抗原组合物及其在核酸的靶向递送中的应用

摘要

本发明提供了用于将治疗性核酸递送至靶细胞的方法和组合物。提供了一种嵌合抗原以将核酸分子包封、结合或以其他方式携带至靶细胞，其中该嵌合抗原和核酸通过受体介导的胞吞作用被内在化。嵌合抗原具有核酸相互作用结构域、靶结合结构域、以及可以包括靶抗原的免疫应答结构域。靶向通常通过用于特定靶细胞受体的靶结合结构域的特异性来提供，但是也可以通过在免疫应答结构域内包括靶向抗原来提供。嵌合抗原和核酸(其可以是siRNA)的组合递送在某些应用，例如在破坏对病毒的宿主耐受性中或在提供免疫刺激中可以是协同作用的。

说明书

技术领域

本发明涉及用于递送核酸的组合物。更具体地，提供了用于将核酸进行包封、结合、或以其他方式携带和递送至靶细胞的嵌合抗原。

背景技术

尽管近来在核酸治疗剂的鉴定和精制中的进步，但是找到在各种应用中用于这些分子的合适递送方式已被证实具有挑战性。此外，虽然期望通过将核酸治疗剂定位或靶向至感兴趣的组织/细胞来最小化这些昂贵分子的剂量，但是已经考察的许多技术没有有前景的结果。

RNAi[Fire A.，et al(1998)Nature 391：801-11]已作为一种方式出现，用于序列特异性的、posT转录基因沉默，其由与该靶向用于沉默的基因同源的短干扰RNA(siRNA)介导。然而，为了有效地用作药物，siRNA(或它们的较大RNA前体)必须被直接递送到靶细胞中。siRNA靶向递送到感兴趣的特定细胞中已经成为通过RNAi技术实现体内基因沉默的主要障碍。特异性递送、剂量减少和最小化毒性都是该领域中重要的未实现的目标。

已经出现潜在的靶向siRNA递送系统，如抗体介导的递送和脂质体递送。抗体介导的siRNA递送可以在对正常组织具有较小影响的情况下允许siRNA在靶细胞中优先积累，并且已经提出这样的配体可以进一步结合于递送试剂如脂质体，以通过受体介导的胞吞作用促进摄入到靶细胞中。

用于将siRNA体内递送至特定靶细胞的另外的潜在方法利用鱼精蛋白的核酸结合性能，联合抗体介导的递送的特异性。与抗体片段鱼精蛋白融合蛋白复合的siRNA的注射已被用来选择性地将siRNA递送到靶细胞中，该靶细胞表达由该抗体识别的细胞表面受体[在Dykxhoorn，D.M.，et al(2006)Gene Therapy 13-541-552；SongE.et al(2005)Nature Biotech.23(6)：709-717中进行了综述]。

特定细胞型或靶向器官通常将随着被递送的治疗剂的类型而改变。例如，树突细胞在癌症免疫疗法应用中可以是关键焦点，因为这些有效的抗原呈递细胞能够独特地诱导免疫性以破坏对癌症抗原的耐受性。已经提出RNAi(RNA干扰)可以通过靶向树突细胞中的基因表达而被用于免疫调节[Hill，J.A.，et al(2003)J.Immunol.171：691-696]。

SOCS-1已表明控制树突细胞的耐受原(致耐原的，tolerogenic)和免疫原状态，以及抗原呈递的程度和由此的适应性免疫(获得性免疫)的大小[在Yoshimura，A.，et al(2007)Nature Rev.Immunol.7：454-465中进行了综述]。通过siRNA进行的SOCS-1的沉默增强通过树突细胞的抗原呈递以及抗原特异性抗肿瘤免疫性，并且可以提供一种破坏宿主耐受性、增强抗原特异性抗肿瘤和抗病毒免疫性、以及增加基于树突细胞的癌症疫苗的效力的选择性方式。在树突细胞中沉默SOCS-1可以降低细胞对内源性刺激的应答性的阈值，允许体内抗原特异性T细胞的持久激活，并且提高T细胞的抗癌活性。

在体外研究中，当在利用癌抗原接种疫苗之前SOCS-1在树突细胞中被沉默时，树突细胞表现出增强的抗原特异性抗肿瘤免疫性[Shen，T.(2004)Nature Biotech 22(12)：1546-1553]。在小鼠中的体内研究中，SOCS-1的沉默诱导抗-HIV-1CD8+和CD4+T细胞应答以及抗原应答[Song，X-T.et al(2006)PLoS Med 3：1-18]。

已经提出siRNA在治疗病毒病中的应用。尤其是，慢性病毒病的表现依赖于宿主免疫系统的失效(或回避)。已推测，病毒性基因表达可以通过将病毒特异性siRNA给予受感染的宿主而沉默。

在患有慢性病毒感染或寄生虫感染(其中有机体在其生命周期期间的某些点停留在宿主细胞内)的受治疗者中，抗原由宿主细胞产生并在宿主细胞中表达，并且分泌的抗原存在于循环中。作为一个实例，在慢性人乙肝病毒(HBV)感染的载体的情况下，病毒体、HBV表面抗原、以及核心抗原的替代物(以e-抗原的形式)可以在血液中进行检测，但明显地通过宿主免疫系统耐受。

类似地，在癌症中，肿瘤从免疫监视和攻击逃脱对于宿主中的肿瘤存活是主要决定因素。对于用于引发或增强针对传染病或癌症的免疫应答、或用于破坏对传染病或癌症的耐受性的新的治疗有效的化合物、组合物和方法存在需要。

发明内容

根据本发明的第一个方面，提供了一种用于抑制靶细胞内靶基因的表达的方法，该方法包括以下步骤：提供适合于实现靶基因的RNAi的核酸分子；提供嵌合抗原，其包括：包含对应于HBV核心蛋白或其片段的氨基酸序列的核酸结合结构域，和包含用于结合至靶细胞上的受体的配体的靶结合结构域；以及将该核酸分子和嵌合抗原给予所述靶细胞。

在一个实施方式中，将核酸分子和嵌合抗原给予靶细胞的步骤包括使核酸分子与适量的嵌合抗原混合以形成核酸递送复合物，然后将该核酸递送复合物给予靶细胞。

在各种实施方式中，HBV核心蛋白片段可以是HBV核心蛋白的装配(assembly)结构域、HBV核心蛋白的鱼精蛋白结构域、或任何其他合适的HBV核心蛋白片段。

在某些实施方式中，核酸结合结构域可以操作性地连接至靶结合结构域的N-端或C-端。

在一个实施方式中，靶细胞是哺乳动物宿主细胞，并且将核酸和嵌合抗原给予靶细胞的步骤包括将所述核酸和嵌合抗原给予哺乳动物宿主。在这样的实施方式中，靶结合结构域可以包括异源性(xenotypic)抗体片段。

根据本发明的第二方面，提供了一种用于引发对靶抗原的免疫反应的方法，该方法包括以下步骤：提供适合于实现靶基因的RNAi的核酸分子；提供嵌合抗原，其包括：包含对应于HBV核心蛋白或其片段的氨基酸序列的核酸结合结构域，包含用于结合抗原呈递细胞上的受体的配体的靶结合结构域，和包含靶抗原的免疫应答结构域；以及将该核酸分子和嵌合抗原给予所述靶细胞。

在一个实施方式中，将核酸分子和嵌合抗原给予靶细胞的步骤包括首先使核酸分子与适量的嵌合抗原混合以形成核酸递送复合物，然后将该核酸递送复合物给予靶细胞。

在各种实施方式中，HBV核心蛋白片段可以是HBV核心蛋白的装配结构域、HBV核心蛋白的鱼精蛋白结构域、或任何其他合适的HBV核心蛋白片段。

在某些实施方式中，核酸结合结构域可以操作性地连接至靶结合结构域的N-端或C-端。

在一个实施方式中，靶结合结构域包括异源性抗体片段。

在特定实施方式中，靶基因是免疫调制基因或病毒基因，并且靶抗原可以是癌抗原、病毒抗原、或任何其他合适抗原。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于沉默靶细胞内靶基因的表达的组合物，该组合物包括：对应于靶基因的核酸序列；以及嵌合抗原，其包括对应于HBV核心蛋白或其片段的核酸相互作用结构域、和可操作性地连接至该核酸相互作用结构域的靶结合结构域，该靶结合结构域包括用于结合至靶细胞表面上的受体的配体。

在某些实施方式中，靶基因可以是免疫调制基因或病毒基因。

在一个实施方式中，靶结合结构域是异源性Fc片段。

在各种实施方式中，核酸序列是siRNA、shRNA、反义DNA、或用于抑制靶基因表达的质粒。

在合适的实施方式中，HBV核心蛋白片段可以是HBV核心蛋白的装配结构域、鱼精蛋白结构域、或另一个片段。

在一个实施方式中，所述配体与受体的结合启动嵌合抗原和核酸的内在化，例如通过受体介导的胞吞作用。

根据本发明的第四方面，提供了一种用于将核酸递送至靶细胞的嵌合抗原，该嵌合抗原包括：对应于HBV核心蛋白或其片段的核酸相互作用结构域；和操作性地连接至该核酸相互作用结构域的靶结合结构域，该靶结合结构域包括用于结合至靶细胞表面上的受体的配体。

在合适的实施方式中，HBV核心蛋白片段是HBV核心蛋白的鱼精蛋白结构域或HBV核心蛋白的装配结构域。

在一个实施方式中，核酸相互作用结构域连接至靶结合结构域的C-端。

在一个实施方式中，嵌合抗原进一步包括第二核酸相互作用结构域，其操作性地连接至靶结合结构域，该第二核酸相互作用结构域对应于HBV核心蛋白或其片段。

在其他实施方式中，嵌合抗原进一步包括包含抗原性氨基酸序列的免疫应答结构域，其操作性地连接至核酸相互作用结构域，或者连接至靶结合结构域。该免疫应答结构域可以提供对次级(secondary)靶细胞的靶向。

在阅读本发明结合附图的具体实施方式的以下描述之后，对于本领域的普通技术人员来说，本发明的其他方面和特征将变得明显。

附图说明

现在将通过仅为举例的方式，参照附图来描述本发明的实施方式，其中：

图1是嵌合抗原的示意图；

图2a是HBV核心蛋白的示意图；

图2b提供了HBV核心蛋白的核苷酸和氨基酸序列；

图3a-c提供描述了三种嵌合抗原的示意图，其中HBV核心的鱼精蛋白结构域提供NAID；

图3d提供图3c中所示的嵌合抗原的核苷酸和氨基酸序列；

图4a提供描述了嵌合抗原的示意图，其中HBV核心蛋白序列被包含在免疫应答结构域内以提供NAID；

图4b提供图4a所示的嵌合抗原的核苷酸和氨基酸序列；

图5是关于核酸分子的嵌合抗原聚集的示意图；

图6a-c是嵌合抗原颗粒的照片；

图6d是指示所述颗粒的平均尺寸的曲线图；

图7a-c是嵌合抗原颗粒的照片；

图7d是指示所述颗粒的平均尺寸的曲线图；

图8a示出了试验中使用的GFP载体质粒的结构；

图8b是DNA酶消化结果的照片，其中DNA被保护以防止通过与嵌合抗原疫苗形成复合物而引起的降解；

图9示出了嵌合抗原疫苗与树突细胞的结合；

图10示出了嵌合抗原疫苗与HepG2细胞的结合；

图11a示出了具有包封shRNA的S1/S2核心疫苗与树突细胞的结合；

图11b示出了具有包封siRNA的S1/S2核心疫苗与树突细胞的结合；

图12a和图12b示出了在用具有包封shRNA质粒的HBV S1/S2核心疫苗(SOCS1或非靶向的)一次和两次刺激之后T细胞的IFN-γ的产生；

图13a-d示出了在用具有包封shRNA质粒的HBVS1/S2核心疫苗(SOCS1或非靶向的)刺激之后在CD8+和CD4+T细胞中IFN-γ和TNF-α的产生；

图14示出了在嵌合抗原处理之后T细胞的扩展；

图15示出了在嵌合抗原处理后树突细胞中的CD86表达；

图16示出了在嵌合抗原处理后T细胞培养物中IFN-γ的产生；

图17示出了在用嵌合抗原第二次刺激之后在CD8+和CD4+T细胞中IFN-γ和TNF-α的产生；

图18示出了在嵌合抗原处理之后的T细胞扩展(expansion，数量扩大)；

图19示出了在有或没有CD86siRNA的情况下在嵌合抗原处理之后的CD86表达；

图20示出了HBV S1/S2核心疫苗和siRNA复合物与树突细胞的结合；

图21示出了在用HBV S1/S2核心疫苗和CD86siRNA复合物处理之后的树突细胞荧光(内在化)；以及图22示出了通过HBV S1/S2核心疫苗对siRNA的核酸酶(benzonase)处理的保护。

具体实施方式

总体地，本说明书，参考附图，提供了用于将核酸递送至靶细胞的嵌合抗原组合物。所述组合物包括核酸相互作用结构域(NAID)，并且可以用来包封(encapsulate)、限制、或以其他方式携带核酸。所述组合物可以在免疫疗法的递送中特别有用，因为直接递送至抗原呈递细胞如树突细胞是可能的。靶向其他细胞型，例如肝细胞也是可能的。

疫苗

本申请人先前已经描述了嵌合抗原以及制备其的方法，例如在US 2004/0001853、US 2005/0013828、PCT/CA2004/001469以及US2005/0031628(George等人)中，其每一个以它们的整体结合于本文中供参考。这些现有专利申请描述了用于靶向和激活抗原呈递细胞(如树突细胞)、诱导细胞的和/或体液的免疫应答、以及用于破坏对慢性和/或病毒感染的宿主耐受性的嵌合抗原。还描述了这样的嵌合抗原，其中感兴趣的抗原与异源性抗体片段组合以改善免疫原性，扩大免疫应答。还描述了含有乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)蛋白的嵌合抗原。

参照图1，示出的先前描述的嵌合抗原结构(称为分子)具有抗原和抗体的特性，提供能够并入任何期望的抗原或抗原组合的适应性平台(adaptable platform)。异源性抗体片段形成对于抗原的靶结合结构域20，使得能够将分子识别为外来的(异质的)，因而是更加免疫原性的。结果，分子的给予导致宿主内宽的免疫反应。分子的抗原部分或免疫应答结构域10提供这样的一种氨基酸序列，针对它宿主免疫应答是期望的。细胞的免疫应答(I类MHC)因此被安装以清除被感染的细胞、癌细胞、或先前已被错误地识别为“自身”的感兴趣细胞。体液免疫应答(II类MHC)也被安装以使得宿主能够产生针对感兴趣的抗原的抗体。

此外，当在昆虫细胞中产生分子时，将非哺乳动物糖基化赋予该分子，这有利于疫苗通过宿主凝集素受体的吸收，并且增加宿主中的免疫原性。基本分子的结构能够并入任何抗原，并且可以用来靶向APC或感兴趣的其他细胞上的多个特定受体。

各种疫苗已由申请人描述用于预防和/或治疗应用，包括针对丙型肝炎、乙型肝炎、西方马脑炎和流感的疫苗。

参照US 20050013828(将其通过引用并入本文中)，描述了用于将HBV蛋白并入到疫苗结构中的方法。具体地，HBV核心蛋白被置于分子的免疫应答部分10内。

HBV核心蛋白

参照图2a，HBV核心蛋白30通常包括装配结构域31(从N-端至大约氨基酸143)和鱼精蛋白结构域32(从大约氨基酸144至大约氨基酸183)。HBV核心蛋白30的核酸和氨基酸序列提供在图2b中。值得注意的是，装配结构域31允许各种核心蛋白颗粒聚集成衣壳形式(capsid form)，而鱼精蛋白结构域32能够结合核酸。虽然这些结构域的前述性能总体上已在现有技术中讨论，但是本文中表明，这些性能即使在相应的肽/部分被包括在更大的分子内如分子内时也被保留。此外，这些性能可以被开发以产生新的递送系统。

再次参照图1，分子包括免疫应答结构域10以及靶结合结构域20。如将要描述的，本发明描述的嵌合抗原进一步包括核酸相互作用结构域(NAID)，其提供对核酸的包封、结合或用于吸引和保持核酸的其他方式。NAID可以是前述免疫应答结构域10和靶结合结构域20中固有的或补充的。具体地，NAID可以通过在分子内包含HBV核心蛋白或其片段而提供。因此，本发明描述的嵌合抗原可以用来将治疗用核酸运载到靶细胞。

免疫应答结构域

嵌合抗原的免疫应答结构域10提供期望的抗原性能。通常，免疫应答结构域包括一个或多个抗原或抗原片段，或一个或多个重组抗原。具体地，免疫应答结构域可以包括抗原11，其先前已被宿主免疫系统识别为“自身”。而且，免疫应答结构域可以包括一系列对其期望免疫性的抗原。

免疫应答结构域可以包括例如传染原(infectious agent)如病毒或专性细胞内寄生虫(obligate intracellular parasite)的抗原性部分、或癌症抗原的抗原性部分。传染性病毒、专性细胞内寄生虫和癌症抗原的实例包括在公开的专利申请PCT/CA2004/001469中描述的那些。嵌合抗原的免疫应答结构域可以进一步包括6xHis tag 12，其融合至一个或多个抗原性部分。

在某些实施方式中，可能期望在可以提供一定程度的与靶细胞结合的免疫应答结构域内包括抗原，以改善递送的特异性。例如，HBV S1/S2结合至肝来源的HepG2细胞，并且可以用于将嵌合抗原靶向肝细胞。

靶结合结构域

靶结合结构域20将嵌合抗原结合至或其他方式引向靶细胞。通常，靶结合结构域是能够结合至抗原呈递细胞如树突细胞上的受体的抗体片段，并且其使得能够通过受体介导的吸收而随后将嵌合抗原转运到抗原呈递细胞中。另外，靶结合结构域的糖基化有利于嵌合抗原与各种细胞型(包括抗原呈递细胞)上的C-型凝集素受体的受体特异性结合。

靶结合结构域20由外源性Fc片段形成，其可以从C-端延伸至免疫应答结构域，并且通常被宿主识别为外来的，从而增加嵌合抗原的免疫原性。靶结合结构域可以提供定制的递送，递送至特定细胞型，抗原呈递细胞(如树突细胞)上的特定受体，例如FcγRI、FcγRII和FcγRIII(CD64、CD32和CD16)，以通过I类MHC和II类MHC路径将抗原性表位结合、内在化、加工以及提供给T细胞和B细胞，并引发宽的免疫应答。在这种情况下，最终由抗原呈递细胞呈递的表位可以是来自嵌合抗原的免疫应答结构域的表位。

当嵌合抗原包括NAID时，与该嵌合抗原相关的核酸可以类似地在抗原呈递细胞内被内在化。而且，靶结合结构域可以被设计成作为配体以提供与期望的靶细胞型上的特定受体的选择性结合，导致嵌合抗原和相关核酸在靶细胞内的内在化。例如，靶结合结构域可以被设计成结合树突细胞或其他抗原呈递细胞上的Fcγ受体，或被设计成靶向凝集素受体。

在合适的实施方式中，靶结合结构域20包括Fc片段21、铰链区22、以及C_H1区23的一部分。嵌合抗原还包括适于将靶结合结构域20连接至免疫应答结构域10的肽连接物24。靶结合结构域可以包括免疫球蛋白重链片段，并且可以包括或可以不包括铰链区。细节例如提供在PCT/CA2004/001469中。

迄今的试验已表明，带有外源性Fc结构域并且携带针对CD86的siRNA的生物纳米颗粒能够将核酸递送至树突细胞，并且能够影响RNAi，如通过这些细胞中的CD86的下调所证实的(参见下文的实例)。生物纳米颗粒能够影响RNAi和T细胞中的免疫调节。

核酸相互作用结构域(NAID)

核酸相互作用结构域(NAID)是本发明描述的嵌合抗原的一部分，其提供与核酸的相互作用-包封、隐蔽(螯合，sequestering)、结合、或允许该核酸可以被嵌合抗原运送到靶细胞的其他方式，其中它可以在靶结合结构域遇到靶细胞时被内在化。

NAID可以通过在嵌合抗原结构如分子内并入HBV核心蛋白序列而提供。当对应于HBV核心蛋白30的装配结构域31的序列被并入到嵌合抗原的免疫应答结构域10或靶结合结构域20内时，HBV核心蛋白的固有包封能力在该嵌合抗原内被保持，使得嵌合抗原分子能够聚集。当HBV核心蛋白的鱼精蛋白结构域32被并入到嵌合抗原结构中时，HBV核心蛋白的固有核酸结合能力在该嵌合抗原中被保持。当整个HBV核心蛋白30在嵌合抗原中存在时，核酸将会被结合并且关于该核酸将形成衣壳(capsid，壳体)。装配结构域31和鱼精蛋白结构域32中的每一个可以称为NAID，因为每一个与核酸相互作用，用于递送至靶细胞的目的。具体地，鱼精蛋白结构域32结合核酸，而装配结构域31包封该结合的核酸。

用于包封核酸的嵌合抗原

HBV核心蛋白30或其片段可以被并入到分子结构的免疫应答结构域中以使得能够提供关于核酸的聚集。当HBV核心片段被并入到分子结构中用于该目的时，优选该片段包括HBV核心的装配结构域(大约氨基酸1-143)。也可以包括鱼精蛋白结构域(大约氨基酸144-183)。HBV核心序列或片段优选在C-端处或免疫应答结构域内被插入到分子中。

另外的抗原可以添加到HBV核心蛋白或片段的N-端或C-端，或在HBV核心蛋白或片段内的合适位置处，例如在HBV核心的氨基酸残基79(脯氨酸)与80(丙氨酸)之间的免疫显性位点处。

类似地，HBV核心或其片段可以被并入到分子的靶结合结构域内，这也使得分子能够关于核酸发生聚集。当HBV核心片段以这种方式例如连接至分子的C-端时，优选该片段至少包括装配结构域(大约氨基酸1-143)。也可以包括鱼精蛋白结构域(大约氨基酸144至183)。

HBV核心生物纳米颗粒关于核酸的聚集示意性地在图5中示出。

用于结合核酸的嵌合抗原

HBV核心蛋白30或其鱼精蛋白样片段33可以被并入到嵌合抗原结构内以使得能够指导与核酸分子的结合。当HBV核心鱼精蛋白样片段被并入到分子内用于该目的时，优选该片段包括HBV核心的鱼精蛋白样结构域的大部分(例如，氨基酸144-184：ETTVVRRRDRGRSPRRRTP SPRRRRSQSPRRRRSQSR ESQC)。HBV核心或鱼精蛋白样片段优选被包括在嵌合抗原的免疫应答结构域内或在C-端处。

参照图3a-c，示意性示图示出了三种融合蛋白，各自在沿着该融合蛋白的不同位置处并入HBV核心鱼精蛋白样结构域，并且其中HBV NS5A蛋白位于免疫应答结构域10中。参照图3c，鱼精蛋白样片段33从C-端延伸到C_H3结构域。这种疫苗可以利用图3d中所示的核酸序列在质粒pFastBacHTA-gp64中产生。所得到的将在其C-端处结合核酸并且可以用来将核酸递送至抗原呈递细胞。

虽然这种特定融合蛋白事实上能够结合核酸，但是初步数据表明这种C-端鱼精蛋白尾部和核酸结合位置可以阻止靶细胞受体与嵌合抗原的Fc部分的相互作用。

将核酸引入到嵌合抗原中

期望的嵌合抗原可以首先作为融合蛋白产生，例如利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达。核酸单独合成，并且与嵌合抗原混合以形成嵌合抗原/核酸复合物。

当嵌合抗原旨在用来包封核酸时，产生纯化的融合蛋白，并在变性条件下加入核酸。变性剂然后通过透析或凝胶过滤除去，而嵌合抗原被复性以形成分子/核酸复合物。该复合物应足够稳定，使得当靶结合结构域结合至靶细胞上的受体时，核酸例如siRNA被递送至胞质溶胶(细胞溶胶，cystosol)。嵌合抗原然后通过抗原呈递途径进行处理，同时siRNA与胞质溶胶中的RNA诱导的沉默复合物(RISC)相互作用，导致具有靶mRNA的siRNA的退火以及使该基因经由mRNA降解的表达沉默。

当嵌合抗原包括C-端鱼精蛋白尾部时，核酸可以被简单地分离并加入到纯化的嵌合抗原中。

核酸

分子被设计成结合至靶细胞并被靶细胞内在化，将相关(包封或结合的)核酸分子运送到靶细胞的胞质溶胶中。因此，基于待递送的核酸，选择适当的靶细胞型，并将靶结合结构域设计成结合靶细胞上的特定受体。对于大多数应用，期望选择对感兴趣的靶细胞特异性的靶受体，并且适当的靶结合结构域可以特异性地结合至该靶受体。设计中这样的考虑将使需要的嵌合抗原和核酸的量最小化，将提高效力，并且还可以最小化非特异性非靶效应(off-target effect)。应当注意，嵌合抗原分子靶向特定细胞型也可以通过免疫应答结构域的特定设计而实现。例如，当HBV S1/S2蛋白被用作免疫应答结构域内的抗原时，观察到靶向肝细胞。

用于与本发明描述的NAID一起使用的核酸包括siRNA、dsRNA、shRNA以及质粒，例如编码shRNA的质粒，其原位形成期望的siRNA序列。迄今，高达5.3kb的质粒DNA序列已被包封在分子中。

专利US 7,078,196B2和US 7,056,704B2描述了用于RNAi的材料和方法(将其通过引用并入本文)。专利US 7,056,704B2证实在哺乳动物细胞中的siRNA介导的基因沉默。专利US 7,056,704B2还描述了：用于有效沉默的siRNA的优选结构；制备用于RNAi的dsRNA的方法；以及介导细胞或有机体中靶特异性核酸修饰，特别是RNAi和/或DNA甲基化的方法。

RNAi已被用于通过靶向在树突细胞中的基因表达的免疫调制[Hill，J.A.，et al(2003)J.Immunol.171：691-696]。SOCS-1通过siRNA的沉默也表现出增强通过树突细胞的抗原呈递以及抗原特异性抗肿瘤免疫性。在体外研究中，当SOCS-1在树突细胞中在它们用癌症抗原接种疫苗之前被沉默时，树突细胞表现出增强的抗原特异性抗肿瘤免疫性[Shen，T.(2004)Nature Biotech 22(12)：1546-1553]。在小鼠的体内研究中，SOCS-1的沉默诱导增强的HIV-1CD8+和CD4+T细胞应答以及抗体应答[Song，X-T.et al(2006)PLoS Med3：1-18]。用于沉默SOCS-1表达的核酸分子利用本文描述的分子进行递送，如在实施例部分中描述的。许多其他靶基因将适合于利用本文描述的嵌合抗原进行递送，如在阅读本说明书后结合本领域的知识将显而易见的。

利用嵌合抗原和核酸的方法

如上所论述的，并入核酸相互作用结构域的嵌合抗原可以连同核酸给予细胞、组织、靶或宿主。这样的共同给予的嵌合抗原和核酸可以用来破坏对抗原的宿主耐受性，增强免疫应答，或用来在抗原呈递细胞或感兴趣的其他细胞型中产生其他期望的效应。还考虑了，没有核酸相互作用结构域的嵌合抗原组合物可以简单地与核酸一起被共同给予。虽然这可以提供一定程度的效力，但是核酸与并入NAID的嵌合抗原的共同给予将提供更大的特异性和期望的效应，因为嵌合抗原和核酸都被同时提供给相同细胞或细胞群。嵌合抗原(其可以是分子)将允许对靶抗原产生细胞和/或体液免疫应答，靶抗原可以是先前在慢性感染过程中被识别为“自身的”，并且其然后被识别为“外来的”。因此，宿主的免疫系统将安装细胞毒性T淋巴细胞应答，以消除靶抗原感染的细胞。同时，响应于所给予的抗原由宿主产生的抗体将结合至靶抗原或传染原，并将其从循环中去除或阻断靶抗原或传染原与宿主细胞的结合。因此，嵌合抗原与针对特定基因的siRNA一起的给予可以在宿主中诱导宽的免疫应答，该宿主具有未被宿主免疫系统识别或以其他方式耐受的慢性感染。这样的给予可以用来在被传染原慢性感染或具有癌症或另一种免疫紊乱的宿主中破坏对靶抗原的耐受性。例如，当siRNA被设计成沉默病毒性基因产物时，这样的处理可以通过RNAi降低病毒血症，这可以有助于清除所述感染。这还将通过由给予疫苗产生的免疫应答来辅助。

虽然分子在引发或增强免疫应答中很有用，但是siRNA进一步沉默特定宿主基因。例如，siRNA可以进一步通过沉默靶基因如编码细胞因子信号转导的抑制剂的表达，例如沉默SOCS基因表达，以及减少细胞因子信号转导的SOCS介导的抑制而增强对分子的免疫应答。

嵌合抗原和核酸可以一起被包封在脂质体内。即，本发明的组合物可以配制用于包封在或连接至脂质颗粒、脂质体、囊泡(vesicle)、纳米球或纳米颗粒等的递送。可替换地，本发明的组合物可以共价或非共价地结合至这样的载体赋形剂的表面。

嵌合抗原和核酸可以用于体内或体外活化抗原呈递细胞或增强抗原呈递细胞(APC)中的抗原呈递。与嵌合抗原和核酸接触的抗原呈递细胞将导致嵌合抗原通过APC的结合和内在化，活化APC以及增强多于一个表位的抗原呈递。这种多表位应答可以包括免疫应答结构域的一个或多个表位的呈递和/或靶结合结构域的一个或多个表位的呈递。

可免疫治疗的病症可以通过向需要其的受治疗者共同给予治疗有效量的嵌合抗原和siRNA来进行治疗。可免疫治疗的病症的实例包括病毒性感染如HBV或HCV；寄生虫感染；以及癌症。对于HBV的治疗，用于并入到分子的免疫应答结构域中的合适抗原可以包括以下蛋白的至少一个抗原性部分，所述蛋白选自由HBV核心蛋白、HBV S蛋白、HBV S1蛋白、HBV S2蛋白、HBV聚合酶蛋白、HBV X蛋白、和/或它们的组合组成的组。对于HCV的治疗，免疫应答结构域可以包括以下蛋白的至少一个抗原性部分，所述蛋白选自由HCV核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS54B蛋白和/或它们的组合组成的组。HBV核心蛋白或其片段也可以包括在该免疫应答结构域内，以便提供对核酸的包封和/或结合。

可以测量免疫应答的幅度(amplitude)，例如(i)通过受治疗者中存在的抗原特异性抗体的量；(ii)通过由响应于被暴露在载有嵌合抗原或单独的免疫应答结构域的APC的T细胞分泌的IFN-γ的量；或(iii)通过响应于被暴露在载有嵌合抗原或单独的免疫应答结构域的APC而引发的抗原特异性CD8+T细胞的量。

可以评价嵌合抗原在通过将该嵌合抗原体内或活体内呈递给DC而产生免疫应答中的效力。这些DC进行处理并将嵌合抗原呈递给T细胞，其对T细胞的增生以及对于作为T细胞应答的标记物的IFN-γ的产生进行评价。具体地，在体内情形中，外周血单核细胞(PBMC)从天然供体分离，并被用于产生树突细胞(DC)以及T细胞的分离。通过DC进行的T细胞活化通过已知程序测量标记物例如IFN-γ水平而进行评价[参见，例如Berlyn，et al.，(2001)Clin.Immunol.3：276-283]。诱导以体内产生IFN-γ的T细胞百分数的显著增加将有助于预测体内效力。在体内情形的情况下，嵌合抗原直接肠胃外引入到宿主中，其中可利用的DC和其他APC具有与抗原相互作用以及相应地处理它们的能力。

嵌合抗原和核酸也可以用于针对感染对受治疗者预防或治疗地接种疫苗。该分子的双官能特性有助于将抗原靶向APC，例如DC，使其通过特异性地以最有效的抗原计量化学将APC靶向抗体而成为慢性传染病治疗中的独特方法。这样的疫苗可以在开发针对由HBV、HCV、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、α病毒、流感病毒、其他类型的病毒、专性细胞内寄生虫引起的感染的疫苗中很有用，并且也可以应用于疾病如癌症和自身免疫紊乱中的所有自身抗原。这些融合蛋白的给予可以从宿主引发宽的免疫应答，包括细胞和体液应答。因此，除了被用作预防性疫苗以对处于形成特定感染危险的受治疗者进行免疫外，它们还可以被用作治疗性疫苗以治疗对现有感染免疫耐受性的受治疗者。

实施例

实施例1：具有C-端鱼精蛋白尾部的嵌合抗原的克隆和表达

步骤1：克隆-编码含有5’Not I位点和3’Xba I位点的靶结合结构域(TBD)的DNA利用先前产生的pFastBacHTa-TBD作为模板通过PCR来生产，利用加入各自限制酶位点的独特引物。使用的引物为：

5’引物

5’TGTCATTCTGCGGCCGCAAGGCGGCGGGATCCGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGG 3’

3’引物

5’CCGGTCTAGATTCAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG 3’

分离PCR片段，用Not I和Xba I消化并克隆入Not I/Xba I消化的pFastBacHTa-gp64质粒中。

对于HBV核心鱼精蛋白尾部，通过先前生产的质粒pFastBacHTa HBV核心-TBD作为模板的PCR，利用将独特的Xba I位点插入5’端以及将独特的Hind III位点插入3’端的引物而获得序列。使用的引物为：

5’引物

5’CCGGTCTAGAGGAAACTACTGTTGTTAGACGAC 3’和

3’引物

5’G CGCAAGCTTTGACATTGAGATTCCCGAGATTG 3’

分离PCR产物，用Xba I/Hind III消化并克隆到如上所述的再克隆的TBD质粒的Xba I/Hind III位点中，以生成pFastBacHTa-gp64TBD-HBV核心鱼精蛋白。

作为免疫应答结构域的抗原的含有HCV NS5A的嵌合抗原通过用Xba I和Hind III消化质粒pFastBacHTa-gp64TBD-HBV核心鱼精蛋白来制备，并且分离TBD-HBV核心鱼精蛋白尾部片段。利用Xba I和Hind III消化质粒pFastBacHTa-gp64HCV NS5A-TBD，并将TBD-HBV核心鱼精蛋白尾部片段克隆入。

包含位于分子中各种位置的HBV核心鱼精蛋白尾部结构域的嵌合抗原设计如下(参见图3的示意图)。合成HBV核心鱼精蛋白尾部结构域DNA序列并亚克隆到普通pUC载体中。HBV核心结构域然后分别用Bam HI/Eco RI或Not I限制酶消化并亚克隆入pFastBacHTa-gp64NS5A TBD构建体中，以产生两种不同的克隆体：

(1)pFastBacHTa-gp64-鱼精蛋白NS5A TBD和(2)pFastBacHTa-gp64NS5a-鱼精蛋白TBD。

步骤2：用于嵌合抗原表达的重组杆状病毒的生产

嵌合抗原NS5A-TBD-HBV核心鱼精蛋白结构域蛋白的表达利用Sf9昆虫细胞中的杆状病毒表达系统来进行。为了产生用于表达的编码嵌合抗原的重组杆状病毒，使用了Bac-To-Bac系统(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。该系统利用具有细菌转座子Tn7的位点特异性转座以在大肠杆菌菌株DH10Bac中产生重组杆状病毒。pFastBacHTa-gp64HCV NS5A-TBD-HBV核心鱼精蛋白质粒具有侧挂(flanking)克隆位点的小Tn7元件。该质粒用来转化大肠杆菌菌株DH10Bac，其具有含LacZα基因内的Tn7连接位点的杆状病毒穿梭质粒(bacmid)。转座分裂LacZα基因，使得仅重组bacmid在含有X-gal/IPTG的板上产生白色克隆体，并且易于加以选择。利用大肠杆菌中的转座的优势在于，单个克隆体仅含有重组bacmid。重组bacmid利用标准质粒分离方案加以分离并被用于Sf9昆虫细胞的转染，从而产生表达嵌合抗原的杆状病毒。转染的效力通过检查由PCR进行的杆状病毒DNA的生产以筛选插入的感兴趣基因而进行检验。转染的Sf9细胞中的异源蛋白的表达通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹，使用6xHis标签单克隆抗体或抗小鼠IgG1(Fc特异性的)抗体作为探针进行检验。一旦重组杆状病毒的生产和嵌合蛋白的表达被确认，重组病毒就被扩增以产生杆状病毒的浓原液。

步骤3：昆虫细胞中的嵌合抗原的产生

使用高效价重组杆状病毒原液来感染昆虫细胞(例如Sf9，HighFive^TM)。相对于杆状病毒的MOI，感染时间期和宿主细胞的生存力，优化感染。重要的是将昆虫细胞的生存力保持在高水平以防止重组蛋白的降解。表达的蛋白通过开发用于6xHis标记的蛋白(利用亲和性层析方法)的方案进行纯化。

用于试验的一些分子包括：

HBV核心疫苗-具有在免疫应答结构域10中存在的作为抗原11和作为NAID的HBV核心蛋白的分子结构。

HBVS1/S2核心疫苗-具有在免疫应答结构域中的HBV核心蛋白和HBV S1/S2蛋白的分子结构。这种疫苗的结构在图4a中示出，并且序列在图4b中示出。

HBV核心鱼精蛋白尾部-具有在免疫应答结构域10中存在的作为抗原11和NAID的HBV核心蛋白，并且具有也位于分子的C-端处的作为NAID的HBV核心鱼精蛋白结构域32的分子结构。

HBVNS5A鱼精蛋白疫苗-具有在免疫应答结构域10中存在的作为抗原11的HCV NS5A蛋白，并且具有位于分子的C-端处的作为NAID的HBV核心鱼精蛋白结构域32的分子结构。

HBV鱼精蛋白尾部HCV NS5A疫苗-具有在免疫应答结构域10中的HBV核心的鱼精蛋白结构域32和HCV NS5A的分子结构。

实施例2：Chimigen聚集的可视化

HBV核心疫苗和HBV S1/S2核心疫苗利用敲击模式原子力显微镜(TM-AFM)进行可视化。产生的图像分别示于图6a-d和图7a-d中。如所示出的，形成的聚集体/纳米颗粒具有均匀尺寸和椭圆体形状，直径为30-40nm且高度为2nm。

实施例3：通过S1/S2核心疫苗进行的shRNA质粒的包封

将SureSilencing shRNA质粒与Chimigen HBV S1/S2核心疫苗在变性条件下进行混合。在去除变性条件后，通过GFP DNA的DNA酶处理和PCR扩增来评价包封。shRNA载体质粒和结果分别示于图8a和图8b中。注意到，两种疫苗保护GFP DNA免于DNA酶处理，表明这些疫苗能够在核酸周围形成包封的递送载体(deliveryvehicles)。

实施例4：与未成熟树突细胞的结合

对HBV S1/S2核心疫苗与未成熟DC的结合进行考察。在4℃下将1-50μg/ml的疫苗在1h内加入到两天培养的PBMC来源的未成熟DC中。结合的疫苗通过流式细胞仪利用抗小鼠IgG1-生物素和SA-PECy5进行检测。如图9所示，疫苗在高水平下结合至未成熟DC，如通过高相对平均荧光强度(MFI)所指示的，并且是剂量依赖性的。

实施例5：与HepG2细胞的结合

对HBV S1/S2核心疫苗与肝细胞系HepG2的结合进行考察。在4℃下将1-50μg/ml的疫苗在1h内加入到HepG2细胞中，并且结合的疫苗通过流式细胞仪利用抗小鼠IgG1-生物素和SA-PECy5进行检测。如图10所示，疫苗以剂量依赖性方式在相对高水平下结合至HepG2细胞。

实施例6：疫苗与核酸的组合

对具有包封的shRNA质粒的HBV S1/S2核心疫苗与未成熟DC的结合进行考察。在4℃下将1-50μg/ml具有和没有包封的shRNA质粒的疫苗在1h内加入到两天培养的PBMC来源的未成熟DC中。疫苗结合通过流式细胞仪利用抗小鼠IgG1-生物素和SA-PECy5进行检测。如图11a所示，具有包封的shRNA质粒，SOCS 1shRNA质粒(质粒1-4，即p1-4)或非靶向(对照)shRNA质粒(质粒5，即p5)，的疫苗结合至未成熟DC。相比较而言，没有包封的shRNA质粒的疫苗(制剂7)以比具有包封的shRNA质粒的疫苗(制剂8和9)更高的水平结合。

HBV S1/S2核心疫苗与SOCS 1shRNA质粒(Thermo Fisher Scientific)或与对照质粒进行组合。

HBV S1/S2核心疫苗与SOCS1 siRNA(商购获得)进行组合。对于非靶向对照siRNA，提供了四种双链RNA库：GCAUCCGCGUGCACUUUCA；GGUGGCAGCCGACAAUGCA；GGACGCCUGCGGAUUCUAC；和UGUUAUUACUUGCCUGGAA。对于SOCS siRNA，提供了四种双链RNA库。正义序列为如下：GACACGCACUUCCGCACAUUU；GCAUCCGCGUGCACUUUCAUU；GGUGGCAGCCGACAAUGCAUU；和GGACGCCUGCGGAUUCUACUU。

对具有包封的siRNA的HBV S1/S2核心疫苗与未成熟DC的结合进行考察。在4℃下将具有和没有包封的siRNA(GAPDH)的HBV S1/S2核心疫苗(1-50μg/ml)在1h内加入到两天培养的PBMC来源的未成熟DC中。疫苗结合通过流式细胞仪利用抗小鼠IgG1-生物素和SA-PECy5进行检测。疫苗是用GAPDH siRNA包封的或用GAPDH在室温下孵育60min(6∶1摩尔比的siRNA∶疫苗)。如图11b所示，用疫苗包封的siRNA以剂量依赖性方式在高水平下结合至未成熟DC。相比较而言，没有包封的siRNA的疫苗以比具有包封的siRNA的疫苗更高的水平结合。

HCV NS5A鱼精蛋白尾部疫苗与CD86siRNA进行组合。该疫苗用CD86siRNA在室温下以6∶1摩尔比孵育1小时。

实施例7：抗原呈递测定

使PBMC来源的单核细胞分化成未成熟树突细胞，其然后加载有疫苗、shRNA质粒、或具有shRNA质粒(SOCS 1或非靶向的)的疫苗。T细胞分离自自体PBMC并用抗原加载的树突细胞进行培养。T细胞在培养11天后进行再刺激。

对T细胞考察它们对加载有shRNA质粒包封的疫苗的DC的功能响应。PBMC来源的单核细胞分化成未成熟DC，其然后加载有疫苗、shRNA质粒、或包封有shRNA质粒(SOCS1或非靶向的)的HBV S1/S2核心疫苗。T细胞分离自自体PBMC并用抗原加载的DC进行培养。在培养11天后，T细胞用抗原加载的DC再刺激。对于这些实验，DC没有成熟并且外源性IL-2没有加入到细胞培养物中。

在一次和两次刺激之后，IFN-γ分泌通过ELISA进行测量。结果示于图12a和图12b中。

在一次和两次刺激之后，T细胞培养物中IFN-γ的产生通过ELISA来评估。如图12a和图12b所示，与用对照缓冲液刺激的培养物相比，用包封有shRNA质粒(SOCS1或非靶向的)的HBV S1/S2核心疫苗刺激的培养物产生显著增加的IFN-γ。而且，与用非包封的疫苗处理的培养物相比，用包封的疫苗处理的培养物产生更大量的IFN-γ。这些初步发现表明，相对于非靶向shRNA质粒，用包封的SOCS1shRNA质粒刺激的培养物中IFN-γ分泌的量增加。

CD8+和CD4+T细胞中的IFN-γ和TNF-α表达在两次刺激之后通过细胞内细胞因子标记进行测量。结果示于图13a-d中。

在第二次刺激之后六小时，CD8+和CD4+T细胞中的IFN-γ和TNF-α的产生通过流式细胞仪的检测，借助于细胞内细胞因子标记进行评价。如图13a-d所示，与用对照缓冲液刺激的培养物相比，用包封有shRNA质粒(SOCS1或非靶向的)的HBVS1/S2核心疫苗刺激的培养物表现出显著增加的IFN-γ+和TNF-α+CD8+和CD4+T细胞的百分数。而且，与用非包封的疫苗处理的培养物，用包封的疫苗处理的培养物产生更大量的IFN-γ。

实施例8：T细胞的表达

用疫苗相对于包封的疫苗处理的培养物中T细胞的相对数量的评价示于图14中。在培养11天之后，相对于非包封的疫苗，用包封的疫苗刺激后的培养物中存在T细胞的显著扩展。

实施例9：HBV S1/S2核心疫苗

未成熟树突细胞加载有HBV S1/S2核心疫苗、CD86siRNA、非靶向siRNA、HBV S1/S2核心疫苗和CD86siRNA、或HBV S1/S2核心疫苗和非靶向siRNA。然后用LPS熟化这些DC并通过流式细胞仪对CD86表达进行评价。结果示于图15中。与加载有HBV S1/S2核心疫苗+非靶向siRNA相比，CD86的表达在加载有HBV S1/S2核心疫苗+CD86siRNA的DC中被下调。这些结果表明，HBVS1/S2核心疫苗+CD86siRNA导致CD86siRNA递送到DC中并且导致CD86表达降低。

实施例10：鱼精蛋白尾部疫苗制备

HBV核心鱼精蛋白尾部疫苗通过在靶结合结构域中并入HBV核心蛋白的鱼精蛋白样结构域而制备。具体地，将鱼精蛋白样结构域并入到靶结合结构域的C-端处并将HBV NS5A抗原并入到免疫应答结构域内。

实施例11：抗原呈递测定

考察了T细胞对加载有具有和没有SOCS1或非靶向siRNA的NS5A鱼精蛋白尾部疫苗的DC的功能响应。PBMC来源的单核细胞分化成未成熟DC，其接着加载有疫苗、siRNA、或包封有siRNA(SOCS1或非靶向)的HCV NS5A鱼精蛋白尾部疫苗。T细胞分离自自体PBMC并且用抗原加载的DC进行培养。在培养11天后，用抗原加载的DC再刺激T细胞。对于这些实验，DC没有成熟并且外源IL-2没有添加到细胞培养物中。

在一次和二次刺激之后，通过ELISA来评估T细胞培养物中IFN-γ的产生。如图16a和图16b所示，与用对照缓冲液刺激的培养物相比，用具有siRNA(SOCS1或非靶向)的HCVNS5A鱼精蛋白尾部疫苗刺激的培养物产生显著增加的IFN-γ。而且，与用单独的疫苗处理的培养物相比，用疫苗和siRNA处理的培养物产生更大量的IFN-γ。在单次刺激之后，相对于非靶向siRNA，用疫苗和SOCS1siRNA刺激的培养物中IFN-γ分泌的量增加。

在第二次刺激之后6小时，CD8+和CD4+T细胞中的IFN-γ和TNF-α的产生通过流式细胞仪的检测，借助于细胞内细胞因子标记进行评价。如图17a-d所示，与用对照缓冲液刺激的培养物相比，用具有siRNA(SOCS1或非靶向)的HCV NS5A鱼精蛋白尾部疫苗刺激的培养物表现出显著增加的IFN-γ+和TNF-α+CD8+和CD4+T细胞的百分数。而且，与仅用疫苗处理的培养物相比，用疫苗和siRNA处理的培养物产生更大量的IFN-γ。

实施例12：T细胞的扩展

用疫苗处理相对于疫苗和siRNA处理的培养物中T细胞的相对数量的近似值示于图18中。在培养11天之后，相对仅疫苗的刺激，用疫苗和siRNA刺激后培养物中存在T细胞(数量)的显著扩展。这些初步发现表明，用疫苗和SOCS1siRNA或用疫苗和非靶向siRNA刺激的培养物导致大致相当数量的T细胞。

实施例13：CD86表达的RNAi

未成熟树突细胞加载有HCV NS5A鱼精蛋白尾部疫苗、CD86siRNA、非靶向siRNA、NS5A鱼精蛋白尾部疫苗和CD86siRNA、或NS5A鱼精蛋白尾部疫苗和非靶向siRNA。然后用LPS熟化这些DC并通过流式细胞仪对CD86表达进行评价。结果示于图19中。这些结果表明，NS5A鱼精蛋白尾部疫苗+CD86siRNA导致CD86siRNA递送到DC中以及CD86表达的下调。

实施例14：HBV S1/S2核心疫苗与CD86siRNA的结合

对具有生物素标记的CD86siRNA的HBV S1/S2核心疫苗与未成熟DC的结合进行考察。在4℃下将疫苗、疫苗和生物素标记的CD86siRNA、或CD86siRNA在1h内加入到两天培养的PBMC来源的未成熟DC中。通过流式细胞仪利用SA-PECy5来检测结合。如图20所示，具有生物素标记的CD86siRNA的疫苗以相对高的水平结合至未成熟DC。没有检测到单独的生物素化CD86siRNA的结合。这些结果表明，siRNA结合HBVS1/S2核心疫苗，并且疫苗和siRNA复合物可以结合至DC。

实施例15：HBV S1/S2核心疫苗和CD86siRNA的内在化

对具有生物素标记的CD86siRNA的HBV S1/S2核心疫苗与未成熟DC的内在化进行考察。将疫苗、疫苗和生物素标记的CD86siRNA、或CD86siRNA在4℃下在1h内、然后在37℃下在2h内加入到PBMC来源的未成熟DC(2天培养的)中。结合和内在化在有和没有先前固定和渗透的情况下在加入SA-PECy5之后通过FACS进行检测。如图21所示，在37℃下用疫苗和生物素标记的CD86siRNA处理的细胞中检测到荧光，但在单独用疫苗或生物素化CD86siRNA处理的细胞中没有检测到荧光。由于在细胞表面上没有检测到荧光，所以推断疫苗和siRNA被内在化。因此，siRNA与HBV S1/S2核心疫苗结合并且被DC内在化。

实施例16：通过HBV S1/S2疫苗进行的siRNA的保护

包封或裸露的siRNA在室温下用核酸酶Benzonase消化10分钟。在含有1mM EDTA的SDS-PAGE凝胶上分离经消化的siRNA并用0.2％亚甲蓝染色。如图22所示，在裸露的siRNA柱上没有siRNA带，而在与HBV S1/S2疫苗组合的样品(Multi-Ag)中存在siRNA带。

本发明的上述实施方式仅用于举例。在不背离仅由所附权利要求所限定的本发明的范围的情况下，本领域技术人员可以对特定实施方式实现变换、修改和变形。