一种具有生物活性的硼酸盐玻璃抗菌涂层的制备方法及其应用

摘要

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具有生物活性的硼酸盐玻璃抗菌涂层的制备方法及其应用。其制备步骤如下：制备含有灭菌离子的硼酸盐玻璃，将玻璃粉碎筛分；将上述玻璃粉均匀涂覆至植入器材表面，然后经过热处理，使玻璃粉具有黏性，形成覆盖在植入器材表面上的抗菌涂层。该工艺设备简单，容易操作，成本低廉。本发明的涂层具有抗菌性及生物活性，能牢固地涂覆在植入器材表面，能有效改良现有植入材料的生物活性及抗菌性能。

说明书

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具有生物活性的硼酸盐玻璃抗菌涂层的制备方法及其应用。

背景技术

钛合金(Ti6A14V)由于其优良的力学性能和生物相容性，被广泛的用作承重植入材料，例如接骨板。此类材料的缺点是与人体骨没有直接的键合，而且由于钒元素的存在，使得具有一定的毒性。同时，以接骨板为例，目前治疗骨折的主要方法就是植入接骨板从而进行骨折内固定术。然而，骨折内固定术存在大量术后感染的情况，根据文献报道，其感染率约为5％～20％。其中钉道感染更会造成螺钉松动等严重的后果，给病患带来巨大痛苦。

可见，以目前的接骨板为例，很多种类的植入器材是存在明显的缺陷的。它们通常不具有抗菌性，不能完全适应手术的要求，人们迫切需要对其改进。

发明内容

本发明的目的在克服上述不足，提供一种能具有生物活性及抗菌性能的硼酸盐玻璃涂层的制备方法。

本发明提出的具有生物活性及抗菌性能的硼酸盐玻璃涂层的制备方法，具体步骤如下：

(1)向硼酸盐玻璃中加入含有灭菌离子的盐类，研磨混合均匀之后，采用高温熔融法制得玻璃块；将所得含有灭菌离子的玻璃块粉碎筛分得到粒径均一、平均粒径小于50um的玻璃粉；所述灭菌离子为重金属离子，为银离子、锌离子或铜离子中任一种；灭菌离子的加入量为硼酸盐玻璃质量的0.1wt％-15wt％；所述硼酸盐玻璃网络形成体为B₂O₃，不含或少量含SiO₂/或含P₂O₅，其中B₂O₃含量大于SiO₂/P₂O₅含量，网络形成体的总分子比例为30～90mol％；网络外体含有CaO，并还含有Na₂O、K₂O碱金属氧化物以及MgO，SrO碱土金属氧化物；网络外体离子氧化物的总分子比例为5～80mol％；其中CaO和SrO的分子比例各为5～60mol％；

(2)通过超声振荡将步骤(1)所得玻璃粉均匀分散在溶剂中，然后随着溶剂的挥发，玻璃粉便沉积在植入器材表面；或采用喷涂法，将含有玻璃粉的粘结剂喷涂在植入器材表面；或采用提拉法，将含有玻璃粉的粘结剂粘附在植入器材表面；

(3)将步骤(2)已经沉积了玻璃粉末或黏附了玻璃粉末的植入器材放进马弗炉中，在350-400℃温度下烧烬粘结剂，在600～1000℃下保温2-30min，即得所需抗菌涂层。

利用本发明方法得到具有生物活性及抗菌性能的硼酸盐玻璃涂层在骨修复植入体上的应用。

利用本发明方法得到具有生物活性及抗菌性能的硼酸盐玻璃涂层在刺激骨细胞生长上的应用。

利用本发明方法得到具有生物活性及抗菌性能的硼酸盐玻璃涂层在动物体内的应用。

本发明于可以通过玻璃粉的用量来调节所得涂层的厚度，从而调节涂层中灭菌离子的含量。通过热处理的温度及时间来调节所得涂层与植入器材的结合强度。通过灭菌离子的掺入量或玻璃载体的组成来调节所得涂层中灭菌离子的释放速度，从而调节的涂层的生物活性及抗菌效果。通过玻璃粉的组成，各种氧化物的比例能调节玻璃涂层的生物活性和生物降解性，以及对骨细胞生长的刺激作用。

本发明采用离子灭菌的方法，结合了传统植入器材优良的力学性能和硼酸盐玻璃良好的生物活性和特殊结构，以及灭菌离子，例如银离子，其抗菌效率高、对人体危害小、抗菌谱广的优点，工艺设备简单，容易操作，成本低廉，能有效减少手术中由细菌引起的病症，同时应用于骨修复植入体上，有明显的刺激骨细胞生长作用。

附图说明

图1.含银硼酸盐玻璃涂层的接骨板的细胞相容性测试，通过MTT比色法测量其对成骨细胞影响的结果，说明玻璃涂层具有良好的生物相容性。

图2含银硼酸盐玻璃涂层的接骨板的细胞刺激骨细胞生长的测试，通过碱性磷酸酶(ALP)法测其细胞增殖数量，说明玻璃涂层具有优异的生物活性，能刺激骨细胞生长。

图3含银硼酸盐玻璃涂层的接骨板埋入兔子胫骨附近10周后，接骨板表面形成物的物相分析，提示表明在接骨板上已形成了骨组织的无机矿物组成，羟基磷灰石。说明该接骨板具有刺激骨细胞生长的功能。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。

实施例1含银硼酸盐玻璃涂层的制备

(一)含银量1.0％的硼酸盐玻璃的制备

分别称取2.926g无水碳酸钠，7.107g无水碳酸钾，4.995g碱式碳酸镁，10.294g碳酸钙，5.694g碳酸锶，6.951g二氧化硅，29.473g硼酸，3.419g磷酸二氢钠，0.529g磷酸银。研磨后，充分混合，得到原始配料。

将配料装入铂金坩埚后，放入1150℃中保温120min，然后将所得的澄清玻璃液倒在已预热的钢板上得到玻璃块。

将玻璃块粉碎筛分，得到平均粒径在2-50um左右的玻璃颗粒。

(二)涂层的制备采用下述方法中任一种：

(1)把步骤(一)中所得的玻璃颗粒洗净干燥之后，称取0.15g装入100ml小烧杯中。

将同样洗净的接骨板放在烧杯底部，然后量取10ml无水乙醇倒入小烧杯中。

通过超声振荡15min使得玻璃粉均匀得分散在乙醇中，然后将烧杯放入80℃烘箱中过夜干燥，得到表面均匀沉淀了一层玻璃粉的接骨板。

将上述接骨板放入600℃马弗炉中，保温20min中后取出，得到分布均匀的玻璃涂层。

(2)将步骤(一)中所得的玻璃颗粒洗净干燥后，称取4.0g装入100ml小烧杯中。量取20ml乙醇，称取1.2g乙基纤维素。搅拌均匀后一起倒入球磨罐中球磨30min，制成浆料。

然后将洗净的接骨板浸渍在浆料中，以1cm/min的速度从浆料中提拉出来，风干之后，得到表面均匀黏附了一层玻璃粉的接骨板。

将上述接骨板放入马弗炉中，以2.5℃/min的速率随炉升温至460℃，保温1h，然后以10℃/min速率升温至660℃，保温15min，从炉中取出，得到分布均匀的玻璃涂层。

(3)将步骤(一)中所得的玻璃颗粒洗净干燥后备用。将乙醇与水按照1∶3的比例混合，然后按照0.1g/ml的比例将玻璃粉加入溶液中，一同放入雾化箱中进行雾化，随后由载气携带经过喷头均匀地喷到接骨板表面，风干之后，得到表面均匀沉积了一层玻璃粉的接骨板。

将上述接骨板放入600℃马弗炉中，保温20min中后取出，得到分布均匀的玻璃涂层。

实施例2：含银硼酸盐玻璃涂层的涂层的抗菌性能

按照实施例1方法，在玻璃在配方中，分别加入0.265g，0.529g，0.794g，1.058g的磷酸银，分别制得含有AgO为0.5，1.0，1.5和2.0wt％的四种玻璃块，按照实施例2方法获得四种玻璃涂层块的浸提液。另置大肠杆菌ATCC259，金黄色葡萄球菌ATCC25923于试验前转种于血琼脂平板上，35℃孵育18h，然后在血平板上分别挑取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌2～3个菌落于肉汤，35℃卵育2h。用微量加样器取一定量的菌液依次加入由低浓度到高浓度排列的浸提液中，结果观察，无肉眼可见生长的最低浸提液浓度为其对该菌的抑菌性能(MIC)。将按一定比例稀释的一定量的菌液接种于2个血平板上，涂布35℃孵育18h。计算血平板上的菌落个数，取平均数计算最初接种菌量。菌落个数低于最初接种菌量的0.1％的最低浸提液浓度为其对该菌的杀(灭)菌能力(MBC)。

结果显示，抗菌硼酸盐玻璃涂层的抑菌性能要比基础玻璃灭菌能力强，不掺银或含银量较少基本上没有抗菌能力。含银量2％的涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌和杀菌效果都比较好，含银量1％和0.75％的涂层对大肠杆菌的抑菌效果比较明显，但对金黄色葡萄球菌的杀灭效果就差一些(见表1)。随着银含量的增加，灭菌效果显著增加。

表1银含量为1.5wt％时的灭菌效果对比

实施例3：含铜及含锌硼酸盐玻璃涂层的抑菌性能

按照实施例1所述的方法，在玻璃配方中，将磷酸银换成硫酸铜，分别添加6.818g，13.636g，20.454g CuSO4，分别制得三种铜含量不同的硼酸盐玻璃，并进而制得铜离子质量百分比为5％，10％，15％的含铜硼酸盐玻璃涂层。用同样方法，在玻璃配合料中分别添加氧化锌2.172g，4.344g，6.516g，用同样的方法制得三种锌离子质量百分比为5％，10％，15％的含锌硼酸盐玻璃涂层。

采用无菌培养皿中加入已灭菌的普通营养琼脂培养基，使之覆盖整个培养皿底部，厚约2.5mm，再均匀涂浓度为10⁷cfu/ml的大肠杆菌(Escherichia coli)菌液，形成菌液膜。裁取六块10*10*0.5mm³的接骨板，其中上表面分别已经涂覆上述六钟玻璃涂层，将其平放于皿中，37℃下培养24h，观察涂层样品周围细菌生长情况，测量抑菌圈。

结果显示，随着铜含量的增加，抑菌圈扩大，抑菌性能得到加强。含锌硼酸盐玻璃涂层的抑菌性能随着锌含量的增加也得到加强，规律与铜离子相似，但其抑菌性能略低于同样质量百分比含量的铜离子所得涂层(见表2)。

表2

  抗菌离子  添加量(质量百分比％)  抑菌圈直径(mm)  Cu²⁺  5  23  Cu²⁺  10  32  Cu²⁺  15  39  Zn²⁺  5  18  Zn²⁺  10  27  Zn²⁺  15  35

实施例4：抗菌硼酸盐玻璃涂层的生物相容性

按照实施例1方法，在配方中，分别加入0.397g，0.529g，1.058g的磷酸银，分别制得含有AgO为0.75，1.0和2.0wt％的三种玻璃涂层块，所得三种不同银含量的玻璃涂层块分别浸泡在乙醇中24小时，之后用去离子水清洗3次。然后按照1.25cm²表面积对应1ml溶液的比例将玻璃浸泡在DMEM细胞培养基或者α-MEM细胞培养基中。24小时后，去除玻璃块，得到三种玻璃的浸提液，并在其中补充体积比为10％的胎牛血清和1％的青链霉素。

然后在浸提液中引入MC3T3E1型成骨细胞，将细胞株以0.2ml/孔的密度种植至96孔的培养皿中。然后将成骨细胞培养在α-MEM培养基中，培养基中添加10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100ug/ml的链霉素。未添加玻璃浸提液的培养基作为对照组。所有细胞都培养在37℃下，5％CO₂环境中。经过24小时的培养，通过MTT比色法来评价细胞的生长情况。

结果显示随着硼酸盐玻璃中银含量的提高对细胞损害较大，而含银量1％及0.75％的硼酸盐玻璃浸提液对细胞的毒性较小，含银量2％的硼酸盐玻璃浸提液也在可承受的范围之内(见图1)。

实施例5：抗菌硼酸盐玻璃涂层的刺激骨细胞生长性能

按照实施例4制得银含量不同的三种硼酸盐玻璃，并获得三种相应的玻璃涂层块的浸提液。将MC3T3-E1型成骨细胞种在24孔培养皿中，培养在空白培养基或者添加了含银硼酸盐玻璃浸提液的培养基中。经过48小时的培养，用PBS清洗细胞两次，然后放置在500ul浓度为1％的Triton X-100磷酸缓冲液中，利用冻融循环(-80/37℃)将细胞溶解。等份的溶解液分别装在96孔的培养皿中利用分光光度法测量其ALP活性。

结果显示，加入了含银量分别为0％、0.75％、1.0％、2.0％的四组硼酸盐玻璃浸提液的α-MEM与空白的α-MEM培养基对成骨细胞性能造成的影响差别不大(见图2)。结果显示，此三种含银玻璃涂层块都具有优异的生物活性，能刺激骨细胞的增殖。

实施例6：抗菌硼酸盐玻璃涂层在动物体内的作用：

按照实施例1，取由沉降法制得涂有含氧化银1wt％的硼酸盐玻璃涂层接骨板(20x2x0.5mm)，埋入到10只兔子的胫骨的表面，然后在兔子的胫骨附近注入含有金黄色葡萄球菌ATCC25923乳浊溶液0.1毫升，制造含有细菌的动物模型。在接骨板埋入兔子的实验期间，10只兔子没有发现炎症症状。在10周以后从兔子体内取出埋入的接骨板，没有发现骨组织坏死迹象，说明接骨板涂层有抗菌功能；分离接骨板的表面形成物，进行XRD表面分析(见图3)，提示表明该表面形成物含有骨组织中无机矿物，羟基磷灰石，说明在兔子体内的接骨板对骨细胞生长有一定的刺激作用。