一种组织工程用海藻酸钠的制备方法

摘要

本发明涉及一种组织工程用海藻酸钠的制备方法，其以市售食品级海藻酸钠为原料，经活性炭吸附并形成凝胶，此凝胶分别经酸性溶液和碱性溶液浸泡，再经鳌合剂溶解并过滤与透析，最后在无菌环境下，用有机溶液将海藻酸钠析出并冷冻干燥。本发明通过上述过程去除海藻酸钠中杂蛋白、内毒素等杂质，获得组织工程用海藻酸钠。

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程用天然多糖，具体地说是一种组织工程用海藻酸钠的制备方法。

背景技术

海藻酸钠(简写NaAlG)又名褐藻胶，由β-D甘露糖醛酸(M)和α-L古罗糖醛酸(G)通过(1-4)糖苷键聚合而成的线性阴离子天然多糖，生物相容性良好，是组织工程热点材料之一[Wang W，Liu XD，Ma XJ，et al.J.Mater.Chem.，2006，16：3252-3267]。现有海藻酸钠制备方法包括酸凝酸化法、钙凝酸化法、钙凝离子交换法、酶解提取法等，但研究表明海藻酸钠中残留的杂蛋白、内毒素等杂质是影响其生物相容性的重要因素[Zimmermann U，Klock G，Federlin K，et al.Electrophoresis 1992，13(5)：269-74.]，对此，从上世纪七十年代开始，许多研究者都致力于海藻酸钠中杂蛋白、内毒素等杂质的去除研究，其中德国学者Klock等提出的Klock法与荷兰学者De Vos P提出的De Vos P法对于上述杂质的去除效果较好。Klock法可分为13个步骤[Klock G，Frank H，Houben R，et al.Appl Microbiol Biotechnol 1994Jan；40(5)：638-43]：(1)首先将海藻酸钠粉末分散在氯仿溶液中，萃取0.5小时后，分离海藻酸钠；(2)将海藻酸钠溶解在蒸馏水中(1.5％w/v)；(3)向海藻酸钠溶液中加入酸性活性炭，搅拌4小时后，溶液经膜过滤；(4)向海藻酸钠溶液中加入中性活性炭，搅拌4小时后，溶液经膜过滤，(5)将海藻酸钠溶液滴加到BaCl₂溶液中形成凝胶微球；(6)将上述凝胶微球置于1M醋酸溶液中浸泡14小时(pII 2.3)，将凝胶微球用蒸馏水洗涤，此步骤重复3次；(7)再将凝胶微球置于500mM柠檬酸钠溶液中浸泡8小时(pH 8.0)将凝胶微球用蒸馏水洗涤，此步骤重复3次；(8)将凝胶微球浸泡在5L(含有5％的丙酮)50％乙醇溶液中16小时；(9)再将凝胶微球转移至5L(含有5％的丙酮)70％乙醇溶液中，浸泡16小时后，先后经BaCl₂溶液与蒸馏水充分洗涤；(10)将凝胶微球置于到1L 250mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液中过夜(pH10.0)，得到的溶液经0.2μm硝酸纤维素膜过滤；(11)将溶液置于进行透析20小时(膜截流分子量为50kDa)；(12)最后在无菌环境中，用无水乙醇将海藻酸钠沉淀出来；(13)将上述海藻酸钠沉淀经12小时干燥，得到纯化海藻酸钠。该方法与本发明相比较：Klock法使用了氯仿毒性较大的有试剂；处理过程冗长；产率低。De Vos P法可分为9个步骤[De Vos P，De Haan BJ，Wolters GH，Strubbe  JH，Van Schilfgaarde  R.Diabetologia 1997；40(3)：262-270][KR20020039473 20020708]：(1)将海藻酸钠粗品溶解在1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸钠(EGTA)溶液中(1.0％w/v)，经膜过滤；(2)将溶液用2N HCl与20mM NaCl混合溶液调节pH 2.0，形成凝胶沉淀，用布氏漏斗过滤后(1.5mm)，再用0.01N HCl与20mM NaCl混合溶液洗涤凝胶沉淀3次；(3)将凝胶沉淀分散到100mL 0.01N HCl与20mM NaCl混合溶液中，再加入20mL氯仿和5mL正丁醇，剧烈震荡0.5小时后用布氏漏斗过滤，此步骤重复3次；(4)将凝胶沉淀用0.5N NaOH与20mM NaCl混合溶液(pH＝7.0)溶解；(5)将溶液用氯仿/正丁醇混合液萃取0.5小时(每100mL海藻酸钠溶液加入20mL氯仿和5mL正丁醇)，离心相分离，得到海藻酸钠溶液；(6)向海藻酸钠溶液中加入无水乙醇形成海藻酸钠沉淀(v海藻酸钠溶液∶v乙醇＝1∶2)，经布氏漏斗过滤；(7)将海藻酸钠沉淀先后经无水乙醇和乙醚洗涤；(8)最后在无菌环境中，将上述海藻酸钠沉淀经12小时干燥，得到纯化海藻酸钠。该方法与本发明相比较：De Vos P法原理为形成海藻酸凝胶，这使得高分子多糖易降解，产率低。方法中使用了氯仿毒性较大的有试剂，操作安全性差。

目前，我国国内海藻酸钠的生产制备仅限于食品级，对于海藻酸钠中的杂蛋白、内毒素等杂质的去除方法未见报道[周家华，崔英德，杨辉，等.食品添加剂[M].北京：化学工业出版社，2001：250-254.]，[中国专利01115139.0]。现有国内的海藻酸钠的制备方法不能满足我国国家食品药品监督管理局(www.sfda.gov.cn/WS01/CL0055/29538_1.html)颁布的组织工程用的高纯度海藻酸钠质量标准(YY/T 0606.8-2008《组织工程医疗产品第8部分：海藻酸钠》)。

发明内容

本发明针对国内尚无符合组织工程标准(YY/T 0606.8-2008)的海藻酸钠制备方法的现状，提出了一种组织工程用海藻酸钠的制备方法，本发明对已经公开的移植用海藻酸钠制备方法进行了工艺优化，提高了海藻酸钠中杂蛋白、内毒素的去除效果和纯化海藻酸钠的产率，建立了符合我国即将颁布的组织工程用海藻酸钠质量标准的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种组织工程用海藻酸钠的制备方法，包括去除原料海藻酸钠中杂蛋白、内毒素等杂质形成组织工程用产品的制备过程，以市售食品级海藻酸钠为原料，经活性炭吸附并形成凝胶，此凝胶分别经酸性溶液和碱性溶液浸泡，再经鳌合剂溶解并过滤与透析，最后在无菌环境下，用有机溶液将海藻酸钠析出并冷冻干燥。通过上述过程去除海藻酸钠中杂蛋白、内毒素等杂质，获得组织工程用海藻酸钠。

具体操作步骤如下：

1)将所述原料海藻酸钠(NaALG)溶解在蒸馏水中，其浓度为0.1～4％(w/v，g/ml)，加入一定质量活性炭(w海藻酸钠∶w活性炭＝20∶1～1∶1)，室温条件下机械搅拌0.5～20小时，溶液经膜过滤(0.8μm硝酸纤维素膜)去除固体杂质，获得的海藻酸钠溶液；

2)海藻酸钠(NaALG)溶液滴加到二价金属M盐溶液中形成凝胶微球(M：Ba²⁺，Ca²⁺)，经0.5～1小时聚合过程后，用蒸馏水充分洗涤凝胶微球；反应式为：NaALG+M²⁺→M(ALG)₂↓+Na⁺；

3)将2)中海藻酸盐(M(ALG)₂)凝胶微球转移至稀酸溶液中浸泡5～24小时(稀酸溶液：盐酸，醋酸，或二者任意比混合酸，调节溶液pH 2.0～4.0)，取出凝胶微球用蒸馏水充分洗涤；

4)将3)中得到的凝胶微球转移至碱性溶液中浸泡2～12小时(碱性溶液：柠檬酸钠溶液，磷酸钠盐溶液，二者任意比混合溶液，调节溶液pH 8.0～9.0)，取出凝胶微球用蒸馏水充分洗涤；

5)将4)中得到的凝胶微球溶解到螯合盐溶液中(螯合盐溶液：EDTA，EGTA，二者任意比混合液，调节溶液pH 10.0～12.0)，溶液经膜过滤(0.45μm，0.22μm硝酸纤维素膜)，再透析20～30小时得到海藻酸钠(NaALG)溶液(膜截流分子量12～14kDa)，最后在无菌环境中，将NaALG溶液缓慢倒入有机溶液中形成絮状沉淀(有机溶液：C1～C3的醇、醚、酮或他们的任意比混合物，v NaALG溶液∶v有机溶液＝1∶2～1∶10)，最后冷冻干燥获得组织工程用海藻酸钠。

本发明的有益效果是：

1、本发明利用物理吸附和化学螯合的协同作用方法去除原料海藻酸钠中杂蛋白、多酚等杂质，制备的海藻酸钠可作为的组织工程产品使用。

2、本发明采用制备方法简便易行，纯化后的海藻酸钠仍保持其物理化学的本质特征。

附图说明

图1为海藻酸钠照片，其中a为海藻酸钠原料(食品级)，外观：淡黄色粉末，b为纯化后的海藻酸钠，外观：白色粉末；

图2为不同方法制备的海藻酸钠中杂蛋白含量检测结果，其中图2a为标准曲线，图2b中A为海藻酸钠原料(食品级)；B为本发明制备的海藻酸钠；C为文献方法制备的海藻酸钠(Klock法)；D为文献方法制备的海藻酸钠(De Vos P法)；

图3为不同方法制备的海藻酸钠中内毒素含量检测，其中图3a为标准曲线，图3b中A为海藻酸钠原料(食品级)；B为本发明制备的海藻酸钠；C为文献方法制备的海藻酸钠(Klock法)；D为文献方法制备的海藻酸钠(De Vos P法)。

具体实施方式

实施例1

1、将市售食品级海藻酸钠12g溶解在1.2L蒸馏水中，加入1.2g活性炭，物理吸附1小时后，经硝酸纤维素膜(0.8μm)过滤得到无固体杂质的海藻酸钠溶液；

2、将步骤1中得到的海藻酸钠溶液通过喷头加到4.5L 50mM的BaCl₂中形成海藻酸钡凝胶微球，经0.5小时聚合过程后，取出凝胶微球，用蒸馏水充分洗涤凝胶微球；

3、将步骤2中得到的海藻酸钡凝胶微球转移到4.5L 1M醋酸中(pH 2.0，浸泡10h后取出凝胶微球，用蒸馏水充分洗涤；

4、将步骤3中得到的凝胶微球转移至4.5L 500mM的柠檬酸钠(pH 8.0)中浸泡5小时，然后取出凝胶微球，用蒸馏水充分洗涤；

5、将步骤4中得到的凝胶微球溶解到200mL 250mM EDTA中(pH10.0)，溶液分别经0.45μm和0.22μm硝酸纤维素膜过滤，再透析20小时(膜截流分子量12～14kDa)，得到海藻酸钠(NaALG)溶液；

6、最后在无菌环境中，将NaALG溶液缓慢倒入1L无水乙醇中形成絮状沉淀，沉淀经冷冻干燥(-50℃，10Pa)获得组织工程用海藻酸钠(图1)。

7、采用日本岛津公司UV-2250IPC型紫外可见分光光度仪测定不同方法制备的海藻酸钠中杂蛋白残余量，于562nm处测定吸光度。(图2)市售食品级海藻酸钠中的杂蛋白的含量为0.433％，本发明制备的海藻酸钠中杂蛋白含量为0.174％，文献报道的方法处理的海藻酸钠中杂蛋白含量分别为0.292％和0.325％。结果表明：本发明制备的海藻酸钠中杂蛋白去除率约为60％，效果最好。

8、采用天津大学无线电厂BET32C型内毒素测定仪，按照《中华人民共和国药典》(2005版)二部分附录XI E规定的方法进行测定不同纯化方法制备的海藻酸钠中内毒素物质残余量。(图3)市售食品级海藻酸钠中内毒素含量为2.933×10³EU/mL，本发明制备的海藻酸钠内毒素含量为0.153×10³EU/mL，文献报道的纯化方法制备的海藻酸钠的内毒素含量由分别降为0.284×10³EU/mL和0.407×10³EU/mL。结果表明，本发明制备的海藻酸钠中内毒素去除率达95％，效果最好。

实施例2

1、将市售食品级海藻酸钠18g溶解在1.2L蒸馏水中，加入3g活性炭，物理吸附4小时后，经硝酸纤维素膜(0.8μm)过滤得到无固体杂质的海藻酸钠溶液；

2、将海藻酸钠溶液通过喷头加到4.5L 75mM的BaCl₂中形成海藻酸钡凝胶微球，经1小时聚合过程后，取出凝胶微球，用蒸馏水充分洗涤凝胶微球；

3、海藻酸钡凝胶微球转移到4.5L 1.5M醋酸中(pH 2.0)，浸泡5h后取出凝胶微球，用蒸馏水充分洗涤；

4、将步骤3中得到的凝胶微球转移至4.5L 250mM的柠檬酸钠(pH 8.0)中浸泡8小时，然后将胶珠再次用蒸馏水充分洗涤；

5、将步骤4中得到的凝胶微球溶解到400mL 400mM EDTA中(pH10.0)，溶液经膜过滤(分别经0.45μm和0.22μm硝酸纤维素膜过滤)，再透析20小时(膜截流分子量12～14kDa)得到海藻酸钠(NaALG)溶液；

6、最后在无菌环境中，将NaALG溶液缓慢倒入2L无水乙醇中形成絮状沉淀，沉淀经真空干燥沉淀经冷冻干燥(-50℃，10Pa，)获得组织工程用海藻酸钠。

实施例3

1、与实例1相同；

2、二价金属M盐溶为CaCl₂，其它与实例1相同；

3、将步骤2中得到的海藻酸钙凝胶微球转移酸性溶液中浸泡8小时，其它与实例1相同；

4、将步骤3中得到的凝胶微球碱性溶液中浸泡2小时，其它与实例1相同；

5、鳌合剂为EGTA，其它与实例1相同；

6、与实例1相同。

实施例4

1、与实例2相同；

2、二价金属M盐溶为CaCl₂，其它与实例2相同；

3、将步骤2中得到的海藻酸钙凝胶微球转移酸性溶液中浸泡4小时，其它与实例2相同；

4、将步骤3中得到的凝胶微球碱性溶液中浸泡5小时，其它与实例2相同；

5、鳌合剂为EGTA，其它与实例2相同；

6、与实例2相同。