一种以碳纤维作为新型载体的酶固定化方法

摘要

本发明涉及一种以碳纤维作为新型载体的酶固定化方法，特别是涉及到一类需要高温反应环境的酶固定化载体及其固定化方法。以不同直径的微米和纳米级的系列碳纤维作为载体，碳纤维载体进行表面处理，将脱胶后或无胶碳纤维载体在无水乙醇中浸泡洗涤后自然晾干或烘干，然后碳纤维用缓冲液平衡，得到固定化酶载体；将表面处理后的碳纤维载体作为载体固定。这类载体适用于高温环境反应的各类催化酶。本发明制备的固定化酶在高温环境有很好的稳定性，适合应用于生物化学反应与反应器，在工业领域有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型载体的酶固定化方法，具体是将酶用物理法固定在系列碳纤维载体上，得到一种高温下稳定的固定化酶。

背景技术

固定化酶的载体材料是影响固定化酶活性和稳定性的重要因素之一，生物酶与载体之间的一些反应常常是降低酶活性的主要原因。不同的载体材料与生物酶分子之间的作用能够使酶分子的三位构像和微环境都产生不同的变化，从而影响底物向活性中心扩散速率。

根据载体的化学组成和来源可以分为无机材料、天然高分子、合成高分子、复合材料。无机载体稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性、不易被微生物所分解、耐酸碱、成本低、寿命长等。天然高分子材料特点是无毒性，传质性能好。但是天然高分子材料存在强度较低，在厌氧条件下易被微生物所分解，使用寿命较短。合成有机高分子对微生物的腐蚀也有较强的抵抗力，而且合成有机高分子凝胶载体还具有强度较大的优点。复合载体材料是以有机材料和无机材料复合组成的新载体材料，特点容易分离。随着固定化技术领域的发展，酶固定化过程中不得不面对的难题就是如何避免酶分子的微环境的改变，使酶分子的稳定性更高。因此，开发新型、高效固定化载体，进一步提高转化率和生产能力，是未来研究的重点。

目前，国内外固定化载体研究取得很大进展，载体材料研究范围从传统以聚合物材料为主发展到聚合物材料和无机材料共同发展局面；聚合物载体材料研究向功能化和精细化方向发展；固定化材料向高活力保持率、长使用寿命、易于分离和可再生等方向发展。

碳纤维具有生物相容性好，比表面积高，物理、化学性质稳定，无毒，耐环境性优良等诸多优点。随着生物酶固定化技术的发展，现有酶载体材料在物化性能、力学性能、适合温度、活性范围和再生等方面已不能满足使用要求。而将应用于复合材料中的碳纤维应用于生物酶固定化行业，则既可利用其优异的力学性能，又能发挥其良好的生物相容性。

在工业上很多酶催化反应条件需要高温环境，例如脂肪酶、果胶酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶。脂肪酶、果胶酶在油脂、食品等行业中需要高温催化；在油田中β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶能够帮助钻孔一起去除钻出来的材料，应用过程中需要高温可达100℃。

固定化酶表现出高度的热稳定性。碳纤维结构的载体有高比表面积和较高的机械性能，并且在碳纤维上固定的微生物不仅量很大，而且附着强度也很大，还有一定的弹力性。因此，选择用碳纤维固定生物酶，可以提高载体的生物酶的活性与改变酶学性质。碳纤维作为固定化酶已显示出其重要的应用价值，将成为固定化酶应用的新方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有良好生物相容性、能得到高温稳定的固定化酶的应用载体与方法。该载体表面存在大量的官能团，酶分子能与载体充分的结合，得到的固定化酶活力高且在高温下仍能保持一定的活性。

本发明使用的酶固定化载体为系列新型碳纤维，具体方法是：首先将碳纤维进行预处理，然后通过物理固定化方法将酶分子固定到载体上，进而得到高温稳定的固定化酶。

实现上述发明目的的技术方案如下：

1、一种以碳纤维作为新型载体固定化酶的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)以下列不同直径的微米和纳米级的系列碳纤维作为载体：直径为3-8μm的聚丙烯腈基碳纤维、直径为50-500nm的纳米级聚丙烯腈碳纤维、直径为50-500nm的纳米级聚丙烯腈活性碳纤维、聚丙烯腈活性碳纤维毡；将上述碳纤维载体进行如下表面处理：

将脱胶后或无胶碳纤维载体在无水乙醇中浸泡洗涤后自然晾干或烘干，然后碳纤维用缓冲液平衡，得到固定化酶载体；

其中所述的脱胶为向表面具有上胶物质的碳纤维中加入脱胶液，采用抽提的方法进行处理，控制抽提速度25～30min/次，根据上胶物质的多寡为抽提时间10～40小时；抽提结束后将碳纤维放入置于烘箱干燥；

2)将表面处理后的碳纤维载体作为载体固定脂肪酶、果胶酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶，其固定化方法的步骤如下：

a、按照碳纤维载体与酶质量比为1∶1.25～1∶5称取载体和酶，并用缓冲液配制酶溶液；所述酶为脂肪酶、果胶酶、β-半乳糖苷酶或β-甘露聚糖酶；

b、将碳纤维浸渍于上述酶溶液中1～4小时后冷冻干燥即得；

步骤1)和步骤2)采用相同的缓冲液。

上述的方法，其特征在于脱胶液为丙酮或石油醚。

上述的方法，其特征在于固定化脂肪酶时缓冲液pH为7.0～8.0

上述的方法，其特征在于固定化果胶酶时缓冲液pH为3.0～4.0。

上述的方法，其特征在于固定化β-半乳糖苷酶时缓冲液pH为6.5～7.5。

上述的方法，其特征在于固定化β-甘露聚糖酶时缓冲液pH为5.0～6.0。

本发明中所用的固定化酶载体及固定化方法有如下优点：

1、载体处理方法和固定化方法简单，条件温和。

2、固定化酶的热稳定性高

固定化能提高酶分子活性中心的三维构象与碳纤维载体的连接，固定化后酶分子与碳纤维载体多点连接防止酶分子伸展变形，使酶活力得以缓慢释放。表现在固定化酶的热稳定性有所提高。

3、固定化酶的应用

固定化酶更加适用于高温下的反应，有效地应用于工业生产，催化效果远高于其它的催化剂，提高在不同温度的环境适应性。

附图说明

图1本发明中以T300级碳纤维为载体固定脂肪酶的扫描电子显微镜照片

图2本发明中以T300级碳纤维为载体固定脂肪酶在50℃时的稳定性

具体实施方式：

实施例1以不同直径的聚丙烯腈碳纤维为载体制备固定化脂肪酶样品

具体方法如下：

1)脂肪酶购于国药集团化学试剂有限公司，产品编号：P107496。

2)pH为7.0的缓冲液配制：0.2mol/L磷酸氢二钠1220mL和0.2mol/L磷酸二氢钠780mL混合。

3)称取4.000g脂肪酶溶于pH为7.0的磷酸缓冲液1000ml中，即为浓度为4mg/ml脂肪酶溶液。

4)分别称取直径为3μm、5μm、8μm的聚丙烯腈碳纤维各1g，均加入500ml丙酮为脱胶液，采用抽提的方法，抽提10h，其速度为25min/次。抽提结束后将碳纤维放入置于100℃烘箱干燥30min。将脱胶后三种直径的碳纤维浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后自然晾干。称取三种直径的碳纤维各0.05g，加入pH为7.0的0.2mol/L磷酸缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。

5)将步骤4)处理好的三种直径的载体0.05g浸渍于盛有4mg/ml的脂肪酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化1h。取出样品用pH为7.0的0.2mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得三种固定化脂肪酶样品。

6)将制得的固定化脂肪酶样品置于50℃水浴振荡器中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例2以纳米级聚丙烯腈碳纤维为载体制备固定化脂肪酶样品

具体方法如下：

1)脂肪酶购于国药集团化学试剂有限公司，产品编号：P107496。

2)pH为7.5的缓冲液配制：0.2mol/L磷酸氢二钠1680mL和0.2mol/L磷酸二氢钠320mL混合。

3)称取2.500g脂肪酶溶于pH为7.5的0.2mol/L磷酸缓冲液1000ml中，即为浓度为2.5mg/ml脂肪酶溶液。

4)称取直径为100nm的纳米级聚丙烯腈碳纤维1g，将碳纤维浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后70℃烘干。称取字体0.05g，加入pH为7.5的0.2mol/L磷酸缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。将处理好的载体0.05g浸渍于盛有2.5mg/ml的脂肪酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化2h。取出样品用pH为7.5的0.2mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得固定化脂肪酶样品。

5)将制得的固定化脂肪酶样品置于50℃水浴振荡器中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例3以聚丙烯腈活性碳纤维毡为载体制备固定化脂肪酶样品

具体方法如下：

1)脂肪酶购于国药集团化学试剂有限公司，产品编号：P107496。

2)pH为8.0的缓冲液配制：0.2mol/L磷酸氢二钠1894mL和0.2mol/L磷酸二氢钠106mL混合。

3)称取10.00g脂肪酶溶于pH为8.0的0.2mol/L磷酸缓冲液1000ml中，即为浓度为10mg/ml脂肪酶溶液。

4)称取聚丙烯腈活性碳纤维毡1g，浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后自然晾干。称取载体0.05g，加入pH为8.0的0.2mol/L磷酸缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。将处理好的载体0.05g浸渍于盛有10mg/ml的脂肪酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化4h。取出样品用pH为8.0的0.2mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得固定化脂肪酶样品。

5)将制得的固定化脂肪酶样品置于50℃水浴振荡器中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例4以不同直径的纳米级聚丙烯腈碳纤维为载体制备固定化果胶酶样品

具体方法如下：

1)果胶酶购于国药集团化学试剂有限公司，产品编号：P106810。

2)pH为3.0的缓冲液配制：0.1mol/L柠檬酸1860mL和0.1mol/L柠檬酸钠100mL混合。

3)称取5.000g果胶酶溶于pH＝3.0的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1000ml中，即为浓度为5mg/ml果胶酶溶液。

4)称取直径为50mn、200nm、500nm的纳米级聚丙烯腈碳纤维各1g，均分别将碳纤维浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后70℃烘干。称取三种直径的碳纤维各0.05g，加入pH＝3.0的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。

5)将步骤4)处理好的三种直径的载体0.05g浸渍于盛有5mg/ml的果胶酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化1h。取出样品用pH＝3.0的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得三种固定化果胶酶样品。

6)将制得的固定化果胶酶样品置65℃水浴振荡器中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例5以纳米级聚丙烯腈活性碳纤维为载体制备固定化果胶酶样品

具体方法如下：

1)果胶酶购于国药集团化学试剂有限公司，产品编号：P106810。

2)pH为3.6的缓冲液配制：0.1mol/L柠檬酸1490mL和0.1mol/L柠檬酸钠510mL混合。

3)称取2.500g果胶酶溶于pH＝3.6的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1000ml中，即为浓度为2.5mg/ml果胶酶溶液。

4)称取直径为250nm的纳米级聚丙烯腈活性碳纤维1g，将碳纤维浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后70℃烘干。称载体0.05g，加入pH＝3.6的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。将处理好的载体0.05g浸渍于盛有2.5mg/ml的果胶酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化3h。取出样品用pH＝3.6的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得固定化果胶酶样品。

5)将制得的固定化果胶酶样品置65℃水浴振荡器中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例6以聚丙烯腈活性碳纤维毡为载体制备固定化果胶酶样品

具体方法如下：

1)果胶酶购于国药集团化学试剂有限公司，产品编号：P106810。

2)pH为4.0的缓冲液配制：0.1mol/L柠檬酸1310mL和0.1mol/L柠檬酸钠690mL混合。

3)称取10.00g果胶酶溶于pH＝4.0的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1000ml中，即为浓度为10mg/ml果胶酶溶液。

4)称取聚丙烯腈活性碳纤维毡1g，浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后70℃烘干。称取载体各0.05g，加入pH＝4.0的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。将处理好载体0.05g浸渍于盛有10mg/ml的果胶酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化4h。取出样品用pH＝4.0的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得固定化果胶酶样品。

5)将制得的固定化果胶酶样品置65℃水浴振荡器中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例7以不同直径的纳米级聚丙烯腈活性碳纤维为载体制备固定化β-半乳糖苷酶样品

具体方法如下：

1)β-半乳糖苷酶购于上海丽珠东风生物技术有限公司。

2)pH为6.5的缓冲液配制：0.2mol/L磷酸氢二钠630mL和0.2mol/L磷酸二氢钠1370mL混合。

3)称取6.000gβ-半乳糖苷酶溶于pH为6.5的0.2mol/L磷酸缓冲液1000ml中，即为浓度为6mg/mlβ-半乳糖苷酶溶液。

4)称取直径为50mn、300nm、500nm的纳米级聚丙烯腈活性碳纤维各1g，分别将碳纤维浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后70℃烘干。称取三种直径的碳纤维各0.05g，加入pH为6.5的0.2mol/L磷酸缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。

5)将步骤4)处理好的三种直径的载体各0.05g浸渍于盛有6mg/ml的β-半乳糖苷酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化1h。取出样品用pH为6.5的0.2mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得三种固定化β-半乳糖苷酶样品。

6)将制得的固定化β-半乳糖苷酶样品70℃水浴振荡中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例8以聚丙烯腈碳纤维为载体碳纤维为载体制备固定化β-半乳糖苷酶样品

具体方法如下：

1)β-半乳糖苷酶购于上海丽珠东风生物技术有限公司。

2)pH为7.0的缓冲液配制：0.2mol/L磷酸氢二钠1220mL和0.2mol/L磷酸二氢钠780mL混合。

3)称取2.500gβ-半乳糖苷酶溶于pH为7.0的0.2mol/L磷酸缓冲液1000ml中，即为浓度为2.5mg/mlβ-半乳糖苷酶溶液。

4)称取直径为4μm的纳米级聚丙烯腈活性碳纤维1g，加入500ml石油醚为脱胶液，采用抽提的方法，抽提15h，其速度为28min/次。抽提结束后将碳纤维放入置于100℃烘箱干燥30min。将脱胶后浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后70℃烘干。称取0.05g，加入pH为7.0的0.2mol/L磷酸缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。将处理好载体0.05g浸渍于盛有2.5mg/ml的β-半乳糖苷酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化2.5h。取出样品用pH为7.0的0.2mol/L磷酸缓冲液，4℃冷冻干燥即得固定化β-半乳糖苷酶样品。

5)将制得的固定化β-半乳糖苷酶样品70℃水浴振荡中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例9以聚丙烯腈活性碳纤维毡为载体制备固定化β-半乳糖苷酶样品

具体方法如下：

1)β-半乳糖苷酶购于上海丽珠东风生物技术有限公司。

2)pH为7.5的缓冲液配制：0.2mol/L磷酸氢二钠1680mL和0.2mol/L磷酸二氢钠320mL混合。

2)称取10.00gβ-半乳糖苷酶溶于pH为7.5的0.2mol/L磷酸缓冲液1000ml中，即为浓度为10mg/mlβ-半乳糖苷酶溶液。

3)称取聚丙烯腈活性碳纤维毡1g，浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后自然晾干。称取三份聚丙烯腈活性碳纤维毡各0.05g，加入pH为7.5的0.2mol/L磷酸缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。将处理好的载体0.05g浸渍于盛有10mg/ml的β-半乳糖苷酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化4h。取出样品用pH为7.5的0.2mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得固定化β-半乳糖苷酶样品。

5)将制得的固定化β-半乳糖苷酶样品70℃水浴振荡中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例10以聚丙烯腈活性碳纤维毡为载体制备固定化β-甘露聚糖酶样品

具体方法如下：

1)β-甘露聚糖酶购于山东康地恩生物集团。

2)pH为5.0的缓冲液配制：0.2mol/L磷酸氢二钠1030mL和0.1mol/L柠檬酸970mL混合。

3)称取2.500gβ-甘露聚糖酶溶于pH为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1000ml中，即为浓度为2.5mg/mlβ-甘露聚糖酶溶液。

4)称取聚丙烯腈活性碳纤维毡1g，浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后自然晾干。称取聚丙烯腈活性碳纤维毡0.05g，加入pH为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。将处理好的载体0.05g浸渍于盛有2.5mg/ml的β-甘露聚糖酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化2h。取出样品用pH为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得固定化β-甘露聚糖酶样品。

5)将制得的固定化β-甘露聚糖酶样品置75℃水浴振荡器中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例11以不同直径的聚丙烯腈碳纤维为载体制备固定化β-甘露聚糖酶样品

具体方法如下：

1)β-甘露聚糖酶购于山东康地恩生物集团。

2)pH为5.6的缓冲液配制：0.2mol/L磷酸氢二钠1160mL和0.1mol/L柠檬酸840mL混合。

3)称取8.000gβ-甘露聚糖酶溶于pH为5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1000ml中，即为浓度为8mg/mlβ-甘露聚糖酶溶液。

4)分别称取直径为3μm、4μm、8μm的聚丙烯腈碳纤维各1g，均加入100ml乙醇为脱胶液，采用抽提的方法，抽提40h，其速度为30min/次。抽提结束后将碳纤维放入置于100℃烘箱干燥30min。将脱胶后三种直径的碳纤维浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后自然晾干。称取三种直径的碳纤维各0.05g，加入pH为5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。

5)将步骤4)处理好的载体0.05g浸渍于盛有8mg/ml的β-甘露聚糖酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化4h。取出样品用pH为磷酸氢二钠缓冲柠5.6的-檬酸液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得三种固定化β-甘露聚糖酶样品。

5)将制得的固定化β-甘露聚糖酶样品置75℃水浴振荡器中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

实施例12以纳米级聚丙烯腈活性碳纤维为载体制备固定化β-甘露聚糖酶样品

具体方法如下：

1)β-甘露聚糖酶购于山东康地恩生物集团。

2)pH为6.0的缓冲液配制：0.2mol/L磷酸氢二钠1263mL和0.1mol/L柠檬酸737mL混合。

2)称取10.00gβ-甘露聚糖酶溶于pH为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1000ml中，即为浓度为10mg/mlβ-甘露聚糖酶溶液。

3)称取500nm纳米级聚丙烯腈活性碳纤维1g，浸渍于50ml的无水乙醇中2h洗涤后自然晾干。称取载体0.05g，加入pH为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液20ml浸泡12h后70℃真空干燥。将处理好的载体0.05g浸渍于盛有10mg/ml的β-甘露聚糖酶溶液25ml的锥形瓶中，锥形瓶放入25℃水浴振荡器中，振荡速度170r/min，固定化1h。取出样品用pH为5.6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤3次，4℃冷冻干燥即得β-甘露聚糖酶样品。

5)将制得的固定化β-甘露聚糖酶样品置75℃水浴振荡器中恒温，振荡速度120r/min，每间隔20min，取出一份样品测定固定化酶的活性。

通过考察酶残留活性随时间的变化，研究固定化脂肪酶的热稳定性。得到各实施例中的参数如下表。