不同溶解氧条件下脱氮的铜绿假单胞菌菌株及其应用

摘要

本发明公开了不同溶解氧条件下脱氮的铜绿假单胞菌菌株及其应用，还公开了一种用于生物脱氮的微生物菌剂。本发明提供的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)HD4-2已于2010年1月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.3602。该菌株在缺氧、微好氧和好氧条件下能够去除氨氮，去除率在95％以上，同时没有亚硝氮和硝氮的积累，即可以独立完成生物脱氮的全过程，在实践中具有很高的潜在应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物脱氮领域，特别涉及不同溶解氧条件下脱氮的铜绿假单胞菌菌株及其应用，还涉及到一种用于生物脱氮的微生物菌剂。

背景技术

水体中的氮素包括无机氮和有机氮。无机氮包括氨氮、亚硝氮和硝氮；有机氮有尿素、氨基酸、蛋白质、核酸、尿酸、有机碱、氨基糖等含氮有机物。水体中的氮素污染不仅会导致水体的富营养化现象，还会危害生物及人类的生存。

与物理化学脱氮技术相比，生物脱氮技术成本低、无二次污染，因此在脱氮中得到了广泛的应用。传统的生物脱氮技术的理论基础是微生物作用下的硝化作用和反硝化作用，即在好氧环境下氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌将氨氮氧化为硝氮，再在缺氧或厌氧环境下由反硝化菌将硝氮还原为氮气。由于硝化菌群与反硝化菌群对溶解氧和营养物质的要求各异，硝化反应和反硝化反应在时间和空间上难以统一，必须序列式进行。传统的生物脱氮工艺在一定程度上消除了氮素污染，但也存在很多问题：(1)每氧化1g NH₄⁺-N将消耗7.14g碱度(以CaCO₃计)，导致pH值下降，需要加碱中和，增加了处理费用；(2)氨氮的氧当量是4.57g，在硝化过程中需要充分曝气，增加了动力费用；(3)反硝化过程需要外加碳源，增加了运行费用；(4)硝化菌群通常为自养菌，增殖速度慢，硝化效率低；(5)污泥回流和硝化液回流增加了系统的动力费用和运行费用。

为解决传统脱氮工艺存在的问题，脱氮的新理论与新技术的研究成为热点，诸多新型生物脱氮理论与技术先后问世，不仅弥补了传统脱氮技术的缺陷，也降低了脱氮成本、提高了脱氮效率。这些新型生物脱氮技术中以异养硝化现象和好氧反硝化现象最为突出。19世纪末和20世纪初，研究者在土壤的硝化过程中发现了异养硝化现象，随后陆续有学者报道异养硝化现象。目前发现的异养硝化细菌主要有反硝化假单胞菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、产碱杆菌、节杆菌、粪产杆菌等等。与此同时，Robertson和Kuenen在反硝化和除硫系统出水中首次分离出好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha，好氧反硝化现象随即成为人们研究的热点。目前分离出的好氧反硝化细菌主要有Pseudomonas sp.、Alcaligenes faecalis Pseudomonasnautical、Thaurea mechernichensis、Alcaligenes sp.、Microvirgula aerodenitrificans等。

随着研究的深入，人们发现一些好氧反硝化细菌同时具有异养硝化的能力，对好氧条件下的同步硝化反硝化作用进行了深入的解析。然而，对缺氧条件下的同步硝化反硝化作用却鲜有报道。本发明中的菌株能够同时在好氧和缺氧条件下实现同步硝化反硝化作用，这在理论和实践应用上都具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株用于不同溶解氧条件下脱氮的铜绿假单胞菌菌株及其应用。

该菌株能够在缺氧、微好氧和好氧条件下均能很好地去除氨氮，同时没有亚硝氮和硝氮的积累，即可以独立完成生物脱氮的全过程。

本发明提供的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)HD4-2已于2010年01月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.3602。

菌株HD4-2是在实验室已有的菌种研究基础上筛选到的一株革兰氏阴性细菌。在筛选的过程中，以菌株在不同的溶解氧条件下对总无机氮(氨氮、亚硝氮、硝氮的总和)的去除率为标准，选择总无机氮去除率最高的菌株为进一步研究的目的菌株。

菌株HD4-2革兰氏染色阴性，菌体呈杆状，无芽孢和荚膜；在平板上培养2d后，形成2-3mm的圆形菌落，白色，扁平，表面光滑，产生黄绿色色素；其16S rRNA具有如序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1055bp。

根据其形态特征和16S rRNA基因序列特征，鉴定菌株HD4-2为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

本发明的不同溶解氧条件下脱氮的铜绿假单胞菌菌株及其应用通过下述技术方案予以实现：

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2，其特征在于：其保藏号为：CGMCCNo.3602，保藏日期为：2010年1月21日。

如以上所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2，其特征在于：该保藏号为：CGMCC No.3602的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2的16SrRNA是如序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1055bp。

实际上，本发明涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2CGMCCNo.3602在脱氮中的应用。

涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2CGMCC No.3602在含氮液体的pH值为7-9，温度在25-35℃条件下脱氮中的应用。

涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2CGMCC No.3602在含氮液体的pH值为7，温度在30℃条件下脱氮中的应用。

涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2CGMCC No.3602在厌氧条件下，去除硝氮中的应用，厌氧条件是指在氮气环境下进行生物脱氮。

涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2CGMCC No.3602在缺氧条件下，去除氨氮中的应用，缺氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基静置于生化培养箱中培养的情况。

涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2CGMCC No.3602在缺氧条件下，去除硝氮中的应用，缺氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基静置于生化培养箱中培养的情况。

涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2CGMCC No.3602在微好氧条件下，去除氨氮中的应用，微好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于70-80rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在1.8-2.5mg/L。

涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2CGMCC No.3602在微好氧条件下，去除硝氮中的应用，微好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于70-80rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在1.8-2.5mg/L。

还涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2CGMCC No.3602在好氧条件下，去除氨氮中的应用，好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于140-160rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在4.5-5.0mg/L。

还涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2CGMCC No.3602在好氧条件下，去除硝氮中的应用，好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于140-160rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在4.5-5.0mg/L。

还涉及一种用于生物脱氮的微生物菌剂，其活性成分为以上所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株HD4-2。

如以上所述的应用，其特征在于：厌氧条件下，该菌株对氨氮的去除率为96.82％，同时没有亚硝氮的积累；厌氧条件是指在氮气环境下进行生物脱氮。

如以上所述的应用，其特征在于：缺氧条件下，该菌株HD4-2对氨氮的去除率为98.44％，同时没有亚硝氮和硝氮的积累；缺氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基静置于生化培养箱中培养的情况。

如以上所述的应用，其特征在于：缺氧条件下，该菌株HD4-2对硝氮的去除率为97.22％，同时没有亚硝氮的积累；缺氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基静置于生化培养箱中培养的情况。

应当指出的是：上述或下述没有亚硝氮和硝氮的积累是指：亚硝氮和硝氮的浓度在监测过程中没有出现大的波动，基本在10mg/L以下。

如以上所述的应用，其特征在于：微好氧条件下，菌株HD4-2对氨氮的去除率为83.7％，同时没有亚硝氮和硝氮的积累；微好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于70-80rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在1.8-2.5mg/L。

如以上所述的应用，其特征在于：微好氧条件下，菌株HD4-2对氨氮的去除率为83.7％，同时没有亚硝氮和硝氮的积累；微好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于73-77rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在2.0-2.2mg/L。

如以上所述的应用，其特征在于：微好氧条件下，菌株HD4-2对硝氮的去除率为98.2％，同时没有亚硝氮的积累；微好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于70-80rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在1.8-2.Smg/L。

如以上所述的应用，其特征在于：微好氧条件下，菌株HD4-2对硝氮的去除率为98.2％，同时没有亚硝氮的积累；微好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于75rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在2mg/L。

如以上所述的应用，其特征在于：好氧条件下，菌株HD4-2对氨氮的去除率为100％(去除率为100％是指在本实验的测定条件下，氨氮的终浓度测定结果为0)，同时没有亚硝氮和硝氮的积累；好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于140-160rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在4-6mg/L。

如以上所述的应用，其特征在于：好氧条件下，菌株HD4-2对氨氮的去除率为100％，同时没有亚硝氮和硝氮的积累；好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于140-160rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在4.5-5.0mg/L。

如以上所述的应用，其特征在于：好氧条件下，菌株HD4-2对氨氮的去除率为100％，同时没有亚硝氮和硝氮的积累；好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于150rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在5mg/L。

如以上所述的应用，其特征在于：好氧条件下，菌株HD4-2能够较好地去除硝氮，同时没有亚硝氮的积累；好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于140-160rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在4-6mg/L。

如以上所述的应用，其特征在于：好氧条件下，菌株HD4-2能够较好地去除硝氮，同时没有亚硝氮的积累；好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于140-160rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在4.5-5.0mg/L。

如以上所述的应用，其特征在于：好氧条件下，菌株HD4-2能够较好地去除硝氮，同时没有亚硝氮的积累；好氧条件是指将接种菌株HD4-2的培养基置于150rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在5mg/L。

一种用于生物脱氮的微生物菌剂，其活性成分为以上所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)菌株HD4-2

菌株HD4-2可用来脱氮，在实际应用中，可将菌株HD4-2置于含氮液体中进行生物脱氮。

生物脱氮可在厌氧、缺氧、微好氧和好氧条件下进行。

生物脱氮的温度为20-45℃，优选为25-35℃，最好为30℃。

生物脱氮的pH值为6-11，优选为7-9，最好为8。

生物脱氮中的氮源是氨氮、硝氮和/或亚硝氮。

本发明的铜绿假单胞菌及其应用与现有技术相比有如下有益效果：

1.本发明的菌株HD4-2能在缺氧、微好氧和好氧条件下去除氨氮或硝氮，可将该菌株直接用于含氮废水中，只需一个阶段即可实现氮素的去除，解决了传统生物脱氮工艺中需缺氧反硝化、好氧硝化分段处理的问题，简化了工艺流程，节省了成本，在实践中具有很高的潜在应用价值。

请注意：这里所述的一个阶段是指：不需要再分段处理了，而且，具体的时间根据条件的不同而不同，不是统一的时间。

2.在厌氧条件下，菌株HD4-2能够去除硝氮。当初始硝氮的浓度为80mg/L时，60h内硝氮的去除率达到96.82％，去除速率为1.31mgN/L·h；去除过程中亚硝氮没有积累。说明菌株HD4-2在厌氧条件下具有反硝化能力，与传统的反硝化细菌类似。

3.在缺氧条件下，菌株HD4-2能够去除氨氮和硝氮。当初始氮源浓度为80mg/L时，HD4-2在5天内对氨氮的去除率达到98.44％，去除速率为15.47mgN/L·d；在60h内对硝氮的去除率达到97.22％，去除速率为1.32mgN/L·h。在去除氨氮的过程中，COD_Cr逐渐降低，说明菌株HD4-2为异养菌，具有异养硝化能力；pH值急剧升高，说明发生了反硝化作用。

4.在微好氧条件下，菌株HD4-2能够去除氨氮和硝氮。当初始氮源浓度为80mg/L时，HD4-2在48h内对氨氮的去除率达到83.07％，去除速率为1.22mgN/L·h；在44h内对硝氮的去除率达到98.20％，去除速率为1.81mgN/L·h。随着溶解氧的提高，菌株HD4-2的生长速率提高，脱氮速率也相应的提高。

5.在好氧条件下，菌株HD4-2能够去除氨氮和硝氮。当初始氮源浓度为80mg/L时，HD4-2在18h内对氨氮的去除率达到100％，去除速率为3.87mgN/L·h；24h内对硝氮去除率为69.07％，去除速率为2.34mgN/L·h。在好氧条件下，菌株HD4-2的生长速率大幅提高。

6.本发明的菌株HD4-2接种于不同pH值的硝酸盐氮废水中，在中性及偏碱性的条件下菌株的脱氮能力较强，pH对脱氮效果的影响不大，这种特性使该菌株的实用性大大增强。

附图说明

图1为厌氧条件下该菌株HD4-2对硝氮的去除曲线；

图2为缺氧条件下该菌株HD4-2对氨氮的去除曲线；

图3为缺氧条件下该菌株HD4-2对硝氮的去除曲线；

图4为微好氧条件下该菌株HD4-2对氨氮的去除曲线；

图5为微好氧条件下该菌株HD4-2对硝氮的去除曲线；

图6为好氧条件下该菌株HD4-2对氨氮的去除曲线；

图7为好氧条件下该菌株HD4-2对硝氮的去除曲线；

图8为不同pH值的条件下该菌株HD4-2对硝氮的去除曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，各指标的测定方法均按照《水和废水监测分析方法》(第四版)中的标准方法测定：氨氮的测定方法为纳氏试剂比色法；亚硝氮的测定方法为N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法；硝氮的测定方法为紫外分光光度法；COD的测定方法为重铬酸钾法；OD值在600nm波长处测定，测定时以未接种的培养液为参比，测量菌液的吸光度；pH值采用精密pH计测定；溶解氧采用便携式溶解氧仪测定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1.菌株HD4-2的鉴定

1.菌株个体形态特征：革兰氏染色阴性；杆状；无芽孢和荚膜。

2.菌落形态特征：菌株在平板(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5gNaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH为7.0，加入1.5％-2.0％琼脂)上培养2天后，形成2-3mm的圆形菌落，白色，扁平，表面光滑，产生黄绿色色素。

3.16S rRNA基因序列特征：其16S rRNA具有如序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1055bp。

根据其形态特征和16S rRNA基因序列特征，鉴定菌株HD4-2为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

实施例2.厌氧条件下的生物脱氮实验

厌氧条件是指在100mL的厌氧瓶中装100mL的培养基，盖上盖子后在121℃灭菌30min，；无菌条件下接种菌悬液后将厌氧瓶密封；先利用真空泵抽真空，再充入氮气，重复该操作3次，以确保达到厌氧条件；最后将厌氧瓶置于30℃，50rpm的摇床内振荡培养(使细菌与培养液充分混匀)。

将菌株HD4-2接种于含有100mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH为7.0)，30℃，150rpm的摇床中振荡培养20-24h。当OD₆₀₀为0.9-1时，停止培养，菌悬液用于接种。

每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1gMgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH值为7.0)，在上述厌氧条件下培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔一定时间取反应液，在10000rpm下离心5min，取上清液测定硝氮、亚硝氮。

注：以上和以下所述的每隔一定时间是：在测定的28h或更长的时间中，在前24h中，一般是每隔6h取样；后24h中，一般是每隔12h取样。从附图中也能看出隔多久测一次。

结果如图1所示，在厌氧条件下菌株HD4-2能够去除硝氮，在60h内硝氮的去除率达到96.82％，去除速率为1.31mgN/L·h，去除过程中亚硝氮没有积累。在厌氧条件下，菌株HD4-2生长的较慢，去除硝氮的速率也比较慢。

实施例3.缺氧条件下的生物脱氮实验

缺氧条件是指将接种菌悬液的培养基静置于生化培养箱中培养的情况。

请注意：缺氧条件以及下述的微好氧条件、好氧条件是本领域普通技术人员公知的常识，因此，在这里就不再详述了。

一、以氨氮为氮源的生物脱氮实验

将菌株HD4-2接种于含有300mL培养基的500mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.3147g NH₄Cl，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH为7.0)，30℃，150rpm的摇床中振荡培养20-24h。当OD₆₀₀为0.9-1时，停止培养，菌悬液用于接种。

取10mL所制备的菌株HD4-2菌悬液，加入2个含有300mL培养基的500mL锥形瓶中(每L培养基含5.5611g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.3147g NH₄Cl，0.1g KCl，0.1gMgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH为7.0)，25℃，生化培养箱中静置培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔1d取反应液，其中一部分直接用于测pH值，其余部分在10000rpm下离心5min，取上清液测定氨氮、硝氮、亚硝氮和COD_Cr。

结果如图2所示，在缺氧条件下菌株HD4-2能够去除氨氮。5天内氨氮的去除率达到98.44％，去除速率为15.47mgN/L·d；在氨氮去除的过程中没有硝氮和亚硝氮的积累。COD_Cr随着氨氮的去除而逐渐降低，说明菌株HD4-2为异养菌，具有异养硝化能力。pH值在急遽升高后保持稳定，推测有2方面原因：一是碳源丁二酸钠的代谢产物呈碱性；二是在氨氮去除的过程中发生了反硝化作用，反硝化作用通常是伴随产碱的。

二、以硝氮为氮源的生物脱氮实验

将菌株HD4-2接种于含有100mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH值为7.0)，30℃，150rpm的摇床中振荡培养20-24h。当OD₆₀₀为0.9-1时，停止培养，菌悬液用于接种。

取7mL所制备的菌株HD4-2菌悬液，加入2个含有93mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH为7.0)，30℃，生化培养箱中静置培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔一定时间取反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度(OD₆₀₀)，其余部分在10000rpm下离心5min，取上清液测定硝氮、亚硝氮。

结果如图3所示，在缺氧条件下菌株HD4-2能够去除硝氮。在60h内硝氮的去除率达到97.22％，去除速率为1.32mgN/L·h；在硝氮去除的过程中没有亚硝氮的积累。菌株HD4-2在16h内OD₆₀₀逐渐升高到0.33，在20h时OD₆₀₀降至0.19并保持稳定；菌株HD4-2在达到最大生长量后易发生自溶现象。

实施例4.微好氧条件下的生物脱氮实验

微好氧条件是指将接种菌悬液的培养基置于75rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在2mg/L左右。

一、以氨氮为氮源的生物脱氮实验

菌株HD4-2接种于含有300mL培养基的500mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH为7.0)，30℃，150rpm的摇床中振荡培养20-24h。当OD₆₀₀为0.9-1时，停止培养，菌悬液用于接种。

取5mL所制备的菌株HD4-2菌悬液，加入2个含有100mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.3147g NH₄Cl，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.005g FeSO₄·7H₂O，pH为7.0)，30℃，75rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔一定时间取反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度(OD₆₀₀)，其余部分在10000rpm下离心5min，取上清液测定氨氮、亚硝氮和硝氮。

结果如图4所示，在微好氧条件下菌株HD4-2也能去除氨氮。48h内氨氮的去除率达到83.70％，去除速率为1.22mgN/L·h；在氨氮去除的过程中没有亚硝氮和硝氮的积累。从生长曲线可见，OD₆₀₀逐渐升高，菌株HD4-2处于对数生长期。

二、以硝氮为氮源的生物脱氮实验

将菌株HD4-2接种于含有100mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH为7.0)，30℃，150rpm的摇床中振荡培养20-24h。当OD₆₀₀为0.9-1时，停止培养，菌悬液用于接种。

取7mL所制备的菌株HD4-2菌悬液，加入2个含有93mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO4·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH为7.0)，30℃，75rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔一定时间取反应液，在10000rpm下离心5min，取上清液测定硝氮、亚硝氮。

结果如图5所示，微好氧条件下菌株能够去除硝氮。44h内硝氮的去除率达到98.2％，去除速率为1.81mgN/L·h；在硝氮去除的过程中没有亚硝氮的积累。与厌氧、缺氧条件下相比，在微好氧条件下菌株HD4-2硝氮的去除速率有所提高，这是由于随着溶解氧的提高，菌株的生长速率有所提高的缘故。

实施例5.好氧条件下的生物脱氮实验

好氧条件是指将接种菌悬液的培养基置于150rpm的摇床中培养的情况，溶解氧在5mg/L。

一、以氨氮为氮源的生物脱氮实验

将菌株HD4-2接种于含有300mL培养基的500mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH值为7.0)，30℃，150rpm的摇床中振荡培养20-24h。当OD₆₀₀0.9-1时，停止培养，菌悬液用于接种。

取5mL所制备的菌株HD4-2菌悬液，加入2个含有100mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.3147gNH₄Cl，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH值为7.0)，30℃，150rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔一定时间取反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度(OD₆₀₀)，其余部分在10000rpm下离心5min，取上清液测定氨氮、亚硝氮和硝氮。

结果如图6所示，在好氧条件下菌株HD4-2对氨氮有较强的去除能力。18h内氨氮的去除率达到99.0％-99.9％，去除速率为3.87mgN/L·h；在氨氮去除过程中，几乎没有亚硝氮和硝氮的积累。从菌株HD4-2的生长曲线可见，最初的6h内，菌株处于静止期；6-18h内，菌株处于对数生长期，氨氮的去除非常迅速，几乎呈直线下降；氨氮完全去除后，菌株进入内源呼吸期，OD₆₀₀逐渐下降，菌株出现自溶现象。

二、以硝氮为氮源的生物脱氮实验

将菌株HD4-2接种于含有100mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH值为7.0)，30℃，150rpm的摇床中振荡培养20-24h。当OD₆₀₀为0.9-1时，停止培养，菌悬液用于接种。

取7mL所制备的菌株HD4-2菌悬液，加入2个含有93mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO4·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH为7.0)，30℃，150rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔一定时间取反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度(OD₆₀₀)，其余部分在10000rpm下离心5min，取上清液测定硝氮、亚硝氮。

结果如图7所示，在好氧条件下菌株HD4-2仍能去除硝氮。24h后的硝氮去除率为69.07％，去除速率为2.34mgN/L·h；在去除硝氮的过程中，几乎没有亚硝氮的积累。从生长曲线可见，该菌在好氧条件下能够快速生长，细胞产率较高。

实施例6.生物脱氮实验

将菌株HD4-2接种于含有100mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O，pH值为7.0)，30℃，150rpm的摇床中振荡培养20-24h。当OD₆₀₀为0.9-1时，停止培养，菌悬液用于接种。

取5mL所制备的菌株HD4-2菌悬液，加入10个含有100mL培养基的250mL锥形瓶中(每L培养基含5g琥珀酸钠，0.543g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g NaNO₃，0.1g KCl，0.1gMgSO₄·7H₂O，0.0005g FeSO₄·7H₂O)，初始pH值分别为4.0、6.0、7.0、9.0、11.0，每种pH值条件下做2个平行样，静置于30℃的生化培养箱中培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。培养48h后取锥形瓶中的反应液，在10000rpm下离心5min，取上清液测定硝氮、亚硝氮。

结果如图8所示，菌株HD4-2在中性偏碱性的条件下对硝酸盐氮有较好的去除能力，在酸性条件下去除效果不佳。在初始pH值为4.0、6.0、7.0、9.0、11.0的条件下，菌株HD4-2对总无机氮的去除率分别为8.57％、92.10％、93.33％、95.66％、87.72％。当初始pH值为11.0时，菌株HD4-2对总无机氮的去除率没有急剧下降，说明菌株HD4-2对碱性环境的适应性较强。因此，菌株HD4-2脱氮的适宜pH值为6-11。

序列表

<110>北京大学

<120>不同溶解氧条件下脱氮的铜绿假单胞菌菌株及其应用

<160>1

<170>PatentIn Version 3.3

 

<210>1

<211>1055

<212>DNA

<213>铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

 

<400>1

tgaactgggc ggaggctacc atgcaagtcg agcggatgaa gggagcttgc tcctggattc     60

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