一种超声波介导的微生物遗传转化方法及其应用

摘要

一种低频超声波介导的转化微生物的方法，步骤为：1)在液体培养基中培养细菌至对数期；2)在含有步骤1中的液体培养基的玻璃瓶中加入待转化的底物；3)将步骤2中的玻璃瓶放入超声波仪器的空腔内；4)启动超声波仪器，频率0.1-1000千赫，功率0.01-1000特，采用非探头式接触，整个转化过程在生物反应器的溶液中进行，连续可调或间歇式超声波；5)细胞复苏、转接、涂平板。本发明可以对单个细胞、单个反应器操作，也可以实现高通量，而且操作简单，随意控制，并可以实现远程遥控。

说明书

技术领域

本发明属于微生物遗传转化领域，具体涉及一种采用低频超声波介导的转化方法将DNA、RNA、多糖、蛋白等生物大分子转化入细胞中。

本发明还涉及一种采用低频超声波介导的转化方法在难转化微生物(革兰氏阳性细菌)以及微生物遗传代谢工程中的应用。

背景技术

嗜热、厌氧、革兰氏阳性菌的转化一直是令科学家头疼的问题，在国际上成功的报道一直很少。原因是：嗜热细菌由于适应其特殊的生存环境，与常温细菌不同，其细胞膜厚且通透性低，而且外来核酸必须通过特定的DNA结合蛋白才能实现跨膜转运。对于革兰氏阳性菌，由于其细胞壁上特殊的多层肽聚糖结构也难以转化，而且当双链DNA结合到细胞膜上之后，马上会被膜上的核酸酶降解，失去完整性。对于严格厌氧细菌来说，进行遗传转化时整个操作过程必须在厌氧工作站中进行，操作步骤非常繁琐。因此对于嗜热厌氧且为革兰氏阳性细菌的转化更是难上加难，目前成功的报道仅限于采用基于高压电击的电转化仪和电击杯，通过高压电穿孔的方法完成(Tyurin et al.，2004，Tyurin et al.，2005)，而且这一方法在国内外仅有美国达特茅斯学院Lee Lynd所在的实验室可以成功，其它实验室无法重复。

而嗜热厌氧革兰氏阳性菌又被广泛应用于以木质纤维素为原料生产绿色低碳的可再生生物燃料。目前我们面临的最大问题是这些嗜热厌氧革兰氏阳性菌降解纤维素的能力和糖醇转化率普遍较低，无法进一步实现产业化。因此对这些嗜热厌氧革兰氏阳性菌必须进行基因工程改造。而进行这一遗传改造的前提是必须建立一种简单、快速的遗传转化体系。

目前报道的在微生物中可以进行遗传操作的转化体系主要有结合转移(Conjugation)和电穿孔转化(Electroporation)。其中结合转移需要供体菌的参与才能介导DNA植入受体菌中。而对于嗜热厌氧革兰氏阳性菌，目前还没有发现合适的供体菌。因此，目前对嗜热厌氧革兰氏阳性菌的转化完全依赖电转(Klapatch et al.，1996，Mai et al.，1997，Tyurin et al.，2004)，而这一方法如果采用常规商业化的电转化仪，转化效率不会超过10²/μgDNA。

低频超声波介导的转化方法是近几年才发现的、一种处于不断完善的新方法。该方法的原理是通过超声波在细胞膜表面瞬时产生微型囊泡，该囊泡在形成的同时可以裹入与之相邻的核酸、多糖等生物大分子。然后囊泡破裂并在细胞膜上形成一个纳米通道，其包裹的生物大分子通过纳米通道和细胞膜在自我修复的同时嵌入细胞内部，完成“摄入”或者转化过程。该方法最初主要用于真核细胞的转化和基因疗法(Liu et al.，2006，Manomeet al.，2005，Newman & Bettinger，2007)。在原核生物中的报道始于2007年(University of Sheffield)(Song et al.，2007)。但是目前报道的超声波转化法仍然仅仅局限在革兰氏阴性菌或者中温菌中。主要包括大肠杆菌(Escherichia coli DH5a)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。对于该方法若经改进，能否应用于革兰氏阳性菌、高温菌或者古菌，目前未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低频超声波介导的转化微生物的方法。

为实现上述目的，本发明采用基于超声波声致穿孔的原理，通过超声波在微生物细胞膜表面形成的瞬时囊泡，将细胞外部的生物大分子(脱氧核糖核酸、核糖核酸、蛋白、多糖等)裹入其中，然后通过细胞膜的自我修复功能，使膜上的囊泡连同内容物一起摄入细胞内部。由于超声波功率过大时，也可以在细胞内部形成空泡，该空泡破裂时释放的能量足以使整个细胞破碎。为了避免这一弊端，本发明采用的超声波为低频(0.1-1000千赫)、低功率(0.01-1000瓦特)。这一设置可以保证在细胞膜上形成囊泡的同时，不破坏细胞膜和周围生物大分子的结构。由于本发明中超声波介导的方法采用非探头式接触，所有反应过程培养液原位进行，因此更安全可靠。该方法可以应用于难转化微生物(如：高温、厌氧的革兰氏阳性细菌)核酸物质的转化，还可以应用于控制生物反应器中特定底物(核酸、多糖、蛋白以及特定化学药物等生物大分子)与细胞的接触、摄取和代谢过程。既可以对单个细胞、单个反应器操作，也可以实现高通量，而且操作简单，随意控制，并可以实现远程遥控。

具体地说，本发明提供的低频超声波介导的转化微生物的方法，包括如下主要步骤：

1)在液体培养基中培养细菌至对数期；

2)在含有步骤1中的液体培养基的玻璃瓶中加入待转化的底物；

3)将步骤2中的玻璃瓶放入超声波仪器的空腔内；

4)启动超声波仪器，频率0.1-1000千赫，功率0.01-1000瓦特，采用非探头式接触，整个转化过程在生物反应器的溶液中进行，连续可调或间歇式超声波；

5)细胞复苏、转接、涂平板。

所述的低频超声波介导的转化微生物的方法，其中，步骤1的细菌是指40℃-90℃的高温菌、厌氧菌、革兰氏染色阳性菌或古菌。

所述的低频超声波介导的转化微生物的方法，其中，细菌为：嗜热厌氧产乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)、木聚糖降解嗜热菌(Thermoanaerobacteriumxylanolyticum)、麻氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium mathranii)、厌氧糖化嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)、嗜热厌氧斜杆菌(Thermoanaerobacter italicus)魏氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterwiegelii)、纤维素降解嗜热杆菌(Thermoanaerobacter thermocopriae)、嗜热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、高温溶剂梭菌(Clostridium straminisolvents)、粪堆梭菌(Clostridium  stercorarium)、嗜热硫化梭菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)、嗜热丁酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)以及热解纤维素果汁杆菌Caldicellulosiruptor kristjanssonii和Caldicellulosiruptor saccharolyticus，红球菌(Rhodococcus sp.)、古细菌(Archaea)。

所述的低频超声波介导的转化微生物的方法，其中，步骤2加入的待转化的底物为分子量大于100道尔顿的生物大分子，如：DNA、RNA、质粒、基因组、蛋白质、多糖、脂类、抗生素、纳米颗粒中的一种或多种。

所述的低频超声波介导的转化微生物的方法，其中，步骤3的空腔内液体的液面高于玻璃瓶内液体的液面。

本发明的低频超声波介导的转化微生物的方法，可以应用在微生物遗传代谢工程中。

本发明提供的低频超声波介导的转化方法突破了高温或者革兰氏阳性菌难以转化的障碍，利用德克萨斯红标记的葡聚糖转化革兰氏阳性嗜热厌氧乙醇杆菌，转化效率可以到达27％以上，利用质粒DNA转化革兰氏阳性嗜热厌氧乙醇杆菌，转化效率可以达到6×10²/μg DNA以上。与传统的化学转化或者电穿孔转化相比，本发明建立的超声波转化法的优点在于：

(1)无需制备感受态细胞、无需制备原生质体、无需反复离心、洗涤等步骤；所需要的细胞为正常培养的、且处于生长期的细胞。

(2)超声波过程中不采用探头接触，因此完全可以采用声波远程控制。

(3)对于厌氧菌，无需在厌氧工作站中操作超声波转化，仅需要将培养瓶密封，放在超声波容器内即可。

(4)本发明中建立的超声波转化方法，对细胞和质粒DNA等生物大分子不产生任何破坏作用。

(5)本方法不需要昂贵的仪器即可实现。如普通的Branson B200超声波仪(40kHz，19W)。

(6)本发明还可以应用于以下高温或革兰氏阳性细菌：嗜热厌氧产乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)、木聚糖降解嗜热菌(Thermoanaerobacteriumxylanolyticum)、麻氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium mathranii)、厌氧糖化嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)、嗜热厌氧斜杆菌(Thermoanaerobacter italicus)、魏氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)、纤维素降解嗜热杆菌(Thermoanaerobacterthermocopriae)、嗜热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、高温溶剂梭菌(Clostridium straminisolvents)、粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)、嗜热硫化梭菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)、嗜热丁酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)以及热解纤维素果汁杆菌Caldicellulosiruptor kristjanssonii和Caldicellulosiruptor saccharolyticus；对于其它嗜热革兰氏阳性细菌或古细菌，本发明建立的方法同样适用。

(7)本发明可以实现低成本、高通量。一次可以对几十、上百个生物样品进行转化。

此外，本发明中建立的低频超声波介导的转化方法还可以应用于控制生物反应器中特定底物(DNA、RNA、多糖、蛋白以及特定化学药物等生物大分子)与细胞的接触、摄取和代谢过程。既可以对单个细胞、单个反应器操作，也可以实现对多反应器高通量操作，而且步骤简单，容易控制。

附图说明

图1是超声波转化嗜热厌氧乙醇杆菌(德克萨斯红标记的葡聚糖)。

图1A是利用超声波方法(Branson B200，40kHz，19W)将德克萨斯红标记的葡聚糖转化入嗜热厌氧乙醇杆菌中。超声波持续时间为0-40秒(S)；转化后利用Olympus-BX51荧光显微镜观察细胞，第一排为可见光视野，第二排为荧光视野，标尺为10μm。

图1B是超声波持续时间对德克萨斯红标记葡聚糖转化效率的影响。利用超声波方法(Branson B200，40kHz，19W)将德克萨斯红标记的葡聚糖转化入嗜热厌氧乙醇杆菌中。超声波持续时间为0-40秒(Sec)，然后将细胞反复洗涤，在荧光显微镜观察红色荧光细胞占全部细胞的比例。每一时间的数据统计来自5个不同的视野，取平均值。

图2是超声波转化不动杆菌(纳米颗粒)，利用超声波将纳米金粒转化入不动杆菌中。杆菌内部的黑色颗粒为纳米金粒。透射电镜观察，标尺为1微米。

具体实施方式

本发明的目的在于提供一种快速转化高温厌氧革兰氏阳性细菌的转化方法及其在细胞发酵和代谢工程中的应用。

本发明的创新性在于采用低频超声波，其特征性频率为：0.1-1000千赫；功率为：0.01-1000瓦特；采用非探头式接触；整个转化过程在生物反应器的溶液中进行。时间连续可控，并能实现随意控制。

本发明提供的快速转化嗜热厌氧革兰氏阳性细菌的方法，包括如下步骤：

1)在液体培养基中培养细菌至对数期；

2)在含有步骤1中的液体培养基的玻璃瓶中加入待转化的底物：如核酸、多糖等生物大分子；

3)将步骤2中的玻璃瓶放入超声波仪器的空腔内，空腔内液体的液面略高于玻璃瓶内液体的液面，而不至于完全浸没玻璃瓶；

4)启动超声波仪器；

5)细胞复苏、转接、涂平板。

所述的方法中，步骤1中的嗜热厌氧革兰氏阳性菌是指最适生长温度高于40℃、严格或兼性厌氧、革兰氏染色为阳性的细菌或古菌，主要包括：嗜热厌氧产乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)、木聚糖降解嗜热菌(Thermoanaerobacteriumxylanolyticum)、麻氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium mathranii)、厌氧糖化嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)、嗜热厌氧斜杆菌(Thermoanaerobacter italicus)、魏氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)、纤维素降解嗜热杆菌(Thermoanaerobacterthermocopriae)、嗜热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、高温溶剂梭菌(Clostridium straminisolvents)、粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)、嗜热硫化梭菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)、嗜热丁酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)以及热解纤维素果汁杆菌Caldicellulosiruptor kristjanssonii和Caldicellulosiruptor saccharolyticus，红球菌(Rhodococcus sp.)和古细菌(Archaea)。

本发明提供的低频超声波转化方法在细胞发酵和代谢工程中的应用，包括如下步骤：

1)在反应器中培养细菌、病毒、细胞、真菌等微生物至一定生长时期；

2)向反应器中加入特定的生物大分子，主要包括：DNA、RNA、多糖、抗生素、蛋白质、维生素；

3)连续或者间歇启动超声波；此时生物大分子会被摄入细胞内部，启动随后的细胞内代谢或调控过程。

以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1(以德克萨斯红标记的葡聚糖转化嗜热厌氧乙醇杆菌为例)

1)细菌培养

将嗜热厌氧乙醇杆菌接种到已除氧的的RCM培养基(配方：酵母膏3g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉1g/L，葡萄糖5g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，NaCl 3g/L，NaAc 3g/L，琼脂0.5g/L，刃天青2mg/L，加蒸馏水补至总体积为1L，调整pH值为6.8，通N₂除氧，115℃湿热灭菌15min。RCM固体培养基配制：琼脂1.25％，其它同RCM培养基)，培养瓶为底部完全扁平的小青瓶。60℃厌氧培养，待菌液长至对数期，此时细胞浓度应为：10⁹cells/mL。(注：不同种属的厌氧微生物培养基配方不同，RCM培养基仅适合嗜热厌氧产乙醇杆菌，对于特定的微生物，需要选用相应的培养基)。

2)向步骤1的小青瓶中加入德克萨斯红标记的葡聚糖(Dexas-Redconjugated dextran，70kDa，Invitrogen)，葡聚糖终浓度为1.25mg/mL。

3)将含有德克萨斯红标记的葡聚糖和嗜热厌氧产乙醇杆菌的小青瓶放入超声波仪器的空腔内，空腔内液体的液面略高于玻璃瓶内培养基的液面，但又不至于完全浸没玻璃瓶。如果小青瓶在超声波仪器内腔的液面上漂浮，可以用支架固定。

4)启动超声波仪器。仪器型号为Branson B200(40kHz，19W)，超声波持续时间为20秒。

5)离心收集菌体，并用灭菌的生理盐水洗涤4次，放在荧光显微镜(Olympus-BX51)下观察菌体有无红色荧光。如果菌体呈现红色荧光，说明德克萨斯红标记的葡聚糖已被转化入菌体内部；如果没有荧光，说明德克萨斯红标记的葡聚糖没有被转化入细胞。统计6个不同视野内荧光和没有荧光的菌体总数。阳性对照为未经过洗涤的德克萨斯红标记的葡聚糖和细胞混合物，阴性对照为没有加德克萨斯红标记葡聚糖的细胞。计算转化效率，此时的转化效率应为27％(见图1)。

实施例2(以质粒DNA转化嗜热厌氧乙醇杆菌为例)

1)细菌培养

将嗜热厌氧乙醇杆菌接种到已除氧的的RCM培养基(配方：酵母膏3g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉1g/L，葡萄糖5g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，NaCl 3g/L，NaAc 3g/L，琼脂0.5g/L，刃天青2mg/L，加蒸馏水补至总体积为1L，调整pH值为6.8，通N₂除氧，115℃湿热灭菌15min。RCM固体培养基配制：琼脂1.25％，其它同RCM培养基)，培养瓶为底部完全扁平的小青瓶。60℃厌氧培养，待菌液长至对数期，此时细胞浓度应为：10⁹ cells/mL。(注：不同种属的厌氧微生物培养基配方不同，RCM培养基仅适合嗜热厌氧产乙醇杆菌，对于特定的微生物，需要选用相应的培养基，此为公知技术，不作详细介绍)。

2)向步骤1的小青瓶中加质粒pIKM2(该质粒含有梭菌启动子，可以表达β-葡聚糖酶，卡那霉素抗性)，质粒用量为5μg。

3)将含有5μg质粒pIKM2和1mL嗜热厌氧产乙醇杆菌的小青瓶放入超声波仪器的空腔内，空腔内液体的液面略高于玻璃瓶内培养基的液面，但又不至于完全浸没玻璃瓶。如果小青瓶在超声波仪器内腔的液面上漂浮，可以用支架固定。

4)启动超声波仪器。仪器型号为Branson B200(40kHz，19W)，超声波持续时间为20秒。

5)然后向含有质粒pIKM2和嗜热厌氧产乙醇杆菌的小青瓶中加入5mL新鲜的RCM液体培养基，45℃复苏5小时，然后在厌氧工作站中涂布RCM固体培养基(含有250μg/mL卡那霉素)。在厌氧罐中培养5-7天。

6)在RCM固体平板上挑取单克隆，采用PCR方法鉴定阳性菌落。同时对于转化子的培养物，采用已经公知的方法检测β-葡聚糖酶活性。如果转化成功，则能够检测到酶活。阳性对照为商品化的β-葡聚糖酶，阴性对照为不含有β-葡聚糖酶基因的空载体转化的嗜热厌氧乙醇杆菌。此时阳性转化子的比活力为0.9U/mg，而不含有β-葡聚糖酶基因的空载体转化的嗜热厌氧乙醇杆菌没有任何活性。

实施例3

本发明提供的低频超声波转化方法在细胞发酵和代谢工程中的应用(以纳米颗粒转化不动杆菌Acinetobacter sp.为例)

1)在5L反应器中培养不动杆菌至对数生长时期；

2)向反应器中加入纳米金粒(Gold nanoparticles)。

3)连续或者间歇启动超声波：40kHZ，10秒。此时纳米颗粒会被摄入细胞内部，启动随后的细胞内代谢调控过程。

4)用无菌生理盐水洗涤细胞，然后利用透射电镜观察纳米金粒在不动杆菌中的分布。如果转化成功，纳米金粒会在菌体内部形成颗粒状阴影(见图2)。