抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体及其用途

摘要

本发明公开了抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体及其用途。本发明分泌抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株的微生物保藏号是CGMCC No.3543。通过EL1SA和Western-blot方法鉴定证明：本发明单克隆抗体与马传染性贫血病毒、马动脉炎病毒、正常鸡胚尿囊液均无交叉反应，本发明H3N8/10的腹水ELISA效价为1∶1.6×10

说明书

技术领域

本发明涉及马流感病毒单克隆抗体，尤其涉及抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及该单克隆抗体在检测或防治马A型流感病毒的用途，属于马流感病毒单克隆抗体领域。

背景技术

马流行性感冒(Equine influenza，EI)简称马流感，是由正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属(Influenzavirus)马A型流感病毒(EIV)引起马属动物的一种急性暴发式流行的传染病。国际上根据流感病毒的H和N的不同，将H分成15个型，N有8个亚型。感染马的只有两种亚型：马甲I型和马甲II型，分别属于H7N7和H3N8亚型。

与其它流感病毒一样，马A型流感病毒传播迅速，常呈爆发性流行，给养马业和赛马业均带来了一定的损失。因此，若能适时进行快速诊断，查明病原，在流行初期即能检测出马体是否感染了EIV，从而为快速处置预案或早期预防治疗提供诊断依据，能够最大限度地减少经济损失。为此，研制出EIV H3N8亚型特异性的单克隆抗体可以为马流感病毒的诊断或防治奠定重要基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株分泌抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明目的之二获得由该杂交瘤细胞株所分泌的H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体；

本发明目的之三是将上述H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体应用于制备成检测或防治马流行性感冒病毒的试剂或药物。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株分泌抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是CGMCC No：3543；保藏日期是：2009年12月23日；分类命名是：杂交瘤细胞；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明以蔗糖密度梯度离心方法纯化H3N8亚型马流感病毒，分别免疫Balb/C小鼠后取脾细胞与SP2/0融合，制备了一株分泌抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

通过EL1SA和Western-blot方法鉴定证明H3N8/10单抗与马传染性贫血病毒(EIAV)、马动脉炎病毒(EAV)、正常鸡胚尿囊液均无交叉反应，H3N8/10的腹水ELISA效价为1∶1.6×10⁴。本发明成功的制备了抗H3N8亚型单克隆抗体，可将其应用于EIV的抗原性分析、血清学诊断、疫苗质量监测及流行病学调查等方面。

附图说明

图1本发明EIV H3N8亚型单克隆抗体的Western bolt分析；1：Marker；2：H3N8病毒；3：EIAV对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1分泌抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1.材料和方法

1.1实验材料

1.1.1主要试剂

HAT、HT选择培养基、HRP-羊抗鼠IgG、弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品；PEG(MW，3350)为Solarbio公司产品；国产优级胎牛血清购自天津颧洋生物工程公司；所用其他化学试剂均为分析纯。羊抗鼠IgG荧光抗体，购自北京中山生物技术有限公司，用前以0.01％伊文思蓝0.01mol/l pH 7.2PBS液稀释成所需要的浓度。

1.1.2细胞、实验动物、毒株与血清

马流感病毒A/equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)及其标准阳性血清由本发明人实验室保存。SP2/0骨髓瘤细胞为本发明人实验室冻存。雌性BALB/c小鼠和昆明白鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2实验方法

1.2.1病毒A/equine/Xinjiang/3/2007的复壮与纯化

1.2.1.1尿囊腔接种病毒

将种毒A/equine/Xinjiang/3/2007接种于9日龄SPF鸡胚100个，将尿囊液收集到一起，用于超离，具体方法如下：

(1)选用9日龄发育良好的鸡胚，照蛋标出气室及胚胎位置，在气室底边胚胎附近无大血管处标出尿囊腔注射部位。

(2)气室向上放置鸡胚于卵架上，在气室及标记处先后用酒精棉球消毒蛋壳表面。

(3)在所标记注射部位用剪刀尖端打孔，注意用力要稳，恰好使蛋壳打通而不伤及壳膜。为防止注射接种物时因胚胎内产生压力而使接种物溢出，可在气室顶端也打一小孔。

(4)用1毫升注射器抽取接种物，针头斜面(与卵壳成30°角)刺入注射部位3～5毫米达尿囊腔内，注入接种物。一般接种量为0.1～0.2毫升。

(5)另一种接种方法是只开一小孔，在距气室底边0.5厘米处的卵壳上打一个孔，由此孔进针注射接种物。

(6)注射完毕，用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔和气室孔。气室朝上于35～37℃温箱中孵育。弃去24小时内的死亡鸡胚，因多系机械损伤、细菌或霉菌污染等非特异性因素所引起，以后每天检卵1～2次。

(7)检视出的死鸡胚、孵育48～72小时的活鸡胚(某些病毒并不收获活鸡胚，应弃之)，取出置4℃冰箱过夜或-20℃冰箱中1小时，以免收获时流血。

(8)取出冷却的鸡胚，气室端卵壳表面用碘酊和酒精棉球消毒，用镊子无菌击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜，以眼科镊子镊住绒毛尿囊膜，用毛细吸管或吸管吸取尿囊液和羊水，置无菌容器中保存备用(低温冰箱冻结保存)。一般能收获尿囊液6毫升左右，最多可达10毫升。

(9)标记，-20℃保存。

1.2.1.2病毒的纯化

取含病毒的尿囊液，经反复冻融两次后，4℃，4000r/min离心20min，充分去除残渣，收集病毒上清，然后以高速离心机38000r/min离心60min，取沉淀用DEPC水融解。

制备20％、30％、40％、50％、60％的蔗糖溶液，进行蔗糖连续密度梯度离心纯化流感病毒，取沉淀用DEPC水融解，-70℃保存备用。

1.2.1.3纯化结果的测定

测定流感病毒的血凝价与蛋白含量。测血凝价用常规的HA方法。测蛋白含量将纯化好的病毒溶于10mL灭菌PBS中，用751G分光光度计测其280nm，260nm波长处吸光度，计算其蛋白含量，-20℃保存，用于制备EIV单抗。

蛋白质浓度(mg/mL)＝1.45OD280nm-0.74OD260nm

1.2.2动物免疫

1.2.2.1实验动物

与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8-12周。

1.2.2.2免疫方法

第一次免疫将抗原与弗氏佐剂等量进行乳化，给每只小鼠腹部皮下多点注射抗原0.1mL，2周后改用弗氏不完全佐剂进行免疫，免疫后五周左右，从尾部采血测抗体效价(ELISA法)，选择效价高的小鼠休息2～3周，准备融合，在融合前三天，再加强免疫，将抗原50～100ug用PBS稀释成0.2mL，经腹腔注射。

表1  Balb/C小鼠的免疫方案

1.2.3检测方法的建立

1.2.3.1阳性对照血清的制备

三免后10d，对免疫小鼠断尾采血，分离血清，进行ELISA实验，一方面进行检测方法的建立，另一方面选取结果在1∶3 200以上的并且效价最高的小鼠准备进行融合实验，此小鼠在融合前，眼球取血，分离血清，作为阳性对照血清。

1.2.3.2间接ELISA检测方法的抗原包被最佳浓度与对照血清最佳稀释度的确定

按常规间接ELISA操作步骤，运用棋盘滴定试验确定抗原最佳包被量、血清最佳工作浓度以及判定标准。将纯化的EIV抗原用包被液分别做50、100、200、400、800倍稀释后包被酶标板，待检血清和阴性血清分别按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400…倍比稀释。

常规间接ELISA具体操作步骤如下：

(1)抗原包被：将纯化的EIV用包被液按一定稀释倍数稀释，酶标板每孔各加100μL，37℃一个小时后，4℃包被过夜，用含0.5％Tween 20的PBST洗液洗涤3次，每次摇床震荡3min。

(2)封闭：加入封闭液(5％脱脂奶粉)200μL，37℃封闭2h，再用PBST洗液洗涤3次。

(3)一抗：待检抗体稀释一定倍数后取100μL加到酶标板中，阴性、阳性及空白对照用PBS做一定倍数稀释后各取100μL加入到酶标板中，作好记录。37℃孵育1h，再用PBST洗液洗涤3次。

(4)二抗(HRP-羊抗鼠IgG)：取HRP-羊抗鼠IgG二抗用PBS以按其使用浓度稀释，混匀，每孔加100μL，37℃湿盒孵育1h，用PBST洗液洗涤3次。

(5)显色：底物显色液A与B等体积混匀，每孔加100μL，于37℃孵育1h。

(6)终止：用终止液(2mol/L H₂SO₄)每孔各加50μL，37℃终止15min。

(7)酶标仪测OD值：设置酶标仪单波长、450nm，测光吸收值。

(8)分析：阴性对照＜0.2，阳性对照1.0左右。当样品的P/N值≥2.1时判定为阳性，P/N＜1.5时判定为阴性。

1.2.4细胞融合

1.2.4.1小鼠骨髓瘤细胞的培养

采用的骨髓瘤细胞为SP2/0，本试验室有保存，实验前几天进行复苏，传代。用于融合的骨髓瘤细胞通常为传代后的第二天进入对数生长期，收集此时期的细胞。

1.2.4.2制作饲养层细胞

(1)拉颈处死小鼠(小鼠饿2～3天，使其腹膜与大肠脱离，易于抽取)；

(2)75％酒精浸泡消毒10分钟；

(3)将小鼠固定在自制解剖台上，用手术剪将小鼠腹部剪开一个小口，剥开皮肤，露出腹腔(注意不要把腹膜弄破)；

(4)在培养皿中倒入50mLHAT培养液，用注射器将4mL培养液注入腹腔，小心反复抽取腹腔液体；

(5)将抽取的液体加到HAT培养液中，吹匀；

(6)分装到5块96孔板中，每孔加100μL；

(7)封口并进行标记，保存到37℃CO₂培养箱中培养。

1.2.4.3免疫脾细胞的制备

(1)摘眼球取血，制备抗原，将血滴入EP管中，立刻横放于4℃冰箱中

(2)拉颈处死小鼠

(3)75％酒精浸泡消毒10min

(4)无菌条件下剪开小鼠腹腔，取出脾脏，(脾脏位于小鼠左侧，呈淡黑红色，取时尽量剔除周围的脂肪和结缔组织，但不要弄破大肠以免污染)

(5)将脾脏移入另一盛有20mL基础培养液的平皿内，用针头将脾脏一端刺孔，另一端固定，用一次性无菌注射器吸取10mL基础培养液，从脾脏一端缓慢注入，使液体从脾脏另一端针孔流出，重复多次，直至脾脏呈透明状。

(6)将平皿中脾细胞悬液转移到50mL离心管中，1 000r/min离心10min，备用。

1.2.4.4细胞融合

(1)取来两个大瓶(250mL细胞培养瓶)的SP2/0，用20mL基础培养液将细胞吹打下来，然后将液体转移到50mL离心管中，1000r/min离心10min，弃上清；

(2)将离心后的脾细胞上清倒掉，用10mL基础培养液将脾细胞悬起，加入到装有SP2/0的离心管中，混匀，1000r/min离心10min，弃上清；

(3)轻敲离心管底部，使沉淀流动，把沉淀管放入37℃水浴烧杯中(在装有42℃水的水槽中内部放置一个装有37℃水的烧杯)，使其达到融合温度；

(4)加预热至37℃的50％PEG1mL，用1mL吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼可见有颗粒出现，滴加过程不超过1min，先慢后快；

(5)逐滴加入15mL不含血清的DMEM培养液，边加边摇，滴加过程不超过2min，先慢后快，使PEG稀释而失去促融作用；

(6)室温以1000r/min离心10min，使细胞沉淀，弃上清；

(7)加入含20％FBS的预热的HAT培养液50mL；

(8)混匀，分装到96孔板中，封口并进行标记，保存到5％CO₂饱和湿度37℃培养箱中培养；

(9)培养3天后，进行观察，记录有融合的培养孔，跟踪观察，适当换液，使用含HAT的完全DMEM培养液；

(10)在15天左右，吸取上清，检查抗体。

1.2.5杂交瘤细胞的筛选

用ELISA法检测阳性克隆，设置的阳性对照为：免疫小鼠的血清；阴性对照为：SP2/0细胞培养上清液。杂交瘤细胞生长孔内的上清液为一抗；酶标记羊抗鼠IgG为二抗。

2实验结果

2.1病毒增殖与纯化

约700mL繁殖种毒收获的SPF鸡胚尿囊液的HA效价为：2⁸。尿囊液经差速离心去除残渣后，超速离心获取病毒沉淀，蔗糖密度梯度离心纯化，取40％与60％蔗糖梯度之间的白色病毒层，PBS稀释经超速离心沉淀后，得到3mL乳白色已纯化的病毒悬液HA效价为：2²¹。

分光光度计测定尿囊液蔗糖密度梯度超速离心后的病毒浓度为1.928mg/mL。此纯化的病毒作为免疫原和筛选原。

2.2ELISA检测方法的建立

将纯化的EIV抗原按照1∶100、1∶200、1∶400倍比稀释后包被ELISA平板，与1∶100、1∶200、1∶400倍比稀释的阴阳性血清做方阵试验，确定抗原的最佳包被浓度及阴阳性血清的最佳稀释倍数，结果见表2。

表2  原和阴阳性血清最佳稀释度的确定

*：(+)表示阳性血清，(-)表示阴性血清

最佳包被量和最佳血清稀释度的判定标准为：阳性血清OD492值接近1.0，阴性血清OD492＜0.2，P/N≥2.1，最终确定EIV抗原以1∶200倍稀释为最佳包被浓度，阴阳性血清的最佳稀释度为1∶6400。EIV抗原最佳包被条件是37℃包被1小时，4℃过夜包被；阴阳性血清和酶标二抗最佳反应条件是37℃孵育1h；底物最佳反应条件和作用时间为37℃ 15min。

2.3杂交瘤细胞株的建立

用50％PEG-1500做融合剂，采用传统的融合方法将免疫小鼠脾细胞和处于指数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，每次培养5块96孔细胞培养板。进行了两次细胞融合，融合率如表3所示：

表3  两次细胞融合结果

融合后第四天，可见由单个杂交瘤细胞分裂5～7个不等的细胞集落，进行半换液；融合后第八天，可见融合细胞克隆集落长至孔底1/7～1/5，然后进行全换液，当融合细胞长至孔底的1/3时，用建立的ELISA进行检测，对检测结果呈阳性的杂交瘤细胞集落经过有限稀释法进行三次克隆。经检测和筛选最终获得了1株能够稳定分泌抗EIV的单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为：H3N8/10。

试验例1  抗H3N8亚型的单克隆抗体的制备及性能检测

1.试验方法

1.1抗H3N8亚型的单克隆抗体的制备

1.1.1有限稀释法克隆杂交瘤细胞

(1)在已检测过的96孔培养板内将待克隆的孔做好标记；

(2)用吸管吹打孔内的细胞使其散开，从孔内吸出0.1mL细胞悬液到1mL杂交瘤细胞培养液中计数；

(3)初次克隆时用HT培养液，调整杂交瘤细胞密度到3～10个/mL，每块96孔培养板内为10mL(第二、三次克隆可改用杂交瘤细胞培养液)；

(4)将调好密度的细胞悬液加到含饲养细胞的96孔板内，每个孔加0.1mL；

(5)将96孔培养板置5％CO₂饱和湿度37℃培养箱中培养；

(6)第四天用新的培养液置换孔内1/2上清液；

(7)第四天至第九天当孔底细胞集落在1～2mm大小时，吸出杂交瘤细胞生长孔的上清液，按抗体筛选方法检测上清液中的抗体，计算杂交瘤细胞的阳性孔比率(阳性孔数/杂交细胞生长孔数*100％)；

(8)将抗体阳性的孔内细胞移到24孔培养板扩大培养2～4d；

(9)按步骤1～7，将扩大培养后的阳性细胞在重复克隆2～3次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％为止，孔内的细胞即为克隆化后的杂交瘤细胞；

(10)将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养后，以1 000r/min离心5min，收集上清液作阳性克隆鉴定，冻存沉淀的细胞备用；

1.1.2腹水的制备

(1)取10只BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0.5mL/只。

(2)经10～14天后，将杂交瘤细胞吹打下来，1 000r/min离心10min，弃去上清，用5mLDMEM营养液悬浮计数。

(3)每只小鼠腹腔接种细胞10⁶个。

(4)经7～10天后，可见小鼠腹部膨大，采集腹水。

(5)将腹水3 000r/min离心10min，收集上清，-20℃保存备用。

1.2腹水效价的测定

用间接ELISA方法进行测定。

1.3单克隆抗体的特异性分析

主要是比较各种单克隆抗体与其他非免疫原间的交叉反应性。交叉反应性越少者，单克隆抗体的特异性越好。

实验用间接ELISA法：将无关抗原马传染性贫血病毒(EIAV)、马动脉炎病毒(EAV)及正常鸡胚尿囊液包被96孔酶标板(10ug/mL)，封闭后，每孔加阳性杂交瘤细胞培养上清液(100μL/孔)，以免疫小鼠阳性血清为阳性对照，DMEM为阴性对照，37℃孵育1h，充分洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体100μL/孔，37℃孵育1h，TMB100μL/孔显色15min，2M H₂SO₄50μL/孔终止反应，终止反应后于波长450nm测定OD值。P/N≥2.1者为阳性，反之阴性。

1.4杂交瘤细胞的稳定性测定

将杂交瘤细胞连续培养传代20代，每隔5代检测1次细胞培养上清液ELISA抗体效价，以正常培养液为阴性对照，在连续传代过程中定期进行冻存和复苏，用ELISA检测复苏后细胞培养上清液的效价。

1.5单克隆抗体的热稳定测定

将产生的腹水McAb分别置于37℃，22℃及4℃放置两周，每隔1d测定一次腹水效价，以-20℃保存的腹水作阳性对照，以正常的鼠血清作阴性对照。

1.6 Western Blot分析

首先对纯化的EIV，马传贫病毒(EIAV)进行SDS-PAGE电泳，然后以H3N8/10单抗为一抗，HRP标记兔抗鼠IgG为二抗进行Western blot分析。

2.试验结果

2.1腹水的制备与效价测定

小鼠接种杂交瘤细胞后，第7天可见腹部略为膨大，小鼠行动缓慢，第8天用注射器抽吸腹水，每只小鼠可收集2～3mL腹水，离心后上清液呈淡黄色。ELISA效价为：1∶1.6×10⁴。

2.2单抗的特异性分析

单克隆抗体与马传染性贫血病毒(EIAV)、马动脉炎病毒(EAV)及正常鸡胚尿囊液做ELISA实验，结果均为阴性，说明H3N8/10与三者无免疫交叉反应，具有较好的免疫原性。

2.3抗体分泌稳定性测定

杂交瘤细胞经体外连续传代3个月后，仍具有稳定分泌抗体的能力，ELISA效价不低于1∶1.0×10⁴。

2.4水热稳定性测定

腹水单抗分别在37℃，22℃及4℃放置两周后，分别测定其效价，均可保持原来的效价，其效价与一20℃对照无差别，腹水单抗的稳定性好。

2.5 Western bolt分析结果

以A/Equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)马流感病毒为抗原，制备单克隆抗体，WB结果表明得到了特异性良好的单抗，试验结果见图1。