心力衰竭的生物标志物的联合并行检测方法及诊断试剂盒

摘要

本发明公开了一种心力衰竭的生物标志物的联合并行检测方法及诊断试剂盒，联合并行检测方法的特征是能够一次性检测同一个样品中的多种生物标志物，即通过液相芯片的制备，形成“生物素标记的检测抗体-心力衰竭生物标志物-捕获抗体-微球”的四联复合体，将四联复合体与链霉亲和素-藻红蛋白结合后，可检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中各种不同的心力衰竭生物标志物的存在及含量。本发明还公开了该诊断试剂盒的组成成分。本发明所述的方法及试剂盒具有高灵敏度、高通量性、检测快速、准确等优点，能够对多种心力衰竭的生物标志物同时进行定性和定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诊断检测方法及诊断试剂盒，特别是涉及多种心力衰竭的生物标志物的液相芯片联合并行检测方法及其诊断试剂盒。

背景技术

心血管疾病是中国城市人口和西方发达国家的主要疾病和主要死亡原因之一，其中心力衰竭(heart failure，HF)更严重危害着人类的生命健康。心力衰竭的生物标志物(以下可简称为“心衰标志物”)不仅能够准确诊断心力衰竭，评价其严重程度，还能指导临床治疗和疗效的监测，判断心力衰竭的预后。因此各种不同类型的心衰标志物的联合并行检测已成为必然，而多指标并行检测的高通量迅速性、准确性和稳定性就更加至关重要。

钠尿肽已成为目前国际公认的心衰标志物，包括A型钠尿肽(ANP)、B型钠尿肽(BNP)、N末端前钠尿肽(NT-proBNP)。近年来研究发现的与心力衰竭相关的生物标志物还包括内皮素(ET-1)，肾上腺髓质素(ADM)等。

目前，对于心衰标志物的测定已有多种检测方法，包括免疫荧光分析、酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、磁分离酶联免疫分析(EIMA)等。但是这些技术一次只能针对一种标志物进行检测，且操作繁琐、灵敏度较差，不能真正满足临床诊断检测的需要。而固相生物芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的缺点。

液相芯片技术(xMAP)是一种可广泛应用于蛋白质、基因、受体/配体等多种生物反应的生物芯片技术平台，主要包括微球、探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。

本发明基于液相芯片技术的高灵敏度、高通量、检测迅速等突出优点，对心力衰竭的多种生物标志物进行并行检测，能够在临床检测上得到更好的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于心力衰竭生物标志物的液相芯片检测方法及其诊断试剂盒，该检测方法及试剂盒包括针对ANP、BNP、NTproBNP、ET-1、ADM五种心衰标志物的联合并行检测，具有高灵敏度、高特异性、稳定性好、检测迅速等优点。

为解决上述技术问题，本发明的一种心力衰竭生物标志物的液相芯片联合并行检测方法，包括以下步骤：

(1)将不同编号的、表面羧基修饰的微球(Beads，编号分别为11、15、21、33、37)活化后，使相应的捕获抗体(抗心衰标志物的抗体)与相应的微球偶联，形成“捕获抗体-微球”二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种心衰标志物，从而使待测样品中的心衰标志物与捕获抗体形成“心力衰竭生物标志物-捕获抗体-微球”三联复合体；

(2)将不同的检测抗体进行生物素(Biotin)标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种心衰标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该标志物的不同抗原表位；

(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤(2)中的含有生物素标记的检测抗体混合，从而形成“生物素标记的检测抗体-心力衰竭生物标志物-捕获抗体-微球”四联复合体；

(4)将步骤(3)中的四联复合体与链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE)结合后，检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中各种心衰标志物的存在及含量。

以上所述检测方法，还包括步骤：将步骤(4)中测定的可检测荧光信号与标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各种心衰标志物的含量。

所述的微球是平均直径为5.6μm，且结合了不同荧光染料的聚苯烯微球，即色彩编码微球(color-coded beads)。

所述步骤(1)中的微球活化是指微球在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)溶液和活化缓冲液组成的3者混合液中进行活化，其中，3者混合液的用量比是：当微球数量为2.5×10⁶个时，需要50mg/mlEDC溶液10μl∶50mg/mlS-NHS溶液10μl∶100mM NaH₂PO₄、pH6.3的活化缓冲液80μl，混合液的用量可以根据微球的数量进行相应的调整。

所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下5种可以自由组合的心衰标志物的捕获抗体和检测抗体：

ANP，BNP，NT-proBNP，ET-1，ADM。

检测方法中所述的步骤(4)中用液相芯片法(xMAP)进行检测，所述的可检测荧光信号是红色激光激发的微球上的红色分类荧光信号和绿色激光激发的藻红蛋白所产生的报告荧光信号。

本发明另一个解决的问题是，提供一种检测心力衰竭生物标志物的诊断试剂盒，主要包括以下组分：

(1)偶联抗体的微球：含有5种偶联了捕获抗体的羧基微球(微球编号为11，15，21，33，37)，即分别是：偶联了ANP捕获抗体的微球11，偶联了BNP捕获抗体的微球15，偶联了NT-proBNP捕获抗体的微球21，偶联了ET-1捕获抗体的微球33，偶联了ADM捕获抗体的微球37，每种捕获抗体分别抗一种心衰标志物并且偶联于不同编号的微球，形成“抗体-微球”的二联复合体；

(2)生物素标记的检测抗体：含有生物素标记的ANP检测抗体，生物素标记的BNP检测抗体，生物素标记的NT-proBNP检测抗体，含有生物素标记的ET-1检测抗体，含有生物素标记的ADM检测抗体，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种相应的心衰标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该生物标志物的不同抗原表位；

(3)链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE)：其中链霉亲和素可与生物素特异性结合，形成带藻红蛋白(PE)荧光素标记的检测抗体，通过液相芯片仪的绿色激光激发藻红蛋白进行荧光检测；

(4)标准品：包含各种心力衰竭的生物标志物(抗原)的标准品；

(5)质控品：包含阳性对照和阴性对照。

其中所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下5种可以自由组合的心衰标志物的捕获抗体和检测抗体：

ANP，BNP，NT-proBNP，ET-1，ADM。

本发明的一种检测心力衰竭生物标志物的诊断试剂盒可用于检测体外样品中心衰标志物的存在及含量，及用于除心力衰竭以外的其他心脑血管疾病的诊断检测或预测。

由于本发明利用了液相芯片技术，使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点，能够对多种心力衰竭的生物标志物同时进行定性和定量检测，能在临床检测上得到更好的应用。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是本发明中检测心力衰竭患者与正常对照组中ANP的浓度分布图；

图2是本发明中检测心力衰竭患者与正常对照组中BNP的浓度分布图；

图3是本发明中检测心力衰竭患者与正常对照组中NT-proBNP的浓度分布图；

图4是本发明中检测心力衰竭患者与正常对照组中ET-1的浓度分布图；

图5是本发明中检测心力衰竭患者与正常对照组中ADM的浓度分布图。

具体实施方式

实验材料：

本发明所用的5种心衰标志物(抗原)及相应抗体来源于Biodesign和Abcam公司；

不同编号的微球(表面羧基修饰)、链霉亲和素-藻红蛋白均购置于QIAGEN公司；

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素(S-NHS-Biotin)购置于Pierce公司。

缓冲液配制：

活化缓冲液(Activation buffer)：100mM NaH₂PO₄，pH6.3；

偶联缓冲液(Coupling buffer)：50mM HEPES，pH7.4；

磷酸缓冲液(PBS)：10mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，pH7.4。

实施例1：3种心力衰竭的生物标志物的液相芯片联合并行检测方法

具体的检测方法包括如下步骤：

1.所需微球的活化：

1.1全速涡旋微球储存液至少3min，形成均一的微球悬液；

1.2分别称取10mg的EDC和S-NHS到两个离心管中；

1.3用去离子水溶解使其终浓度为50mg/ml；

1.4取1ml的微球悬液10000g离心3min，小心移除上清；

1.5加入80μl的活化缓冲液将微球重悬；

1.6分别加入10μl的EDC溶液(50mg/ml)和10μl的S-NHS溶液(50mg/ml)，混合均匀，室温(15-25℃)，避光，振荡孵育20min。

2.相应的捕获抗体与活化的微球偶联

2.1用偶联缓冲液将捕获抗体稀释成体积为500μl，浓度为0.1mg/ml的溶液；(抗体溶液中不能含有外源蛋白，叠氮化物，氨基乙酸，Tris或其他任何含有氨基的试剂。如果含有这些试剂，通过透析或凝胶过滤层析除去。)

2.2将微球在10000g离心3min，小心移除上清；

2.3加入步骤2.1中已经稀释好的抗体溶液(500μl)；

2.4将活化的微球与抗体溶液，在室温(15-25℃)下，避光，振荡孵育2h；(离心管必须用锡纸包裹避光)

2.5将微球在10000g离心3min，小心移除上清；

2.6加入500μl PBS将微球重悬，10000g离心3min，小心移除上清；

2.7加入1ml PBS/1％BSA(BSA：牛血清白蛋白)将微球重悬；

2.8通过血小板计数器对微球计数；

3.生物素标记检测抗体

3.1将生物素试剂(S-NHS-Biotin)从冰箱的冷藏室中取出，在室温下平衡，使其恢复到室温；

3.2依据检测抗体的浓度，用PBS将抗体稀释到1mg/ml；

如果抗体溶解在含有氨基的溶液中，应先除去氨基，置换成没有氨基的缓冲液；

3.3用超纯水配置10mM的生物素溶液；

3.4按摩尔比1∶20(抗体∶生物素)，计算生物素所需要的量，加入到浓度为1mg/ml的抗体溶液中；

计算公式：

Biotin(mmol)＝抗体体积(ml)×抗体浓度(mg/ml)÷抗体分子量(mg/mmol)×生物素与蛋白的摩尔比

3.5将反应液在冰上孵育2h，或是在室温孵育30min；

3.6将反应液转移到透析盒，除去其中未反应的S-NHS-Biotin。

4.抗原标准品的配置

三种心衰标志物ANP，BNP，NT-proBNP分别按10000，2000，400，80，16，3.2，0 pg/ml的浓度进行配制，标志物混合液分别标记为STD6，STD5，STD4，STD3，STD2，STD1，STD0。

5.偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)的配制

分别取偶联了3种心衰标志物的捕获抗体的微球，如下列：ANP捕获抗体微球11，BNP捕获抗体微球15，NT-proBNP捕获抗体微球21，等比例混合，使每种微球的终浓度分别为200个/μl，4℃避光保存。

6.含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)的配制

分别取进行了生物素标记的ANP检测抗体，BNP检测抗体，NT-proBNP检测抗体，加入pH7.4的PBS，使每种检测抗体的终浓度分别为10μg/ml。

7.质控品

质控品包括阳性对照和阴性对照。

8.血清样品中3种心力衰竭生物标志物的含量检测

8.1血清样品包括正常人血清样本10份，心力衰竭患者血清样本10份。

8.2分别加入偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)于96孔酶标板，25μl/孔；

8.3加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6)、质控品(阳性对照和阴性对照)、病人血清样本1-10号、正常人血清样本1-10号，25μl/孔；

8.4用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育30min；

8.5加入含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)，25μl/孔；用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育30min；

8.6用PBS/1％BSA将链霉亲和素-藻红蛋白稀释成浓度为200μl/ml的溶液，加稀释好的链霉亲和素藻红蛋白25μl到每个孔中，用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育15-30min；

8.7在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，对反应的混合物进行分析，可自动绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出检测样品中3种心衰标志物的含量。

8.8检测结果及分析

具体参见表1-3。

表1 心力衰竭组生物标志物的浓度值

表2 正常对照组生物标志物的浓度值

表3 心力衰竭患者与正常组的生物标志物平均值对比

以上结果表明，用本发明方法可以同时对3种心衰标志物进行联合并行检测，从表1-3中3种标志物的浓度平均值可以看出，心力衰竭患者的这3种生物标志物浓度高出正常对照组6倍以上，其中NT-proBNP组可以达到13.92倍，具有显著差异，可以作为心力衰竭临床诊断检测的重要指标。

实施例2：5种心力衰竭的生物标志物的液相芯片联合并行检测方法具体的检测方法，1-3步骤同实施例1。

4.抗原标准品的配置

5种心衰标志物ANP，BNP，NT-proBNP，ET-1，ADM分另0按10000，2000，400，80，16，3.2，0 pg/ml的浓度进行配制，标志物混合液分别标记为STD6，STD5，STD4，STD3，STD2，STD1，STD0。

5.偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)的配制

分别取包被了5种心衰标志物的捕获抗体的微球，如下列：ANP捕获抗体微球11，BNP捕获抗体微球15，NT-proBNP捕获抗体微球21，ET-1捕获抗体微球33，ADM捕获抗体微球37，等比例混合，使每种微球的终浓度分别为200个/μl，4℃避光保存。

6.含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)的配制

分别取进行了生物素标记的ANP检测抗体，BNP检测抗体，NT-proBNP检测抗体，ET-1检测抗体，ADM检测抗体，加入pH7.4的PBS，使每种检测抗体的终浓度分别为10μg/ml。

7.对照品

对照品包括阳性对照和阴性对照。

8.血清样品中5种心力衰竭生物标志物的含量检测

8.1血清样品包括正常人血清样本25份，心力衰竭患者血清样本25份。

8.2分别加入偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)于96孔酶标板，25μl/孔；

8.3加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6)、质控品(阳性对照和阴性对照)、病人血清样本1-25号、正常人血清样本1-25号，25μl/孔；

8.4用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育30min；

8.5加入含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)，25μl/孔；用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育30min；

8.6用PBS/1％BSA将链霉亲和素一藻红蛋白稀释成浓度为200μl/ml的溶液，加稀释好的链霉亲和素藻红蛋白25μl到每个孔中，用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育15-30min；

8.7在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，对反应的混合物进行分析，可自动绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出检测样品中5种心力衰竭生物标志物的含量。

8.8检测结果及分析

参见表4-6和图1-5。

表4 心力衰竭组生物标志物浓度值

表5 正常对照组生物标志物浓度值

表6 心力衰竭患者与正常组生物标志物平均值对比

以上结果表明，用本发明方法可以同时对5种心衰标志物进行联合并行检测，而且还可以根据实际需求对5种心衰标志物进行不同组合的联合检测。从表4-6中5种标志物的浓度平均值可以看出，心力衰竭患者的这5种生物标志物浓度高出正常对照组2倍以上，其中NT-proBNP组可以达到13.22倍，具有显著差异，可以作为心力衰竭临床诊断检测的重要指标。

在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改或变化，这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。