紫色叶脉融合基因及其作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用

摘要

一种紫色叶脉融合基因及其作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用，具体地说本发明利用拟南芥叶脉特异性的VS启动子与番茄花氰苷合成途径的调节基因构建了融合基因，将其命名为PL2基因，其核酸序列如序列表1所示。该融合基因可以作为一种可视筛选标记基因，在植物转基因技术中代替抗生素抗性基因等传统筛选标记基因，以转化芽具有紫色叶脉为特征进行转基因植物的筛选。与传统的抗性筛选标记相比，具有可视、稳定、持久等优点。此外，在带有该可视标记的转基因品种推广使用后，可以紫色叶脉为标记进行转基因植物和非转基因植物的区分，将大幅降低转基因植物环境安全检测的成本。本发明还提供了该融合基因应用于微型番茄转化的实施例。

说明书

【技术领域】：本发明属于植物基因工程领域，具体地说是用拟南芥的叶脉特异性VS启动子与番茄花氰苷合成途径的调节基因构建PL2融合基因及其作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用。

【背景技术】：植物转基因技术是利用重组DNA技术将克隆的优良目的基因导入植物细胞或组织，并在其中进行表达，从而使植物获得新的性状。转基因作物可提高农作物的产量，提高植物中有益成分的含量，改变植物的颜色，减少除草剂、杀虫剂等农药的使用量等，并节省大量人力，因而给人类社会带来了巨大的经济和社会效益。但同时转基因植物的安全性也在全球范围内引起了激烈的争论与普遍关注，其中由于目前的转基因技术常通过使用抗抗生素类或抗除草剂类选择性筛选标记来进行转基因植物的筛选，这些选择性筛选标记基因最终会与目的基因一同整合到植物的基因组中，成为影响转基因植物安全性的主要因素之一。解决转基因植物中抗性标记基因安全性问题有两个途径：(1)转化时仍使用抗性标记基因，获得转基因植物以后，再将其基因组中的抗性标记基因删除。但这种方法步骤繁琐、获得无标记转基因植株的周期较长；(2)发展安全性标记基因用于植物遗传转化，而利用颜色作为安全性可视筛选标记将是一个很有前景的研究方向。另一方面，各国在世界贸易活动中为保证本国经济利益不被侵害，对转基因植物及产品的检测是必不可少的。同样，在对转基因生物安全管理过程中，是否发生基因漂移等是生态环境安全检测的一个重要方面。目前这些方面的检测多使用转基因成分分析方法，主要有DNA检测法和蛋白质检测法两类(杨建霞，2004)。此外，基因芯片技术已开始应用于转基因植物的检测。而这些方法无疑都需要投入较大的人力物力成本。如果能在转基因植物中引入安全、持久、可视的筛选标记，将可以利用显著可视的性状直接区分转基因和非转基因植物，以及判断是否发生基因漂移等，将可以大大降低转基因生物安全检测的投入和成本。

在整个植物界几乎所有的植物的叶片都表现出绿色，而花和果实则呈现出五颜六色，这和植物的叶片、花、果实中的色素成分以及含量不同有关，叶绿素在叶片中占主导地位，而在花和果实中，花氰苷的含量远远超过叶绿素，从而赋予植物花和果实各种各样的颜色。花氰苷是花青素与各种单糖结合而形成的黄酮多酚类化合物。它是植物合成的一类次生代谢物，能控制植物从红到紫甚至是蓝的一系列变化，主要积累在植物表皮细胞的液泡内。前期研究表明，一些转录调节因子对植物花氰苷的合成具有调控作用。例如：Elomaa等(Elomaa et al.，2003)将大丁草转录调节因子基因GMYB10置于CaMV35S启动子之下转入烟草中，转基因植株径、叶、花萼、花粉囊、子房壁均较对照积累大量花色素苷，颜色发生改变。Quattrocchio等(Quattrocchio et al.，1999)将玉米的C1和Lc基因转入矮牵牛之后，得到红色的愈伤组织和粉红色花冠。这些结果表明花氰苷合成的控制因子可以异源发挥对花氰苷合成的调控作用。

组织或器官特异性启动子能够调控目的基因在特定的组织或器官表达，在植物基因工程技术中，可以利用组织或器官特异性启动子有针对性地、特异、高效地调控目的基因的表达。叶脉位于植物地上部的叶片内，由贯穿在叶肉内的维管组织组成，是叶的输导和支持结构。我们设想：如果获得能够驱动目的基因在叶脉中特异性表达的启动子，在植物基因工程技术中利用此类启动子有针对性地在叶脉中特异性表达导致或促进花氰苷合成的关键基因，则可以将因花氰苷的特异性积累所呈现的叶脉颜色变化特征(如紫色叶脉)，作为植物转基因技术中的一种可视性筛选标记。据此建立的新型植物转化技术体系，不但能够解决传统的筛选标记可能给转基因植物带来的安全性问题，还可以把这种可视的筛选标记应用于转基因植物的环境安全等检测工作中，以是否具有有色叶脉作为转基因和非转基因植物的区分标记，简单易行，将大大降低转基因植物检测的成本，势必在转基因植物新品种的实际应用过程中发挥巨大作用。

此外，花氰苷属于类黄酮类化合物，也属于多酚类物质，具有很强的清除氧自由基、抗氧化功能(林晓霞等，2005)，具有提高植物抗逆性的作用。同时，花氰苷作为一种天然抗氧化成分物质，也是人类食品与健康研究中的热点。大量的流行病学研究证明食物中的花氰苷对人类许多疾病有预防和治疗作用，例如研究证明花色素苷有降低冠状动脉心脏病发病率的作用(丁锐，2004)；又如：在番茄果实中特异性表达金鱼草的花氰苷合成调控基因Del和ROS1，可以使番茄果实内积累高水平的花氰苷，以这种积累花氰苷的紫色番茄饲喂易患癌小鼠(Trp53-/-)，能够显著延长小鼠的生命(Butelli et al.，2008)。因此，适度积累花氰苷还可以提高转基因植物产品的品质和经济价值。

综上所述，基于花氰苷积累调控所产生的可视性颜色变化，无论作为植物转化过程中的一种安全性筛选标记还是作为一种转基因植物的可视检测标记，都具有很高的开发和应用价值。同时又可以使转基因植物体内积累一定量的抗氧化成分-花氰苷，达到了一举三得的理想结果。

【发明内容】：本发明目的是利用拟南芥的叶脉特异性VS启动子和番茄花氰苷合成途径的调节基因构建融合基因，用作植物转基因技术中的可视性筛选标记基因。

本发明所述的叶脉特异性启动子(vein-specific promoter)，简称VS启动子是我们以一个拟南芥多器官表达基因的启动子改造创制的一种维管束特异性启动子，它能驱动目的基因在不同植物的叶脉中特异性表达。本发明利用该启动子驱动控制花氰苷合成的相关基因在叶脉中特异性表达，使转基因植物的叶脉呈现出紫色。利用本发明提供的融合基因进行植物转化时，可以紫色叶脉作为转基因植物的筛选标记，使转基因植物的筛选达到了可视化，与传统的抗生素抗性筛选方法相比，具有操作简便、低成本、安全可视，且无需进行后续的标记删除等优点，对于解决传统的抗性标记基因可能带来的潜在的安全性问题具有重要意义。同时由于VS启动子的活性在叶片发育过程中特异、稳定、持久，其驱动叶脉中花氰苷的合成具有稳定性，不会随叶龄的增加而消减，在植物生长发育的大部分时期都可以利用是否具有紫色叶脉作为转基因和非转基因植物的区分标记。这将为转基因植物推广种植过程中的环境安全检测带来极大的便利，工作人员可以直接从植物叶脉的颜色来判断出是否是转基因植物，这无疑将节省大量的人力、物力和财力，大大降低了转基因植物检测的成本。

本发明提供了一种新的紫色叶脉融合基因，其核酸序列如序列表1所示。本发明是利用拟南芥的叶脉特异性启动子简称VS启动子和番茄花氰苷合成途径调节基因构建而成，将其命名为PL2融合基因(来自purple leaf首字母)。本发明还包括与上述核酸序列有85％以上的同源性的核酸分子。

利用本发明所述方法，还可以将任意叶脉或维管束特异性启动子与导致或促进紫色产生的功能基因融合，获得可使转基因植物产生紫色叶脉的融合基因。

本发明同时提供了一种所述的紫色叶脉融合基因作为可视的安全筛选标记基因在植物转基因技术中的应用，即：利用该融合基因作为可视筛选标记基因进行植物转化，可使转基因植物的叶脉呈现紫色，将其作为可视筛选标记，可获得阳性的转基因植物。同时，是否具有紫色叶脉也可以作为转基因和非转基因植物的可视区分标记，大幅度降低对转基因植物环境安全检测相关的检测成本。

作为具体应用的实例，本发明提供了这种紫色叶脉融合基因的一种构建方法以及作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用。操作过程如下：

所述应用中的PL2融合基因的构建方法，包括如下步骤：

第一、以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增VS启动子部分，回收扩增产物并进行TA克隆；

第二、用Kpn I/Bgl II双酶切上述第一步所获得的含有VS启动子的TA克隆质粒和pCAMBIA1301质粒，分别回收启动子片段和大的载体片段；

第三、将上述两个片段混合，在连接酶催化下进行连接反应，获得中间构建“VS启动子-GUS”融合基因；

第四、以番茄基因组DNA为模板，用PCR方法扩增PL2融合基因结构基因部分，回收扩增产物并进行TA克隆；

第五、用Sal I/BstE II双酶切上述第四步所获得的含有PL2融合基因结构基因的TA克隆质粒和上述第三步所获得的含有“VS启动子-GUS”融合基因的中间构建质粒，分别回收该结构基因片段和大的载体片段；

第六、将上述上述第五步回收的两个片段混合，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司，是目前常用的商品化载体)载体上的PL2融合基因的构建。

其中所设计的VS启动子部分的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入Kpn I酶切位点，下游引物引入BglII和SalI酶切位点：

上游引物：5’-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3’

下游引物：5’-AGATCTGTCGACATTTGCTGTGTCAATTCTCACTTC-3’

所设计的PL2融合基因结构基因部分的PCR扩增引物如下，上游引物引入Sal I酶切位点，下游引物引入BstE II酶切位点：

上游引物：5’-GTCGACCATGAACAGTACATCTATGTCTTCAT-3’

下游引物：5’-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’

所述应用中的PL2融合基因在植物转基因技术中的应用，操作过程如下：

用PL2融合基因转化微型番茄Micro-Tom：用普通YEP液体培养基培养带有PL2融合基因的农杆菌，至OD₆₀₀为1.0左右离心收集菌体，然后用同体积的液体MS培养基(含100mmol/L乙酰丁香酮)重新悬浮菌体；取微型番茄Micro-Tom无菌幼苗的叶片，在上述菌液中侵染10分钟，然后放至共培养培养基上暗培养2天；将上述外植体移至脱菌培养基上光照培养3天，移至不定芽分化培养基上，诱导生芽，利用紫色叶脉作为可视标记筛选出阳性芽；当阳性芽长至约2厘米高时转入不定根分化培养基上培养，诱导生根；将生根较好的植物移土培养至开花结实。

本发明的优点和积极效果：

本发明利用拟南芥的VS启动子与番茄花氰苷合成途径的调节基因构建了PL2融合基因；将该融合基因转化植物，以紫色叶脉作为可视标记，筛选出阳性转基因植株，并且此紫色叶脉的表型在转基因植株的生长发育过程中稳定持久。该融合基因与传统的抗抗生素或抗除草剂等抗性基因相比，具有安全、可视的优点，与传统的安全性标记基因相比，具有持久、稳定的优点。该融合基因作为安全可视的筛选标记基因应用于植物转基因技术中，不仅避免了使用传统选择标记基因可能带来的食品安全和环境安全等方面的潜在危险，而且避免了使用常用的安全性标记基因可能出现的不稳定、易沉默等问题，使转基因植物的检测更加方便、快捷。将紫色叶脉作为可视标记应用于转基因植物环境安全等检测工作中，还可以大大降低检测的成本。因此，本发明必将为植物转基因技术的实际应用提供强有力的支持。

【附图说明】：

图1是PL2融合基因在微型番茄转化过程中的应用，目的基因为潮霉素抗性基因hpt。图1a：转化后诱导生芽阶段，具有紫色叶脉的转化芽在含潮霉素的生芽培养基上旺盛生长；图1b：具有紫色叶脉的转化芽经持续生长、诱导生根后的生长情况；图1c：具有紫色叶脉的转化芽经诱导生根后移土生长初期，转基因植株的叶片叶脉紫色清晰可见；图1d：野生型诱导芽(非转化芽)只能在不含潮霉素的生芽培养基上生长，可以看到非转化芽不具有紫色叶脉的表型；图1e：转基因植株移土生长后期，可以观察到由具有紫色叶脉的转化芽长成的转基因植株在土培生长过程中，紫色持续存在于叶脉，植株生长发育正常。图1f：野生型植株移土后的生长情况，不具有紫色叶脉的表型。

图2是PL2融合基因转基因微型番茄植株的PCR鉴定；泳道M：plus2000Marker；泳道1：用野生型番茄的基因组DNA为模板的负对照；泳道2-5：PL2融合基因转基因番茄植株的基因组DNA为模板的PCR产物。泳道6：PL2融合基因质粒为模板的PCR的正对照；泳道7：H₂O为模板的PCR的负对照。

【具体实施方式】：

实施例1：PL2融合基因的VS启动子的克隆

第一、以拟南芥基因组DNA为模板利用PCR方法扩增1109bp的VS启动子，回收扩增产物并进行TA克隆。

(1)PCR扩增目的片段

根据拟南芥的VS启动子区的序列设计特异引物，在上游引物中引入Kpn I酶切位点，在下游引物中引入BglII和SalI酶切位点。

上游引物：5’GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3’(引入Kpn I切点)

下游引物：5’-AGATCTGTCGACATTTGCTGTGTCAATTCTCACTTC-3’(引入BglII和SalI切点)

按常规方法提取拟南芥基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备VS启动子片段。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

94℃5分钟；

94℃30秒，60℃1分30秒，30个循环；

72℃10分钟；

4℃保温。

(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

①目的片段的回收

通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，回收方法采用大连宝生物(TaKaRa)公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。

②连接

加入下列反应体系的试剂，16℃反应过夜，实现目的片段与pGEM-T-Easy(购自Promega公司)载体的连接。

③转化和阳性克隆的鉴定

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，用10μL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp、X-gal和IPTG的平板上，37℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用Kpn I和Bal II双酶切，产生3kb的pGEM-T-Easy载体片段和包含PL2融合基因的VS启动子的1109bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生1109bp的VS启动子片段，即为含有该启动子序列的阳性克隆。

④测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌穿刺培养物到Sangon(上海生工生物技术有限公司)进行DNA测序。

实施例2：以实施例1所克隆的VS启动子替代pCAMBIA 1301载体上的CaMV 35S启动子，获得中间构建“VS启动子-GUS”融合基因

(1)从大肠杆菌中提取载体质粒pCAMBIA 1301(购自CAMBIA公司)，用Kpn I/Bgl II双酶切后回收大的载体片段(其中包含有GUS报告基因序列)。

(2)从实施例1所制备的TA克隆中提取质粒，用Kpn I/Bgl II双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收(同实施例1)VS启动子片段。

(3)将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA 1301载体上的“VS启动子-GUS”融合基因构建。

连接体系：

(4)用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例1。

(5)挑选转化平板(Kan抗性)上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用Kpn I和BstE II双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是8979bp的pCAMBIA 1301载体片段，另一个是3179bp的“VS启动子-GUS”融合基因。

(6)以质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的“VS启动子-GUS”融合基因，扩增片段的大小是1405bp。所用引物如下：

上游引物：5’-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3’

下游引物：5’-TCG CGATCC AGACTGAAT GCC-3’

(7)经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。

实施例3：PL2融合基因的结构基因的克隆

根据番茄花氰苷合成途径调节基因cDNA的序列信息设计特异引物，在5’端分别引入Sal I和BstE II酶切位点，PCR产物的大小应是825bp。

上游引物：5’-GTCGACCATGAACAGTACATCTATGTCTTCAT-3’

下游引物：5’-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’

按常规方法提取番茄基因组DNA，以基因组DNA为模板，用PCR方法扩增PL2融合基因的结构基因，然后用pUCm-T载体进行TA克隆。PCR反应体系、反应条件、目的片段的回收、克隆和测序，同实施例1。

实施例4：在pCAMBIA1301载体上构建PL2融合基因

(1)提取实施例2制备的含有“VS启动子-GUS”融合基因的质粒，用SalI/BstEII双酶切后回收大的载体片段(其中不含有GUS报告基因序列)。

(2)从实施例3所制备的TA克隆中提取质粒，用Sal I/BstE II双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收(同实施例1)PL2融合基因结构基因片段。

(3)将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA 1301载体上的PL2融合基因构建。连接体系及转化大肠杆菌的方法同实施例2。

(4)挑选转化平板(Kan抗性)上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用Kpn I和BstE II双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是8979bp的pCAMBIA 1301载体片段，另一个是1933bp的PL2融合基因。

(6)以质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的PL2融合基因，扩增片段的大小是1933bp。所用引物如下：

上游引物：5’-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3’

下游引物：5’-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’

(7)经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序，其核酸序列如序列表1所示。

(8)从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌LBA4404，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例5：PL2融合基因在微型番茄转化过程中的应用

(1)以实施例4制备的PL2融合基因转化微型番茄Micro-Tom，以pCAMBIA1301载体上所带有的潮霉素抗性基因hpt为转化的目的基因，检测PL2融合基因作为可视筛选标记基因的可行性和实用性。具体转化方法采用农杆菌介导的遗传转化方法(Meissner，1997)，转化过程中既有具有紫色叶脉的芽产生，也有不具有紫色叶脉的芽产生，但是经过10mg/L潮霉素抗性筛选后，不具有紫色叶脉的芽全部被筛死，而具有紫色叶脉的芽全部具有潮霉素抗性，能在含潮霉素抗性培养基上持续旺盛生长(图1a)，说明为hpt基因的转化芽。将这些具有紫色叶脉的转化芽诱导生根(图1b)，随后移土培养至开花结实。可以观察到由具有紫色叶脉的转化芽长成的转基因植株在土培生长过程中，叶脉紫色持续存在，植株生长发育正常(图1c和1e)。

(2)转基因植株的PCR检测：分别剪取转基因植株和野生型植株的叶片，参考《分子克隆实验指南(第三版)》(黄培堂等，2002)方法提取叶片基因组DNA，用如下引物进行PCR反应，反应体系同实施例1：

上游引物：5’-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3’

下游引物：5’-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’

然后PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，转基因植株出现1933bp的PL2融合基因条带，非转基因植株未出现融合基因条带，证明目的片段已整合到植物基因组中(见图2)

(3)PL2融合基因在转基因微型番茄的生长发育过程中持续表达

被含有PL2融合基因的农杆菌侵染的微型番茄外植体在诱导生芽培养基上，既有具有紫色叶脉的芽产生，也有不具有紫色叶脉的芽产生，但是经过抗生素筛选后，不具有紫色叶脉的芽全部被筛死，而具有紫色叶脉的芽全部是有抗性的，具有紫色叶脉的芽被诱导生根后，叶脉的紫色略有减弱但仍清晰可见(图1b)，移土后植株生长发育正常，成熟叶片的叶脉呈现稳定的淡紫色(图1c和1e)。这充分证明了用带有PL2融合基因的载体转化植物时，以紫色叶脉作为转基因植物的可视筛选标记的可行性和实用性。

本发明利用拟南芥的叶脉特异性VS启动子与番茄花氰苷合成途径的调节基因构建了PL2融合基因；以PL2融合基因作为植物转化的可视筛选标记基因，与传统的安全性标记基因相比，具有持久、稳定的优点。该融合基因作为安全可视的筛选标记，不仅避免了使用传统选择标记可能带来的食品安全和环境安全等方面的潜在危险，而且避免了使用常用的安全性标记可能出现的不稳定、易沉默等问题，使转基因植物的检测更加方便、快捷。将紫色叶脉作为可视标记应用于转基因植物环境安全等检测工作中，还可以大大降低检测的成本。因此，本发明必将为植物转基因技术的实际应用提供强有力的支持。

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