一株具诱导大豆抗莠去津的肺炎克雷伯氏菌及应用

摘要

本发明涉及一株处理大豆种子后具诱导大豆产生对阿特拉津抗性的肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)SnebYK的培养方法及其应用，属于微生物农药技术领域。本发明涉及的细菌菌株SnebYK，已于2009年11月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.3471。通过液体发酵培养制备，其代谢物处理大豆种子后，大豆种子萌发出苗时可以产生对阿特拉津的抗性。通过该细菌的代谢产物处理后的大豆可以与玉米等禾本科作物混种，采用统一阿特拉津除草剂除草，解决了玉米与大豆间套作的除草难题，具良好的应用开发前景。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种诱导大豆抗阿特拉津的肺炎克雷伯氏杆菌及应用。

背景技术：

阿特拉津是一种在世界范围内广泛使用的旱田除草剂，中文商品名为莠去津。阿特拉津(Atrazine)，化学名2-氯-4-乙氨基-6-异丙氨基-1，3，5-三嗪，是选择性三氮苯类除草剂，1952年由瑞士Ciba-Geigy化学公司开发。可用于玉米、高粱、甘蔗、果树、苗圃、林地等防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草。由于其优良的除草功效及低廉的价格，1959年投入商业生产。可与乙革胺，甲草胺，异丙甲学胺等多种酰胺类除草剂混合，增强除草活性和使用范围。在旱地除草剂品种中，阿特拉津占有重要地位。由于成本低且除草效果好，在世界各国得到了大面积的推广和使用，是国际上出售的除草剂中销售量最大的重要除草剂之一。国外使用该除草剂已有50年的使用历史，我国从80年代初开始使用。

除草剂对双子叶和单子叶作物具有严格的选择作用，除草剂大面积使用，使得作物间套作的优良栽培措施难以实现。特别是对玉米和大豆的间套作表现更为突出。通常玉米田要采用阿特拉津除草剂进行苗前封闭除草，而阿特拉津对大豆有较强的毒害作用，因此，生产者多是采用清种玉米或采用人工除草。对于大豆田，除草较为困难，大豆田的除草剂成本相对较高，使用除草剂易产生药害。

针对生产上存在这一问题，通过系统筛选获得一株细菌，利用该菌或该菌的代谢产物处理大豆种子，可诱导大豆在种子萌发和生长期间产生对除草剂阿特拉津的抗性，从而解决了大豆田用阿特拉津除草的问题。

发明内容：

本发明的目的是获得一株可诱导大豆在种子萌发和生长期间产生对除草剂阿特拉津抗性的菌株，将菌株按常规液体发酵培养后，可以用该菌或该菌的代谢产物，开发出处理大豆种子的种子处理剂，经过处理的大豆种子可以使大豆产生对大豆敏感的阿特拉津除草剂的抗性。

本发明筛选获得的一株细菌菌株是肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2009年11月24日；保藏登记入册的编号：CGMCC No.3471。肺炎克雷伯氏菌是从大量土壤细菌菌株中筛选出的一株对大豆具有强诱导活性的细菌菌株。肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK该菌株是罗在全于2007年7月从中国辽宁省营口市土壤细菌菌株中筛选出的一个细菌菌株。

本发明通过研究发现，土壤细菌有很多株细菌都具有一定的活性，从这些细菌中筛选出一株性状相对较好的菌株肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapenumoniae)Sneb YK进行了进一步的研究。

本发明还涉及用于诱导大豆种子的细菌代谢物，其是由本发明的细菌菌株肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapenumoniae)Sneb YK经过常规的液体发酵培养后提取制备的。

本发明的细菌菌株肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK是通过试管种培养后，再经扩大发酵培养来制备，其具体方法如下：

1.试管种培养

培养基配方为牛肉膏蛋白胨(NA)培养基，即成分：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂20g，加水至1000mL。

2.液体发酵培养

其中液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2％-0.4％、蛋白胨1％-2％、酵母浸膏0.1％-0.5％、蔗糖1％-2％、余下为蒸馏水，pH为7-9。

将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min^-1、发酵45-50小时，优选48h。

液体发酵的菌种可以通过大型发酵罐进行规模生产，其产品为发酵液或发酵液的制成品。

本发明还涉及一种大豆种子处理剂，其包含有效量的本发明所述的肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK本身或其代谢物作为有效活性成分。

本发明的肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK或其代谢物具有对大豆的诱导活性，可用于大豆的种子处理，处理后的大豆可以采用对大豆敏感的莠去津进行除草，从而解决大豆田用阿特拉津除草的问题。

具体实施方式：

为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。

实施例1：肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK的获得

取大豆田的土壤1g，加入无菌水100ml，取200μl，加入冷却至35℃以下的灭菌的20ml NA液体培养基，25℃下培养待菌落长出后，根据菌落色泽和边缘状态，挑取肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)菌落单独保存，进行扩繁和生理生化测定，培养性状符合肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)特征的保存备用。

实施例2：肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK的培养

首先对肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行大豆诱导活性试验，确定其对大豆的诱导作用。

将肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK的菌体接种到试管琼脂培养基上，培养基配方为NA培养基，即成分：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂20g，加水至1000mL。25℃培养10d，获得试管种。

再将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，培养基配方为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2％、蛋白胨1％、酵母浸膏0.5％、蔗糖1％、余下为蒸馏水，pH为8。在25℃下培养，摇床转速以180r·min^-1、发酵48h，形成的发酵液或发酵液的制成品可以直接或间接处理大豆种子。被处理的大豆种子可以种植在喷施莠去津除草剂的土壤中，大豆出苗时可以抵抗阿特拉津(莠去津)的药害。

实施例3：肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK的发酵

基本同实施例一，不同之处是将液体培养的菌种接种到1000L的发酵罐进行发酵，在25℃下培养，pH为8，发酵48h。

实施例4：肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK的发酵

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.3％、蛋白胨1％、酵母浸膏0.1％、蔗糖2％、余下为蒸馏水，pH为7。

实施例5：肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella penumoniae)Sneb YK发酵产品的使用

将发酵液稀释为10⁸cfu/L，按1∶50的比例处理包衣大豆种子，晾干后，将处理过的大豆种子正常播种，按150g/667m²喷施阿特拉津(莠去津)，大豆可以正常出苗生长。