一种羟基磷灰石纳米颗粒放射性核素标记产物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种羟基磷灰石纳米颗粒放射性核素标记产物及其制备方法，所述的羟基磷灰石纳米颗粒标记产物可由下述方法制备获得，其步骤为：(a)硅烷偶联剂对羟基磷灰石纳米颗粒进行氨基化表面改性；(b)

说明书

技术领域

本发明涉及一种羟基磷灰石纳米颗粒放射性核素标记产物及其标记技术，具体地说，是一种标记有放射性核素¹²⁵I的羟基磷灰石纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

羟磷灰石(Hydroxyapatite，HA)是种弱碱性的磷酸钙盐，分子式为Ca₁₀(PO4)₆(OH)₂，是人体和动物骨骼、牙齿等硬组织的主要无机成分。机体硬组织中的天然羟基磷灰石是种呈针状六方棱形的纳米结构，长度为200-400nm，厚度为15-30nm。人工合成的羟基磷灰石具有优良的生物相容性和化学稳定性，广泛地应用骨缺损的修复治疗。羟基磷灰石纳米颗粒不但具有良好的生物相容性和生物活性，还具有纳米材料独特的小尺寸效应和表面效应。将纳羟基磷灰石纳米颗粒植入于骨组织后，能与骨组织形成牢固的化学键结合，且具有骨传导性和骨诱导性，已广泛地应用于各种骨缺损的修复治疗，是目前组织工程植入材料研究的重点和热点之一。

由于羟基磷灰石纳米颗粒具有纳米材料的独特性能，表现出尺寸小、比表面积大、表面活性高、吸附能力强等优良特性和新的功能，能够有选择性地作用于特殊组织和细胞。有研究将羟基磷灰石纳米颗粒作为载体，应用于缓释药物的开发；也有研究利用羟基磷灰石纳米颗粒诊断和治疗各种肿瘤。

随着纳米技术的发展，纳米材料在生物医学领域的应用将日趋广泛，关于纳米材料的生物安全性问题也将逐渐被人们所重视。研究纳米材料的生物安全性，就有必要对纳米材料在机体中的应用进行示踪，以研究纳米材料在机体中代谢的生物学分布和评价纳米材料对机体功能的影响。对纳米材料进行放射性核素标记是研究纳米材料体内生物学分布的重要方法。另外，通过对羟基磷灰石纳米颗粒的放射性核素标记，可以为开发以羟基磷灰石纳米颗粒为载体的放射性治疗药物提供技术基础。

目前，对羟基磷灰石纳米颗粒进行放射性核素标记的常用方法主要是采用吸附法分别将标记有放射性核素的膦酸盐配体吸附于羟基磷灰石表面或采用离子交换法将放射性核素与羟基磷灰石中的离子进行交换，实现对羟基磷灰石纳米颗粒进行标记，用于羟基磷灰石纳米颗粒标记的放射性核素有¹⁵³Sm、⁹⁰Y、^99mTc等。但现有的羟基磷灰石纳米颗粒标记技术对其在体内显像和生物学分布研究应用方面存在诸多不足，主要归纳有以下几点：

(1)体内稳定性差：现有的标记方法中通过吸附配体对羟基磷灰石纳米颗粒进行放射性核素标记，这种吸附性结合在体内稳定性较差，标记物容易在体内脱落。另外，一些配体在体内对某些组织具有较高的特异性结合能力，如膦酸盐对骨组织具有较强的吸附性，这有可能影响羟基磷灰石纳米颗粒在体内的分布情况。

(2)没有合适的半衰期：由于羟基磷灰石是种化学性能稳定的无机物质，在体内降解周期长，所以要研究羟基磷灰石纳米颗粒在体内的生物学分布，就要求标记的放射性核素具有合适的半衰期。目前能与羟基磷灰石进行离子交换的放射性核素中，大多半衰期过短，如¹⁵³Sm的半衰期为46.3h，⁹⁰Y的半衰期为64.1h，^99mTc的半衰期为6.02h，这些放射性核素的半衰期都不适合用于研究羟基磷灰石纳米颗粒的体内生物学分布。

(3)放射性活度检测的不便：为研究羟基磷灰石纳米颗粒的体内生物学分布情况，需要对体内重要脏器进行放射性活度的定量检测。目前，常用的放射性核素的放射性活度多采用液体闪烁技术检测。在进行体内生物学分布研究时，需在对器官组织内的放射性活度检测前将器官组织进行消化，使其变成液态，如果液体有颜色还要进行脱色，同时放射性测量时要进行淬灭校正，这将极大增加器官组织放射性活度测定的难度和成本。

¹²⁵I是种常用的放射性核素，具有合适的半衰期，广泛地应用于各种生物标记及生物检测。羟基磷灰石纳米颗粒作为一种无机纳米颗粒，表面缺少可以直接用来进行放射性核素¹²⁵I标记的官能基团，所以很难将¹²⁵I直接标记到羟基磷灰石纳米颗粒上。

硅烷偶联剂是种具有特殊结构的低分子有机硅化物，也是种重要的无机纳米颗粒表面改性材料。硅烷偶联剂的通式为RSiX₃，R代表氨基、巯基、乙烯基、环氧基、氰基及甲基丙乙烯酰氧基等基团，X代表能够水解的基团，如卤素、烷氧基、酰氧基等。硅烷偶联剂对无机纳米材料的表面改性主要是通过形成化学键实现的。

羟基磷灰石纳米颗粒表面存在羟基，它可以与硅烷偶联剂中的烷氧基、酰氧基等基团形成化学键结合，而硅烷偶联剂另一段的氨基、环氧基等基团可以标记上¹²⁵I，从而实现对羟基磷灰石纳米颗粒进行放射性核素标记。由于硅烷偶联剂与羟基磷灰石纳米颗粒是通过化学键的形式结合的，¹²⁵I也是标记在硅烷偶联剂中的氨基、环氧基等基团上。所以，设计这种方法对羟基磷灰石纳米进行¹²⁵I标记，能够获得比较稳定的标记产物，所获得的标记产物能够应用于羟基磷灰石纳米颗粒的体内显像和生物学分布研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够应用于羟基磷灰石纳米颗粒的体内显像和生物学分布研究的羟基磷灰石纳米颗粒¹²⁵I标记产物。

本发明的另一目的在于提供所述标记产物的制备方法。

为实现上述目的，本发明公开以下技术方案：首先，硅烷偶联剂稀释溶液处理羟基磷灰石纳米颗粒，使其硅烷氨基化。其中硅烷偶联剂为氨基丙基三乙氧基硅烷(分子式为：(CH₃CH₂O)₃SiCH₂CH₂CH₂NH₂)；其氨基丙基三乙氧基硅烷的稀释溶液配比为：偶联剂∶乙醇＝1∶5V/V；其稀释溶液的PH值为8。其次，制备¹²⁵I-BH标记物。再次也是最重要的，¹²⁵I-BH标记物与氨基化的羟基磷灰石纳米颗粒连接。其中氨基化的羟基磷灰石纳米颗粒经过以下处理：在0.05mol/L pH 8.4的硼酸缓冲液中，并通过40KHz超声振荡15min；所述连接在以下条件下进行：冰浴中搅拌反应30min，再加入0.2mol/L的甘氨酸溶液(0.05mol/L pH 8.4的硼酸缓冲液配制)。

本发明具有以下有益效果：

(1)选用化学活泼性高的放射性核素¹²⁵I，它具有合适的半衰期，为60天，可以用于羟基磷灰石纳米颗粒体内显像和生物学分布研究，使放射性污染易于控制和处理。放射性核素¹²⁵I可以发射γ射线，穿透力强，可以定量和直观的检测羟基磷灰石纳米颗粒的体内生物学分布和显像。利用¹²⁵I发射γ射线的特性，可以在不进行组织消化、不使用液体闪烁技术的情况下，使用γ计数器简便快捷地对羟基磷灰石纳米颗粒进行体内显像和生物学分布研究。

(2)采用硅烷偶联剂对羟基磷灰石纳米颗粒进行表面改性，硅烷偶联中烷氧基、酰氧基等基团与羟基磷灰石纳米颗粒表面的羟基进行化学键结合，¹²⁵I则标记到硅烷偶联剂中的氨基、环氧基等基团上，通过这种标记方法所得到的¹²⁵I标记产物稳定，可以用于羟基磷灰石纳米颗粒的体内显像和分布学研究。

(3)硅烷偶联剂是通过与羟基磷灰石纳米颗粒表面的羟基进行结合，具有比较高的稳定性；硅烷偶联剂属于低分子的有机硅化物，通过它对羟基磷灰石纳米颗粒进行¹²⁵I标记，对羟基磷灰石纳米颗粒的尺寸大小影响很小。通过X射线衍射(XRD)和透射电镜(TEM)检测，所得到的标记产物为羟基磷灰石组成相，其几何尺寸在标记前后基本未变化，仍属于纳米颗粒的范畴。

附图说明

图1为硅胶薄层纸层析法(ITLC/SG法)对羟基磷灰石纳米颗粒标记产物的鉴定结果图；

图2为羟基磷灰石纳米颗粒标记产物的室温环境下32天的稳定性变化的结果图；

图3为羟基磷灰石纳米颗粒标记产物的XRD检测结果；

图4a为羟基磷灰石纳米颗粒标记前的TEM检测图；

图4b为羟基磷灰石纳米颗粒标记产物的TEM检测图。

具体实施方式

下面结合具体实验及其结果分析和相应的说明书附图，对本发明进一步详细说明。

(1)羟基磷灰石纳米颗粒的硅烷氨基化

将羟基磷灰石纳米颗粒置于无水乙醇溶液中，40KHz频率下超声30min，用无水乙醇反复清洗后备用。在90mL乙醇溶剂中加入10mL氨基丙基三乙氧基硅烷(分子式为：(CH₃CH₂O)₃SiCH₂CH₂CH₂NH₂)的稀释溶液(偶联剂∶乙醇＝1∶5，V/V)，滴加氢氧化钠溶液使溶液pH值为8，室温下继续搅拌水解1h。将200mg羟基磷灰石纳米颗粒加入到水解偶联剂溶液中，50～60℃的水浴中搅拌反应6h，反应结束后，室温放置2天，过滤，用乙醇洗涤，真空干燥得到氨基改性羟基磷灰石纳米颗粒。

(2)¹²⁵I-BH标记物的制备

将5mg对羟基苯丙酸琥珀酰亚胺脂试剂(Bolton-hunter试剂，BH试剂)溶解在500μl重蒸馏苯中，取5μg BH试剂苯溶液于小反应管内，氮气吹干后，依次加入2μl分析纯的N，N二甲基甲酰胺(DMF)和1.5μl Na¹²⁵I溶液(60MBq)，然后加入5μl(20μg)氯胺T(Ch-T)溶液，室温下反应1min后马上加入5μl(60μg)的偏重亚硫酸钠，和50μl(200μg)的碘化钾溶液(0.05mol/L pH7.4的磷酸缓冲液新鲜配制)，混匀终止反应。在上述反应液中加入5μl N，N二甲基甲酰胺(DMF)，250μl重蒸馏苯提取¹²⁵I-BH试剂，再小心吸出苯溶液于小反应管中，并氮气吹干，即得¹²⁵I-BH标记物。(3)¹²⁵I-BH标记物与氨基化的羟基磷灰石纳米颗粒连接

将上述步骤(2)中装有¹²⁵I-BH标记物的小反应管置于冰浴中，加入50μl上述步骤(1)中制得的硅氨基化的羟基磷灰石纳米颗粒溶液(含量为100μg，在0.05mol/L pH 8.4的硼酸缓冲液，并通过40KHz超声振荡15min)，冰浴中搅拌反应30min，再加入150μl 0.2mol/L的甘氨酸溶液(用0.05mol/L pH 8.4的硼酸缓冲液配制)，室温下继续搅拌反应15min，以除去过量的¹²⁵I-BH标记物。

将上述小反应管中取出反应液到5ml的离心管中，加入2ml 50％乙醇水溶液，超声振荡20min后，4℃，3000rpm离心10min，吸去上清液，沉淀物即为标记产物。用4ml 50％乙醇水溶液分二次离心洗涤沉淀物，再用2ml乙醇离心洗涤沉淀物后，加入1ml乙醇，超声振荡20min，冻干备用。

(4)标记产物的鉴定

采用硅胶薄层纸层析法(ITLC/SG法)进行鉴定。以快速硅胶薄层层析纸(ITLC/SG)为载体，用2.5％BSA(W/W)的0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液展开，然后将每条层析纸剪成1cm等距离的小纸条，放入放射性测量试管中进行测定。¹²⁵I-BH标记物、¹²⁵I-甘氨酸和¹²⁵I^- Rf值都在0.80～1.00范围，而已标记的羟基磷灰石纳米颗粒Rf值是0.00，在纸层析条原点不动，与未标记的羟基磷灰石纳米颗粒在纸层析条中展开行为相同。经以上方法鉴定所制得的标记产物放射性化学纯度≥95％(见附图1)。

(5)标记产物的稳定性检测

将标记产物分散于0.01mol/LpH值为7.4的PBS溶液中，室温保存，定期采用硅胶薄层纸层析法(ITLC/SG法)检测溶液中放射性物质的性质，根据纸层析条带原点位置上的放射性计数与整个纸层析条带放射性计数的比值计算未解离的标记产物的百分率，从而评价标记产物的稳定性。结果显示，室温放置32天后，标记产物的稳定性良好(见附图2)。

(6)标记产物的表征

采用X射线衍射(XRD)和透射电镜(TEM)检测所得到的羟基磷灰石纳米颗粒标记产物的组成相及粒径变化情况，其结果请见图3、图4a及图4b所示，所得到的标记产物为羟基磷灰石组成相，其几何尺寸在标记前后基本未变化，仍属于纳米颗粒的范畴。