一种快速、高效提取水稻组织总RNA的方法

摘要

本发明涉及一种快速、高效提取水稻组织总RNA的方法，其特征在于：按以下步骤进行：称取水稻组织100mg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，加入液氮后迅速研磨，研磨时间控制在1min之内；将研磨后的匀浆倒入1.5ml EP管中，后加入1ml的Trizol，充分混匀后15s，加0.2ml氯仿溶液充分混匀15s；12000g离心10min，取上层水相转入新的1.5ml PE管中，加0.5ml异丙醇，于20℃下静置20min；12000g离心10min，倒掉上层清液，加1ml现配的75％的乙醇洗涤沉淀二次，取沉淀物置超净工作台吹干，加DEPC水溶解。本发明水稻组织总RNA的提取方法具有快速、高效、完整性等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域水稻组织总RNA的提取方法。

背景技术

近年来，随着生物技术的进步和发展，基因的克隆和表达研究，需要从植物材料中提取高纯度的RNA。尽管RNA的提取已经成为很成熟的技术，但在实际研究中经常很难做到顺利获得质量好的RNA。这归咎于很多因素(如材料的保存不合理、器具不洁净、操作不严等)造成RNA的降解。而且提取不同植物材料中RNA的最适宜条件及其相应方法也不尽相同。目前市面上出售的植物总RNA提取试剂盒众多，但均存在一定的缺陷，如提取时间长，提取所需的条件较为苛刻，提取率低，提取的总RNA完整性较差等缺点。然而RNA质量的好、坏决定着实验结果的可信度高、低。因此获取一种快速、高效的植物组织RNA提取方法具有重要的作用。

2002年12月水稻基因组测序成功完成，共测定碱基对3亿6千600万个，精确度达到99.99％，并预测遗传基因62435个。此后国内外众多学者将水稻作为一种重要的模式植物对体内的代谢、致病等基因进行研究。然而这些研究的基础都建立在总RNA提取的基础上，因此提取获得一个完整性较好的总RNA是学者们研究的重要前提。因此本发明提出了一种快速、高效提取水稻组织总RNA的方法。以期为水稻基因组学研究奠定重要的工作基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、高效的水稻组织RNA提取方法。

本发明的技术方案在于：一种快速、高效提取水稻组织总RNA的方法，其特征在于：按以下步骤进行：

(1)称取水稻组织100mg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，加入液氮后迅速研磨，研磨时间控制在1min之内；

(2)将研磨后的匀浆倒入1.5ml EP管中，后加入1ml的Trizol，充分混匀后15s，加0.2ml氯仿溶液充分混匀15s；

(3)12000g离心10min，取上层水相转入新的1.5ml PE管中，加0.5ml异丙醇，于20℃下静置20min；

(4)12000g离心10min，倒掉上层清液，加1ml现配的75％的乙醇洗涤沉淀二次，取沉淀物置超净工作台吹干，加DEPC水溶解。

使用工具的前处理：

1.5ml PE管和1.5ml、200μl、10μl的枪头用0.1％的DEPC浸泡12小时，然后120℃高压蒸汽灭菌20min。0.1％DEPC、玻璃试剂瓶120℃高压蒸汽灭菌20min。

水稻组织RNA的提取：

称取水稻组织100mg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，液氮中迅速研磨(1min内)，倒入1.5ml EP管中，后加入1ml的Trizol，充分混匀后15s，加0.2ml氯仿溶液充分混匀15s。12000g离心10min，取上层水相转入新的1.5ml PE管中，加0.5ml异丙醇，于-20℃下静置20min，12000g离心10min，倒掉上层清液，加1ml现配的75％的乙醇洗涤沉淀二次，取沉淀置超净工作台吹干，加DEPC水溶解。整个提取过程在45min内完成。运用紫外分光光度法检测样品RNA的纯度，或以1％的非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳的电压120V，电流80mA，采用稳压电源，缓冲液为1％的TAE。

本发明的优点在于：1、提取时间短，整个提取操作流程在45min内完成。

2、提取总RNA完整性好，水稻根部总RNA溶液在紫外吸收波长260nm和280nm下的吸光度比值为2.03，其中5s，18s和28s条带清晰，28s条带与18s条带的亮度比值接近2；水稻叶部总RNA溶液在紫外吸收波长260nm和280nm下的吸光度比值为2.05，其中5s，16s，18s，25s和28s条带清晰，28s条带与18s条带的亮度比值接近2；。

3、提取效率高，100mg的水稻根可提取总RNA量为22.8825μg，100mg的叶可提取的总RNA量为51.0642μg。

附图说明

图1为本发明实施例一的RNA电泳检测图。

图2为本发明实施例二的RNA电泳检测图。

具体实施方式

为充分公开本发明的一种快速、高效提取水稻组织总RNA的方法，以下结合方法验证和实施实例加以说明。

实施例一：

水稻根部组织总RNA的提取：

称取三叶一芯其水稻根部组织100mg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，液氮中迅速研磨(1min内)，倒入1.5ml EP管中，后加入1ml的Trizol，充分混匀后15s，加0.2ml氯仿溶液充分混匀15s。12000g离心10min，取上层水相转入新的1.5ml PE管中，加0.5ml异丙醇，-20℃中静置20min，12000g离心10min，倒掉上清，加1ml现配的75％的乙醇洗涤沉淀二次，取沉淀置超净工作台吹干，加30μl 0.1％DEPC水溶解。

水稻根部组织总RNA的纯度检测：

运用美国瓦里安Cary50紫外分光光度计检测检测RNA溶液的纯度。取上述DEPC水溶解的RNA溶液1μl，稀释50倍，测定其在230nm、260nm、280nm、320nm下的吸光度。以OD260nm/OD280nm的比值计算RNA纯度。

结果：OD260nm/OD280nm＝2.03

水稻根部组织总RNA的提取量的计算：

根据RNA浓度的换算公式：RNA(μg/μL)＝OD260×40×稀释倍数/1000

由此可得，提取的RNA浓度为0.76275μg/μL，提取RNA的量为22.8825μg。

水稻根部组织总RNA的完整性检测：

以1％的非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。取1μLRNA溶液，4μlDEPC水，1μL 6×Loading buffer，上样。电泳检测条件，电压120V，电流80mA，稳压，缓冲液为1％的TAE，电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYY-12C型。水稻根部组织总RNA的电泳图片如图1所示，可见，5s，18s和28s条带清晰，28s条带与18s条带的亮度比值接近2。

实施例二：

水稻叶部组织总RNA的提取：

称取三叶一芯其水稻叶部组织100mg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，液氮中迅速研磨(1min内)，倒入1.5ml EP管中，后加入1ml的Trizol，充分混匀后15s，加0.2ml氯仿溶液充分混匀15s。12000g离心10min，取上层水相转入新的1.5ml PE管中，加0.5ml异丙醇，-20℃中静置20min，12000g离心10min，倒掉上清，加1ml现配的75％的乙醇洗涤沉淀二次，取沉淀置超净工作台吹干，加30μl 0.1％DEPC水溶解。

水稻叶部组织总RNA的纯度检测：

运用美国瓦里安Cary50紫外分光光度计检测检测RNA溶液的纯度。取上述DEPC水溶解的RNA溶液30μl，取1μl稀释50倍，测定其在230nm、260nm、280nm、320nm下的吸光度。以OD260nm/OD280nm的比值计算RNA纯度。

结果：OD260nm/OD280nm＝2.05

水稻叶部组织总RNA的提取量的计算：

根据RNA浓度的换算公式：RNA(μg/μL)＝OD260×40×稀释倍数/1000

由此得，提取的RNA浓度为1.70214μg/μL，提取RNA量为51.0642μg

水稻叶部组织总RNA的完整性检测：

以1％的非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。取1μLRNA溶液，4ul DEPC水，1μL 6×Loading buffer，上样。电泳检测条件，电压120V，电流80mA，稳压，缓冲液为1％的TAE，电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYY-12C型。水稻叶部组织总RNA的电泳图片如图2所示，可见，5s，16s，18s，25s和28s条带清晰，28s条带与18s条带的亮度比值接近2。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。