葡萄糖琼脂培养基，成品32-34g、琼脂粉8-10g。

所述表面活性剂可以采用合成的表面活性剂或生物表面活性剂。所述合成的表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基磺酸钠、PEG6000、十二烷基苯磺酸钠、吐温等。所述生物表面活性剂是指由微生物、植物或动物产生的天然表面活性物质，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等，例如铜绿假单孢菌产生含鼠李糖的糖脂。所述表面活性剂起到的作用是提高了秸秆的可利用性。

在本发明优选的实施例中，所用的生物表面活性剂是由微生物产生的具有一定表面活性的两性物质，是从常年堆积的各种秸秆堆下面的土样和牛场的堆肥中，在低温培养条件下(5～10℃)，经过细菌富集培养、血平板划线初筛、蓝色凝胶平板法复筛而得到的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产生的，属于槐糖脂类。所述铜绿假单胞菌菌株于2010年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为CGMCC No.3661。

本发明所述复合微生物制剂的制备方法，是将按所述方法分离得到的纤维素分解菌和表面活性剂按适当比例混合配制而成。所述比例是按1∶2～2∶1的体积比配制。

本发明还提供所述复合微生物制剂用作秸秆降解的应用，是将复合微生物菌剂均匀地施在新鲜秸秆表面，复合微生物制剂的用量为新鲜秸秆重量的4～5％。该复合微生物制剂增加了秸秆的降解效率，缩短秸秆降解时间，从而促进秸秆快速还田，以利于修复退化的土壤。

复合微生物制剂及其在作物秸秆的微生物降解中的应用为秸秆快速还田提供了一种模式，提高了农业废弃物生产有机肥的转化效率，利于退化土壤的修复，增加了土壤肥力。经过试验测试，本发明的复合微生物制剂施于鲜秸秆上，与未加复合微生物制剂与秸秆对照相比较，土壤含水率高出15～20％，土壤细菌数量高出2～3倍，土壤溶磷菌的数量提高40～44％，土壤硝化细菌的数量提高3～4倍，作物根部长度提高25～30％，作物茎部长度提高30～34％，作物重量提高32～37％，苗期地上生物量提高45～55％。

附图说明

图1为耐冷菌菌株产生的生物表面活性剂的红外光谱鉴定图。

本发明所述纤维素分解菌属于木霉(Trichoderma sp.)属丝状真菌，该菌株于2010年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为CGMCC No.3662。所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株于2010年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为CGMCC No.3661

具体实施方式

下面进一步详述本发明。

本发明提供一种复合的微生物制剂，是由纤维素分解菌和表面活性剂按1∶2～2∶1的体积比配制而成。

其中，所述纤维素分解菌属于木霉属丝状真菌，该菌株于2010年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为CGMCC No.3662，是通过如下方法制备得到的：将秸秆用土壤或者堆肥浸渍至接近腐烂，用酒精对接近腐烂秸秆进行表面灭菌后，剪成1～3cm长小片段，将半腐熟秸杆小片段用灭菌金属镊子转入装有25mL 95％乙醇的平板中，浸90s后取出转入新的灭菌平皿内侧，待表面酒精晾干(5～10min)后用灭菌金属镊子转入PDA固体培养基(土豆葡萄糖琼脂培养基，成品32-34g、琼脂粉8-10g)平皿中，用塑料薄膜密封平皿，将平皿顺置培养8d后倒置培养5～10d，在生长真菌菌落边缘挑取小块菌落，转入PDA固体培养基平皿中培养，若发现生长有杂菌，挑取菌落边缘转入新的装有PDA固体培养基的平皿中继续纯化，得到纤维素分解菌。

所述表面活性剂可以采用合成的表面活性剂或生物表面活性剂。所述合成的表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基磺酸钠、PEG6000、十二烷基苯磺酸钠、吐温等。所述生物表面活性剂是指由微生物、植物或动物产生的天然表面活性物质。所述表面活性剂起到的作用是提高了秸秆的可利用性。

本发明提供一种生物表面活性剂，是从常年堆积的各种秸秆堆下面的土样和牛场的堆肥中，在低温培养条件下(5～10℃)，经过细菌富集培养、血平板划线初筛、蓝色凝胶平板法复筛，筛选出具有表面活性的菌株产生的，属于槐糖脂类。

菌株的筛选

①细菌富集培养

分别取5ml各种浓度(10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9g/ml)的土壤悬液，接种于细菌富集培养基，24℃震荡培养1～2d，转速200r/min得到富集液。

所述细菌富集培养基(XF)为：植物油4g，(NH₄)₂SO₄ 10g，KCl 1.1g，FeSO₄·7H₂O 2.5×10^-5g，KH₂PO₄ 3.4g，K₂HPO₄·3H₂O 5g，MgSO₄ 0.5g，EDTA1g，酵母浸膏0.5g，用蒸馏水定容至1L，pH值为7.0。

②血平板培养基初筛

将上述富集液在血平板培养基上划线培养，挑选产生溶血圈较大的菌株进行分离纯化，分离纯化的单菌落接于斜面培养基上，30℃培养1～2d。

所述血平板培养基(g/L)为：羊血8～10％，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，酵母粉0.01％，NaCl 0.5％，琼脂粉1.7％，pH 6～7，115℃灭菌15min。

所述斜面培养基：葡萄糖16g，蛋白胨4g，酵母浸膏0.2g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH值为6.5。

③蓝色凝胶培养基复筛

分别取5ml各种浓度(10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9g/ml)的土壤悬液，接种于前述富集培养基(XF)，24℃震荡培养1～2d，转速200r/min。将富集液稀释涂布于蓝色凝胶平板培养基，挑选菌落周围产生蓝圈的菌株进行分离纯化，分离纯化的单菌落接于前述斜面培养基上，30℃培养1～2d，将斜面培养的菌种转接于种子培养基中培养16h后，接种于摇瓶培养液中，30℃振荡培养2～3d，转速200r/min，从而得到所述铜绿假单胞菌。

所述蓝色凝胶平板培养基(g/L)为：牛肉膏1，葡萄糖20，蛋白胨5，酵母膏0.2，琼脂18，十六烷基三甲基溴化0.2，亚甲基蓝0.005。

所述种子培养基为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、用蒸馏水定容至1L，pH值为7.2。

④排油性的测定

将上述分离出的单菌株进行液体发酵培养(发酵培养基为葡萄糖20g/L，酵母膏1g/L，NH₄NO₃ 2.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，Na₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，无机盐溶液3mL/L，正十六烷2mL/L，pH7.0，其中无机盐溶液为硫酸锌0.029g/L，氯化钙0.024g/L，硫酸铜0.025g/L，硫酸镁0.017g/L)，将其发酵液分别在常温(25℃)和低温环境下(0～10℃)做排油性测定。即在一个玻璃平皿(D＝9cm)中加入60mL的蒸馏水，然后加入8mL的正十二烷，待正十二烷均匀分布于水面上后，在其表面加入1mL的发酵液，如果产生排油圈，则证明发酵液中存在生物表面活性剂，反之，则证明该发酵液中无生物表面活性剂。排油圈越大，说明排油性越好。选取排油性好(即其发酵液排油直径大于3cm)的菌株保留，继续进行下一步的发酵液表面张力的测定试验。

⑤发酵液表面张力的测定

将排油性好的菌株在前述发酵培养基中培养4～5天，对其发酵液的表面张力进行测定，用FD-NST-I液体表面张力系数测定仪测量其表面张力值，将发酵液表面张力值低于40mN/m的菌株保存，做细菌生理生化鉴定。

经过菌落形态观察和细菌生理生化鉴定，分别从九个指标进行鉴定：菌落形态观察、革兰氏染色试验、氧化/发酵型、甲基红(MR)试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、吲哚(靛基质)、枸橼酸盐利用试验(常量法)、试验接触酶试验，最终确定所筛选出的菌株属于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，该菌株于2010年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为CGMCC No.3661，同时也是耐冷菌，其发酵液在低温环境下(0～10℃)仍具有较低的表面张力(均小于35mN/m)。

结果表明，通过测定其发酵液表面张力值，得到优化后培养基成分及培养条件，培养基成分为：蔗糖30-31g/L，酵母膏1-1.1g/L，NH₄NO₃ 1-1.1g/L，Na₂HPO₄1-1.1g/L，液体石蜡5-6ml，无机盐溶液体积比浓度(v/v)为3-3.2％，接种量为5～7％，pH控制在6.8～7.2，温度35～37℃，培养时间为1-4d。

分离提取

从上述铜绿假单胞菌的发酵培养液中经一些适当的方法就能分离提取制得槐糖脂类，这些方法是常使用于提取代谢物的方法，例如可利用槐糖脂类与杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取。例如将35～37℃培养24h的发酵液，离心，收集絮状沉淀，得到粗品，再用二氯甲烷重新悬浮，过滤，抽提，离心，收集沉淀，即为纯化后的表面活性剂。

对耐冷菌菌株产生的生物表面活性剂进行红外光谱鉴定(如图1所示)，鉴定结果为耐冷菌菌株的代谢产物是槐糖脂类。

该生物表面活性剂可以将前述发酵液直接应用，或者将发酵液经分离纯化后应用。

下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1

将秸秆用土壤或者堆肥浸渍至接近腐烂，用酒精对接近腐烂秸秆进行表面灭菌后，剪成1～3cm长小片段，将半腐熟秸杆小片段用灭菌金属镊子转入装有25mL 95％乙醇的平板中，浸90s后取出转入新的灭菌平皿内侧，待表面酒精晾干(5～10min)后用灭菌金属镊子转入PDA固体培养基(土豆葡萄糖琼脂培养基，成品32-34g、琼脂粉8-10g)平皿中，用塑料薄膜密封平皿，将平皿顺置培养8d后倒置培养5～10d，在生长真菌菌落边缘挑取小块菌落，转入PDA固体培养基平皿中培养，若发现生长有杂菌，挑取菌落边缘转入新的装有PDA固体培养基的平皿中继续纯化，得到纤维素分解菌。

将非离子型表面活性剂PEG6000与纤维素分解菌按1∶1比例配成复合微生物菌剂，将复合微生物菌剂施于鲜秸秆上，复合微生物制剂的用量为新鲜秸秆重量的4％。秋季收获时将混有复合微生物菌剂的鲜秸秆施于地里，以不施菌剂和秸秆为对照。第二年春天种上作物，按常规进行田间作业。

经过试验测试，本发明的复合微生物制剂施于鲜秸秆上，与未加复合微生物制剂与秸秆对照相比较，土壤含水率高出15％，土壤细菌数量高出2倍，土壤溶磷菌的数量提高40％，土壤硝化细菌的数量提高3倍，作物根部长度提高25％，作物茎部长度提高30％，作物重量提高32％，苗期地上生物量提高45％。

实施例2

按照实施例1的方法得到纤维素分解菌。

将铜绿假单孢菌产生含鼠李糖的糖脂与纤维素分解菌按2∶1比例配成复合微生物菌剂，将复合微生物菌剂施于鲜秸秆上，复合微生物制剂的用量为新鲜秸秆重量的4.5％。秋季收获时将混有复合微生物菌剂的鲜秸秆施于地里，以不施菌剂和秸秆为对照。第二年春天种上作物，按常规进行田间作业。

经过试验测试，本发明的复合微生物制剂施于鲜秸秆上，与未加复合微生物制剂与秸秆对照相比较，土壤含水率高出18％，土壤细菌数量高出2.5倍，土壤溶磷菌的数量提高42％，土壤硝化细菌的数量提高3.5倍，作物根部长度提高27％，作物茎部长度提高32％，作物重量提高34％，苗期地上生物量提高50％。

实施例3

按照实施例1的方法得到纤维素分解菌。

将按照前述方法筛选出的铜绿假单胞菌(保藏编号为CGMCC No.3661)进行发酵培养，培养基成分为：蔗糖30-31g/L，酵母膏1-1.1g/L，NH₄NO₃ 1-1.1g/L，Na₂HPO₄ 1-1.1g/L，液体石蜡5-6ml，无机盐溶液体积比浓度(v/v)为3-3.2％，接种量为5-7％，pH控制在6.8-7.2，温度35～37℃，培养时间为1-4d，得到所述生物表面活性剂发酵液。

将上述生物表面活性剂发酵液与纤维素分解菌按1∶2体积比例配成复合微生物菌剂，将复合微生物菌剂施于鲜秸秆上，复合微生物制剂的用量为新鲜秸秆重量的5％。秋季收获时将混有复合微生物菌剂的鲜秸秆施于地里，以不施菌剂和秸秆为对照。第二年春天种上作物，按常规进行田间作业。

经过试验测试，本发明的复合微生物制剂施于鲜秸秆上，与未加复合微生物制剂与秸秆对照相比较，土壤含水率高出20％，土壤细菌数量高出3倍，土壤溶磷菌的数量提高44％，土壤硝化细菌的数量提高4倍，作物根部长度提高30％，作物茎部长度提高34％，作物重量提高37％，苗期地上生物量提高55％。