用于治疗手足口病的抗病毒口服液的质量检测方法

摘要

用于治疗手足口病的抗病毒口服液的质量检测方法，涉及医药技术领域，其质量测定方法是用高效液相色谱一测多评的方法测定，10ml的抗病毒口服液中含(R，S)-告依春不得低于60μg，含连翘酯苷A不得低于1mg，含连翘苷不得低于0.25mg，含连翘酯素不得低于0.12mg。本发明的优点是方法简便，可一次测定抗病毒口服液中四个活性成分的含量，通过建立抗病毒口服液的活性成分的定量分析结果，综合评价抗病毒口服液的质量及其在治疗手足口病方面的药效，使抗病毒口服液有了真正可控的标准，同时在国内也首次提出了中成药制剂抗病毒口服液在治疗手足口病方面的药用物质基础。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，涉及一种中成药的质量检测方法，具体是一种用于治疗手足口病的抗病毒口服液的质量检测方法。

背景技术

抗病毒口服液收载于《中华人民共和国卫生部药品标准新药转正标准第二册》WS₃-(X-39)-92(z)，(中华人民共和国卫生部药典委员会编、1992年出版)。目前已载入2010年版药典一部(2010年10月1日正式执行)。产品为复方制剂，它是由板蓝根129g、石膏57g、芦根61g、地黄32g、郁金25g、知母25g、石菖蒲25g、广藿香29g、连翘46g的水提取物加药用辅料和水制成1000ml的抗病毒口服液。具有清热祛湿，凉血解毒之功效，用于风热感冒，温病发热及上呼吸道感染，流感、腮腺炎等病毒感染疾患。临床上用于风热感冒、温病发热引起的上呼吸道感染、流感及流行性腮腺炎等病毒感染性疾患，具有较好的疗效。

手足口病又称手足口综合征，是由肠道病毒引起的急性发疹传染病，临床上急性起病、发热，以口腔黏膜和手足皮肤发生疱疹为特征。根据其症状和特征，在中医学中手足口病当属“时疫”、“温病”等范畴。从本公司的临床研究结果来看，发现本公司的抗病毒口服液对手足口病有辅助治疗作用。由于复方中成药是由多味药材提取而成，其有效成分复杂，有效成分的含量更是与药材的产地、采集时间、保存质量，药材的提取方法和工艺控制条件等多种因素有关，如板蓝根是该药物处方中的君药，其药材的质量与提取的活性成分的量有密切关系，板蓝根有南板蓝根和北板蓝根，其所含的有效成分又不同。北板蓝根来源于十字花科植物菘兰，含抗病毒的特征性成分(R，S)-告依春(又称表告依春)。南板蓝根来源于爵床科植物马蓝，不含(R，S)-告依春，其抗病毒的药理活性远低于北板蓝根。连翘根据其采收期不同，可分为青翘和老翘两种，但均为连翘。果实初熟尚带绿色时采收，用沸水煮片刻或蒸熟后晒干，习称“青翘”；果实熟透时采收晒干，习称“老翘”。近年来的研究表明，青翘中总黄酮、连翘苷含量都高于老翘，且老翘中连翘苷含量低。

抗病毒口服液目前生产企业众多，导致产品质量鱼龙混杂，甚至有的企业产品不按标准要求投料，则产品的质量就更无法保证在临床上有对手足口病的治疗效果。

板蓝根为抗病毒口服液处方中的君药，在方中用量最大，其抗病毒的药理活性明显。但目前标准并未建立其含量测定指标。据文献“蓝根化学成分及其药理活性研究进展，齐齐哈尔医学院学报2008年第29卷第13期，1609页”，报道了板蓝根对柯萨奇B3病毒、肾综合征出血热病毒、乙型脑炎病毒、腮腺炎病毒、单纯疱疹病毒以及乙型肝炎病毒均有抑制作用。文献“连翘化学成分和生物活性研究.西北大学；中药学(专业)硕士论文2008年度”报道了：连翘提取物有抗柯萨奇B病毒及埃柯病毒的作用。鸡胚体外实验证明连翘对亚洲甲型流感病毒、鼻病毒17型等也有抵制作用。实验表明连翘苷、连翘酯苷有较强的体外抵制病毒作用。

据本发明人的研究，抗病毒口服液中(R，S)-告依春、连翘苷、连翘酯苷、连翘酯素四个成分含量的高低，会直接影响抗病毒口服液对治疗手足口病的疗效，所以对用于治疗手足口病的抗病毒口服液必需建立一种质量测定的方法来控制产品的专利，保证临床的疗效。因此，迫切需要一种简便的质量检测方法能同时定性和定量测定抗病毒口服液中(R，S)-告依春、连翘苷、连翘酯苷、连翘酯素四个成分。

发明内容

本发明的目的在于通过抗病毒口服液中四个主要活性成分(R，S)-告依春、连翘苷、连翘酯苷、连翘酯素的定性、定量分析，提供一种用于治疗手足口病的抗病毒口服液的质量检测方法。

本发明所说的抗病毒口服液为由药材板蓝根129g、石膏57g、芦根61g、地黄32g、郁金25g、知母25g、石菖蒲25g、广藿香29g、连翘46g的水提取物加药用辅料和水制成1000ml的抗病毒口服液，

其质量测定方法是用高效液相色谱一测多评的方法测定，10ml的抗病毒口服液中含(R，S)-告依春(即表告依春)不得低于60μg，含连翘酯苷A不得低于1mg，含连翘苷不得低于0.25mg，含连翘酯素不得低于0.12mg。

高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；洗脱是以乙腈为流动相A，用磷酸调PH值至2.7～2.9的水为流动相B组成的梯度洗脱液进行梯度洗脱，检测波长为236nm，理论板数按(R，S)-告依春峰计算，不得低于20000。

所说的高效液相色谱一测多评法包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：分别精密称定连翘苷、连翘酯素、(R，S)-告依春、连翘酯苷A对照品，分别加甲醇制成每1ml含连翘苷0.2mg、每1ml含连翘酯素0.25mg、每1ml含(R，S)-告依春0.02mg、每1ml含连翘酯苷A 0.1mg的溶液，摇匀，即得四个对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：取抗病毒口服液25ml，置125ml分液漏斗中，加乙酸乙酯25ml，振摇萃取3～6次，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，置10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液；

(3)分别吸取(R，S)-告依春、连翘苷、连翘酯苷、连翘酯素四个对照溶液，和抗病毒口服液供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，即得；

(4)计算：测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积，以外标法计算含量。

所说的梯度洗脱优选二流动相的体积百分浓度和时间关系按下表程序进行洗脱

时间(分钟)  流动相A(％)(v/v)  流动相B(％)(v/v)  0～22  7→18  93→82  22～29  18  82  29～31  18→23  82→77

时间(分钟)  流动相A(％)(v/v)  流动相B(％)(v/v)  31～40  23  77  40～53  23→40  77→60  53～60  40  60  60～65  40→7  60→93

本发明的优点是方法简便，可一次测定抗病毒口服液中四个活性成分的含量，通过建立抗病毒口服液的活性成分的定量分析结果，综合评价抗病毒口服液的质量及其在治疗手足口病方面的药效，使抗病毒口服液有了真正可控的标准，同时在国内也首次提出了中成药制剂抗病毒口服液在治疗手足口病方面的药用物质基础。

附图说明

图1是本发明对照品(R，S)-告依春的高效液相色谱色谱图；

图2是本发明对照品连翘酯苷A的高效液相色谱色谱图；

图3是本发明对照品连翘苷的高效液相色谱色谱图；

图4是本发明对照品连翘酯素的高效液相色谱色谱图；

图5是本发明所提供的抗病毒口服液(A样品)的高效液相色谱图；

图6是本发明所提供的抗病毒口服液(B样品)的高效液相色谱图；

图7是本发明所提供的抗病毒口服液(C样品)的高效液相色谱图；

图8是本发明采用梯度洗脱程序1所得的高效液相色谱图；

图9是本发明采用梯度洗脱程序2所得的高效液相色谱图；

图10是本发明采用梯度洗脱程序3所得的高效液相色谱图。

下面结合实施例和附图进一步阐述本发明的技术方案。

具体实施方式

实施例1：抗病毒口服液的制备

(A)样品：

处方：板蓝根129g、石膏57g、芦根61g、地黄32g、郁金25g、知母25g、石菖蒲25g、广藿香29g、连翘46g

制法：以上九味药材，加水提取二次，第一次加8倍量水，煎煮3小时，同时收集挥发油及挥发油乳浊液，加入羟丙基-β-环糊精包合；第二次加6倍量水，煎煮1小时20分钟，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.08(60℃)，加85％以上的乙醇使含醇量达70％，静置24小时，滤过，收集滤液，将滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.10(60℃)，滤过，加入挥发油包合物及蜂蜜、蔗糖，等，补加纯化水至1000ml，混匀，滤过至澄清，灌封，灭菌，即得。

药材来源：板蓝根：为十字花科植物菘蓝的干燥根，安徽产。连翘：为木犀科植物连翘的干燥果实，秋季果实初熟尚带绿色时采收，习称青翘，河南产。石膏：为硫酸盐类矿物硬石膏族石膏。芦根：为禾本科植物芦苇的干燥根茎，河北产。地黄：为生地黄，玄参科植物地黄的干燥块根，河南产。郁金：为姜科植物姜黄的干燥块根，习称“黄丝郁金”，四川产。知母：百合科植物知母的干燥根茎，河北产。石菖蒲：为天南星科植物石菖蒲的干燥根茎，浙江产。广藿香：为唇形科植物广藿香的干燥地上部分，广州产。

(B)样品：

处方与制法均同样品A。与样品A的不同之处在于板蓝根、连翘药材产地不同，板蓝根产地：四川，连翘产地：山西。

(C)样品：

处方与制法均同样品A。与样品A的不同之处在于板蓝根来源与产地、连翘药材产地与采收季不同，板蓝根：来源于爵床科植物马蓝的干燥根茎，产地：浙江。连翘产地：为木犀科植物连翘的干燥果实，果实熟透时采收，习称：老翘，产地：湖北。

实施例2测定实施例1样品(A)的(R，S)-告依春、连翘苷、连翘酯苷、连翘酯素四个成分的含量

1、仪器与试剂

仪器及试药Agilent 1200高效液相色谱仪，抗病毒口服液由申请人提供，乙腈为色谱纯，水为超纯水。(R，S)-告依春、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯素等对照药由中国药品生物制品检定所提供。

2、高效液相色谱

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水(用磷酸调PH值至2.85)为流动相B，按下表进行梯度洗脱，检测波长为236nm。理论板数按(R，S)-告依春峰计算，不得低于20000。

时间(分钟)  流动相A(％)(v/v)  流动相B(％)(v/v)  0～22  7→18  93→82  22～29  18  82  29～31  18→23  82→77  31～40  23  77  40～53  23→40  77→60  53～60  40  60  60～65  40→7  60→93

(1)对照品溶液的制备方法：分别取连翘苷、连翘酯素、(R，S)-告依春、连翘酯苷A对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含连翘苷0.2mg、连翘酯素0.25mg、(R，S)-告依春0.02mg和连翘酯苷A 0.1mg的四个溶液对照品溶液，摇匀，即得。

(2)供试品溶液的制备方法：取抗病毒口服液25ml，置125ml分液漏斗中，加乙酸乙酯25ml，振摇萃取3～6次，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，置10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，即得。

(3)测定法：分别吸取(R，S)-告依春、连翘苷、连翘酯苷、连翘酯素四个对照溶液，和抗病毒口服液供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，得高效液相图谱，见附图1。

(4)计算：测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积，以外标法计算得10m l中含(R，S)-告依春为208.5μg，连翘酯苷A 1.98mg，连翘苷0.49mg、连翘酯素0.37mg。

实施例3：测定实施例1样品(B)的(R，S)-告依春、连翘苷、连翘酯苷、连翘酯素四个成分的含量。

方法步骤同实施例2

图谱见附图2

计算得：抗病毒口服液每支含(R，S)-告依春为68.9μg/支，连翘酯苷A 1.47mg/支，连翘苷0.27mg/支、连翘酯素0.14mg/支。

实施例4：测定实施例1样品(C)的(R，S)-告依春、连翘苷、连翘酯苷、连翘酯素四个成分的含量。

方法步骤同实施例2

图谱见附图3

计算得：抗病毒口服液每支含(R，S)-告依春为0μg/支，连翘酯苷A 1.1mg/支，连翘苷0.25mg/支、连翘酯素0.12mg/支。

实施例5：梯度洗脱的条件筛选试验

在检测方法研究过程中，为了保证各检测峰的分离度、对称性最佳，在流动相组成确定后，我们对流动相梯度洗脱条件进行了研究。分别比较了不同浓度的流动相比例对色谱峰分离度的影响。最后根据图谱的信息量和峰分离度选择了最佳洗脱梯度，

梯度洗脱按下表程序1进行，结果见附图8

时间(分钟)  流动相A(％)(v/v)  流动相B(％)(v/v)  0～20  7→16  93→84  20～29  16  84  29～31  16→20  84→80  31～40  20  80

时间(分钟)  流动相A(％)(v/v)  流动相B(％)(v/v)  40～53  23→30  77→70  53～60  30  70  60～65  30→10  70→90

梯度洗脱按下表程序2进行，结果见附图9

时间(分钟)  流动相A(％)(v/v)  流动相B(％)(v/v)  0～21  7→18  93→84  21～29  18  82  29～31  18→21  82→79  31～40  21  79  40～53  23→35  77→65  53～60  35  65

梯度洗脱按下表程序3进行，结果见附图10

时间(分钟)  流动相A(％)(v/v)  流动相B(％)(v/v)  0～22  7→18  93→82  22～29  18  82  29～31  18→23  82→77  31～40  23  77  40～53  23→40  77→60  53～60  40  60

时间(分钟)  流动相A(％)(v/v)  流动相B(％)(v/v)  60～65  40→7  60→93

下面通过试验例证明抗病毒口服液的质量与治疗手足口病的效果，因手足口病从中医角度来讲，属于“温病”范畴。因此，药效学实验采用中医的温病模型进行实验。

试验例一抗病毒口服液对温病湿热症动物模型的实验研究

试验方法：将Wistar大鼠，雌雄各半，体重180～220g。在正常温湿度环境下(温度25℃，相对湿度55％)，以高糖高脂饲料饲养10天，然后将大鼠置于造模箱中(温度35℃，相对湿度95％)，每天造模9小时)。96h后灌胃给予鼠伤寒杆菌10⁹/ml(2ml/200g)，120h再感染一次(2ml/200g)，然后移出置于自然环境饲养并分组给药。分组后即刻将模型组10只大鼠腔动脉取血并分离血清备用。其余各组分别每天灌胃给药2次，7天后将大鼠腔动脉取血并分离血清备用。采用不同方法检测相关指标。造模成功后的动物随机分组，每组12只，分别为：湿热模型组、湿热模型治疗对照组、甘露消毒丹阳性对照组、抗病毒口服液ABC三种(各组成分的含量如下表所示：)。

编号  (R，S)-告依春含量(μg/10ml)  连翘酯苷A含量(mg/10ml)  连翘苷含量(mg/10ml)连翘酯素含量(mg/10ml)  A  208.5  1.98  0.49  0.37  B  68.9  1.47  0.27  0.14  C  0  1.1  0.25  0.12

另取大鼠10只，置于自然环境、普通饲料饲养，设为正常对照组。采用双抗夹心ELISA法，按试剂盒说明书测定各组大鼠血清G-CSF含量；以硝酸还原法检测大鼠血清NO含量；

试验结果：见表1、2、3

表2大鼠血清中G-CSF、NO的含量

注：与正常组比较^*＞0.05 ^**＜0.05 ^***＜0.01

与模型对照组比较△＞0.05 △△＜0.05 △△△＜0.01

与甘露消毒丹组比较#＞0.05 ##＜0.05 ###＜0.01

表3大鼠血清中淀粉酶和D-木糖的含量

注：与正常组比较^*＞0.05 ^**＜0.05 ^***＜0.01

与模型对照组比较△＞0.05 △△＜0.05 △△△＜0.01

与甘露消毒丹组比较#＞0.05 ##＜0.05 ###＜0.01

试验小结：

1、连续给药7d后，抗病毒口服液A、B组G-CSF水平已恢复接近正常水平，表明抗病毒口服液能有效控制感染。治疗前后各组动物血清中NO水平无明显变化，提示该指标相关性不强。

2、造模后，模型组动物血清D-木糖含量明显增高，说明高糖高脂饮食可引起大鼠血清D-木糖水平上升。连续给药7天后，抗病毒口服液各组血清D-木糖含量明显下降，B、C组血清D-木糖含量已恢复正常水平。

3、抗病毒口服液对温病湿热症动物模型，能有效控制感染，降低血清中G-CSF水平，其中C组不含(R，S)-告依春，血清G-CSF水平下降最慢，几乎与模型对照组相当。

试验例二抗病毒口服液对内毒素所致家兔发热的解热作用

实验方法：

取健康新西兰兔，置于22±2℃实验室内，每隔1小时测量肛温1次，共测4次，4次体温均在38.9-39.5℃的范围内，且最高最低体温差值不超过0.3℃的兔留用。动物禁食12小时后开始实验，每只兔测肛温2次，每次间隔45分钟，两次温差不得超过0.3℃，以两次体温的平均值作为该兔的正常体温。各兔正常体温在38.9-39.5℃范围内，耳缘静脉注射内毒素150EU/kg，60分钟后测量体温，较正常体温升高0.5℃以上的兔为造模成功。随机分组后给药，30分钟后测第1次体温，每隔1小时测体温1次，连续测4次。以给药后不同时间体温减相同动物的正常体温，比较各组间体温升高差值的差别，并作t检验。给药后4h从家兔耳缘动脉取血并分离血清备用。

实验结果：

1、对内毒素致家兔发热体温的影响，各组兔平均基础体温无显著差异，为38.9～39.2℃；静注内毒素60分钟后体温平均升高差值亦无显著差异，范围为0.78-0.94℃。随机分组给药后，模型对照组动物体温持续明显升高，并维持4小时以上。抗病毒口服液A组给药1小时后体温无明显降低，给药2小时后对内毒素所致兔发热有明显解热作用，与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，各时间点作用呈正相关；抗病毒口服液A组与阳性对照组各时间点平均体温降低差值无显著差异(P＞0.05)，表明二者作用强度接近。给药后4小时，抗病毒口服液A组及阳性对照组体温降低差值与模型对照组比较仍有显著性差异(P＜0.05)，表明解热作用可维持4小时以上。详见表5。

2、对各组家兔血清中TNF-a的影响

检测结果显示，抗病毒口服液A、B剂量组及阳性对照组均可显著降低家兔发热模型血清中TNF-a含量，与模型对照组比有显著性差异(P＜0.05)；抗病毒口服液A组与阳性对照组作用强度接近(P＞0.05)。详见表6。

表6抗病毒口服液对细菌内毒素所致兔发热模型TNF-a的影响

与模型对照组比较^*p＞0.05 ^**p＜0.05 ^***p＜0.01

与清开灵阳性对照组比较#p＞0.05 ##p＜0.05 ###p＜0.01

试验例总结：

1、抗病毒口服液A、B两组能明显改善大鼠温病湿热症症状，使大鼠血清粒细胞集落刺激因子G-CSF、血清D-木糖含量恢复到正常水平，并与甘露消毒丹阳性对照组作用强度接近。

2、抗病毒口服液A组能显著降低内毒素致家兔发热模型的体温，解热作用可维持4小时以上；抗病毒口服液A、B剂量组均能通过抑制肿瘤坏死因子TNF-a的生成和释放达到清热作用，并与阳性对照组作用强度接近。

以上试验结果提示，抗病毒口服液可提高机体的抵抗力，清除致病因子的影响，同时有作用解热及减轻临床症状，对手足口病具有一定的治疗作用。其药效作用强度与四个活性成分含量高低相关。四个成分含量越高，其药理活性越强。

通过上述的试验证明：本发明通过建立抗病毒口服液中(R，S)-告依春、连翘苷、连翘酯苷、连翘酯素四种主要活性成分的含量测定方法，表征了四个主要的改善大鼠温病湿热症的活性成分与治疗手足口病疗效之间的量效关系，来评价抗病毒口服液的质量和疗效是切实可行的。