ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗体的制备方法

摘要

一种生物技术领域的ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗体的制备方法；本发明涉及的ppGalNAc-T20抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；本发明还涉及一种分离核酸，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；本发明还涉及一种多克隆抗体，该多克隆抗体可用如下的方法制备得到，该方法包括如下步骤：以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清；纯化抗血清，即得；本发明还涉及一种制备多克隆抗体的方法，包括如下步骤：克隆如SEQ ID NO：1所示的核酸片段；构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯化，得蛋白质；以所得蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，纯化抗血清，即得。本发明的方法简单，制备的抗体免疫原性强。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的抗体及其制备方法，具体是一种ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗体的制备方法。

背景技术

UDP-半乳糖酰胺：N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-Ts)是O-型糖蛋白糖链合成反应的第一步起始糖基转移酶，它能将N-乙酰氨基半乳糖基转移到蛋白质肽链的丝氨酸或苏氨酸残基上。人体中的ppGalNAc-Ts家族中己有19个成员被报道研究，它们在人体组织中的分布和对体外多肽底物的糖基化修饰的专一性上都存在着不同程度的差异。ppGalNAc-Ts可作为肿瘤标志物，例如在神经母细胞瘤衍生细胞株中特异性高表达的ppGalNAc-T13，它可以作为脊髓发生神经母细胞瘤的早期诊断标志。另外，ppGalNAc-T6可以作为乳腺癌的免疫组化检测标志。最新研究结果表明，ppGalNAc-T14调控死亡受体Apo2L/TRAIL的糖基化修饰，过表达ppGalNAc-T14能显著促进细胞的凋亡。ppGalNAc-Ts除具有糖基转移酶功能之外，还具有潜在的重要临床诊断意义。因此，获得ppGalNAc-Ts家族各个成员的抗体，对精确定位其在组织和细胞中的分布有着重要意义，从而更真实的反映它们的生物学功能。然而ppGalNAc-Ts家族成员间的同源性较高，不同成员间的同源性可达40％～70％，因此保证其抗体的特异性至关重要。

ppGalNAc-Ts家族成员均为II型膜蛋白，N端有一个4～22个氨基酸的胞浆区，继以一个15～25个氨基酸的穿膜区，通过一个长短不一的茎区与C端伸入高尔基体内大约450个氨基酸的催化区相连接。ppGalNAc-T20从一级结构分析属于UDP-半乳糖酰胺：多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员，它与ppGalNac-T10在氨基酸水平上具有70.7％的相似性。虽然只在脑和睾丸组织中检测到表达量较低的ppGalNAc-T20mRNA，但鉴于其存在部位的特殊性，可以推测其在机体分化、发育过程中起着重要的调节作用。

经对现有技术的文献检索发现，N Berois et al.等采用多肽合成的方法制备ppGalNAc-T13抗体(N Berois et al.，ppGalNAc-T13：A New Molecular Marker of BoneMarrow Involvement in Neuroblastoma，Clinical Chemistry，2006，52：1701～1712)，该方法一般需要合成15个左右的肽段，这样比较容易保证抗体的特异性。但是，由于多肽的分子量相对较小，免疫原性较差，得到抗体比较困难，通常需将其与MAP(multipleantigenic peptide)或KLH(钥孔血蓝蛋白)偶联，但是这样提高了成本。一般用来制备抗体的抗原肽需10～20mg，纯度85％以上，这种级别的多肽合成价格为120元/氨基酸，偶联基团MAP的价格也在1000元以上，较低的免疫原性和高昂的成本，限制了合成多肽用于抗体制备方法的应用。目前尚未有与ppGalNAc-T20抗体制备相关的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗体的制备方法。本发明制备的抗体不和与ppGalNAc-T20具有最高同源性的ppGalNAc-T10发生交叉反应，更不与ppGalNAc-Ts家族其它成员发生交叉反应；本发明通过简单的分子克隆实验制备出所需的抗原蛋白，且该抗原蛋白与GST融合表达，易于纯化；本发明克服了合成多肽方法免疫原性差、价格昂贵等缺点。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

本发明涉及一种ppGalNAc-T20抗原，该抗原为蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

编码所述蛋白质的核酸的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还涉及一种如上所述的ppGalNAc-T20抗原的多克隆抗体制备方法，包括如下步骤：

步骤一，以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清；

步骤二，纯化抗血清，即得。

本发明还涉及一种如上所述的ppGalNAc-T20抗原的多克隆抗体制备方法，包括如下步骤：

步骤一，克隆如SEQ ID NO：1所示的核酸片段；

步骤二，利用步骤一所得核酸片段构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯化，得蛋白质；

步骤三，以步骤二所得蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，纯化抗血清，即得。

步骤一中，所述克隆，所用引物对具体为如SEQ ID NO：3所示的上游引物和SEQ IDNO：4所示的下游引物。

步骤二中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

步骤二中，所述重组质粒使用的质粒为pGEX-5X-1。

步骤二中，筛选所述重组质粒的过程为：将构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α中，使用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃下培养12h，挑取单菌落后摇菌，提取质粒并测序，测序正确的即为所需重组质粒。

步骤二中，所述培养具体为，1L培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，余量为水；培养温度为37℃；培养至大肠杆菌BL21(DE3)的OD值为0.8～1.2。

步骤二中，所述诱导为：加入IPTG，使其终浓度为0.1mM～0.5mM，温度26℃下培养3h～6h。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明得到的多克隆抗体是用ppGalNAc-T20的茎区一段蛋白作为抗原得到的；本发明制备的抗体不和与ppGalNAc-T20具有最高同源性的ppGalNAc-T10发生交叉反应，更不与ppGalNAc-Ts家族其它成员发生交叉反应；本发明通过简单的分子克隆实验制备出所需的抗原蛋白，且该抗原蛋白与GST融合表达，易于纯化；本发明克服了合成多肽方法免疫原性差、价格昂贵等缺点；本发明得到的抗体不仅可以用于检测变性后的ppGalNAc-T20蛋白，还可以用于检测具有活性的天然构象的ppGalNAc-T20蛋白。

本发明中所涉及的菌株大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)已在《汪玲玲，杨辑，黄诚之，王海洪；大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008，48(7)：963～969》文献中公开。本发明涉及的菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址：上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。

附图说明

图1为GST-short T20融合蛋白诱导表达电泳图；

图2为GST-short T20融合蛋白纯化电泳图；

图3为ppGalNAc-T20抗体纯化电泳图；

图4为ppGalNAc-T20抗体与其它ppGalNAc-T的交叉特异性检测图；

图5为检测ppGalNAc-T20抗体对不同浓度的GST-short T20蛋白的效价的WesternBlotting结果图；

图6为检测ppGalNAc-T20抗体对在293T细胞中表达的不同浓度的FLAG-ppGalNAc-T20蛋白的效价的Western Blotting结果图；

图7为用ppGalNAc-T20抗体通过免疫组化法检测C57小鼠睾丸组织中ppGalNAc-T20蛋白表达分布结果图；

图8为用ppGalNAc-T20抗体通过免疫共沉淀法检测MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞裂解液的Western Blotting结果图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例

ppGalNAc-T20多克隆抗体的制备

步骤一，抗原序列的确立

在ClustalX软件中输入ppGalNAc-T20(GenBank Accession Number：GU220060)和ppGalNAc-T10(GenBank Accession Number：AJ505950)的蛋白序列进行比对，在ppGalNAc-T20蛋白的茎区选取一段序列short T20作为抗原，short T20序列如SEQ ID NO：2所示(ppGalNAc-T20全蛋白质编码30AA到141AA)；

步骤二，重组质粒的构建

抗原short T20的氨基酸序列对应的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；根据pGEX-5X-1的多克隆位点和short T20的DNA序列设计引物：

上游引物：5′-GTT GCG AGC GGC CGC CTG TAC AAG GAT-3′；(SEQ ID NO：3)；

下游引物：5′-GATAAT GAG TCG ACC GTT TGG CAG CCTTTC-3′(SEQ ID NO：4)。

以ppGalNAc-T20全长cDNA(GenBank Accession Number：GU220060)为模板，通过PCR扩增得到目的片段，PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，68℃30s，25个循环；68℃10min；目的片段经Sal I(TaKaRa)、Not I(TaKaRa)双酶切后胶回收，以Ligation High连接酶(ToYoBo)连接入经Sal I、Not I双酶切的pGEX-5X-1质粒(Amersham)，连接反应条件为：16℃，2h；

将所构建的pGEX-5X-1-short T20原核表达载体转化大肠杆菌DH5α(天根)，使用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜筛选培养；挑取单菌落后摇菌，提取质粒并测序。

步骤三，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)；

选择步骤二中测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(天根)，1L大肠杆菌BL21(DE3)培养液在37℃培养至OD值达到1.0；大肠杆菌BL21(DE3)培养基组分为：1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)NaCl，所述1L培养基中，蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，余量为水；培养温度为37℃。

在大肠杆菌BL21(DE3)培养液中加入IPTG至0.5mM，26℃下诱导培养3h；裂解大肠杆菌BL21(DE3)：将1L诱导后的大肠杆菌BL21(DE3)培养液离心收集菌体，用100ml裂解缓冲液重悬，该缓冲液的组分为：PBS(pH＝7.3)，1％(v/v)Triton X-100，lmM PMSF，所述1L缓冲液中，Triton X-100 10ml，PMSF 174.2mg，余量为PBS(pH＝7.3)；超声波破碎20次，每次5s。然后将经超声波破碎后的菌体在4℃条件下，10,000rpm离心15min，收集上清。如图1所示，1为marker，2为未用IPTG诱导的菌体裂解后的蛋白上清，3为用IPTG诱导后的菌体裂解后的蛋白上清。由图1可知，在大肠杆菌BL21(DE3)中可通过IPTG诱导表达得到了GST-short T20融合蛋白。

步骤四，纯化大肠杆菌BL21(DE3)菌体裂解破碎后的蛋白上清：使用GE Healthcare公司的GSTrap HP亲和纯化柱，先用5倍柱床体积的PBS平衡该柱，接着上样超声破碎离心后得到的上清，再用5倍柱床体积的PBS冲洗该柱，然后用5倍柱床体积的还原性谷胱甘肽溶液洗脱。还原性谷胱甘肽溶液的组分为：50mM Tris-HCl，10mM还原性谷胱甘肽，pH为8.0，通过UV检测收集洗脱峰。如图2所示，1为marker，2为未纯化的IPTG诱导后的菌体裂解后的蛋白上清；3为穿透峰，即未被GSTrap HP柱结合的蛋白，4为洗脱峰，即用还原性谷胱甘肽从GSTrap HP柱上洗脱下的GST-short T20融合蛋白。

步骤五，用纯化的抗原蛋白对家兔进行免疫，每次使用抗原蛋白200μg，两星期一次；3个月后取血清，3,000rpm离心15分钟后得到抗血清；纯化抗血清：使用GE Healthcare公司的Hitrap Protein A HP抗体纯化柱，先用10倍柱床体积的结合液平衡该柱，结合液成分为20mM Na₃PO₄，pH为7.0，接着让ppGalNAc-T20抗血清通过该柱，再用5倍柱床体积的结合液冲洗该柱，然后用5倍柱床体积的洗脱液洗脱，洗脱液成分为0.1M Na₃C₆H₅O₇，pH为3.0，通过UV(254nm)检测收集洗脱峰。如图3所示，1为marker，2为未纯化的ppGalNAc-T20抗血清，3为纯化后的ppGalNAc-T20多克隆抗体。

本实施例所得抗体是用ppGalNAc-T20的茎区一段蛋白作为抗原得到的，该抗体不与和ppGalNAc-T20同源性最高的ppGalNAc-T10发生交叉反应，也不与其它的ppGalNAc-Ts家族成员发生交叉反应。具有免疫印迹、组织细胞染色及免疫沉降等用途。不仅可以用于ppGalNAc-T20蛋白的体内检测，还可以用于ppGalNAc-T20蛋白的体外检测。

实施效果

(1)Western Blotting

图4，图5及图6是用Western Blotting检测本实施例制备的多克隆抗体的特异性和灵敏度。如图4所示，从左到右依次为含带Flag标签的ppGalNAc-T1、ppGalNAc-T2、ppGalNAc-T3、ppGalNAc-T4、ppGalNAc-T6、ppGalNAc-T8、ppGalNAc-T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc-T12、ppGalNAc-T13、ppGalNAc-T14、ppGalNAc-T15、ppGalNAc-T16、ppGalNAc-T17、ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T20的293T细胞裂解液。图A，图B和图C中分别为转染Flag-ppGalNAc-Ts质粒的293T细胞裂解液，图A为抗ppGalNAc-T20抗体检测图，图B为抗FLAG抗体检测图。

其中：图A为用ppGalNAc-T20抗体检测带Flag标签的ppGalNAc-T1、ppGalNAc-T2、ppGalNAc-T3、ppGalNAc-T4、ppGalNAc-T6、ppGalNAc-T8、ppGalNAc-T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc-T12、ppGalNAc-T13、ppGalNAc-T14、ppGalNAc-T15、ppGalNAc-T16、ppGalNAc-T17、ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T20蛋白的Western Blotting结果图。一抗比例为1∶2000，抗兔二抗比例为1∶10000，显影时间10min；

图B为用抗Flag抗体检测带Flag标签的ppGalNAc-T1、ppGalNAc-T2、ppGalNAc-T3、ppGalNAc-T4、ppGalNAc-T6、ppGalNAc-T8、ppGalNAc-T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc-T12、ppGalNAc-T13、ppGalNAc-T14、ppGalNAc-T15、ppGalNAc-T16、ppGalNAc-T17、ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T20蛋白的Western Blotting结果图；一抗比例为1∶2000(HRPconjugated)，无需二抗，显影时间10min；

图C为用抗actin抗体检测带Flag标签的ppGalNAc-T1、ppGalNAc-T2、ppGalNAc-T3、ppGalNAc-T4、ppGalNAc-T6、ppGalNAc-T8、ppGalNAc-T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc-T12、ppGalNAc-T13、ppGalNAc-T14、ppGalNAc-T15、ppGalNAc-T16、ppGalNAc-T17、ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T20蛋白的Western Blotting结果图；一抗比例为1∶2000，抗鼠二抗比例为1∶2000，显影时间10min。

图4说明ppGalNAc-T20抗体特异性良好，不与其它的ppGalNAc-Ts家族成员发生交叉反应；图5说明ppGalNAc-T20抗体具有良好的灵敏度，可检测出低至0.625ng的纯化后抗原蛋白GST-short T20；图6说明ppGalNAc-T20抗体具有良好的灵敏度，可检测出低至1.0μg的转染细胞裂解上清中的FLAG-ppGalNAc-T20蛋白；

(2)ppGalNAc-T20多克隆抗体在免疫组化中的应用

图7为用ppGalNAc-T20抗体通过免疫组化法检测C57小鼠睾丸组织中ppGalNAc-T20蛋白表达分布结果图，箭头所示处即为用ppGalNAc-T20抗体检测到的ppGalNAc-T20蛋白在C57小鼠睾丸组织中的表达分布。该图说明ppGalNAc-T20抗体可以应用于免疫组化实验检测动物组织内ppGalNAc-T20蛋白的表达分布情况。

(3)ppGalNAc-T20多克隆抗体在免疫沉淀中的应用

图8为用ppGalNAc-T20抗体通过免疫沉淀法检测MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞裂解液的Western Blotting结果图，其中MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞1和2分别为转染pcDNA3.1-Full-length-T20和对照pcDNA3.1载体。该图说明ppGalNAc-T20抗体可以应用于免疫沉淀实验检测细胞裂解液中的ppGalNAc-T20蛋白。

序列表

<110>上海交通大学

<120>ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗体的制备方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>336

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

ctgtacaagg ataagcacct ggtgaagtca gcggagcccg gggagcagca gacatttcca     60

ctgggcctgg gagatgggca attctattca tggacagatg gtttgagaag aaaggactgg    120

catgactatg aaagcattca gaaagaggct atgcgctcag ggaaaggtga acatgggaaa    180

ccttaccccc ttactgaaga ggaccatgat gactcagctt acagggaaaa tggttttaat    240

attttcgtca gcaacaatat tgctctagag aggtctctgc cagatattcg tcatgctaac    300

tgtaagcata agatgtatct ggaaaggctg ccaaac                              336

<210>2

<211>112

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Leu Tyr Lys Asp Lys His Leu Val Lys Ser Ala Glu Pro Gly Glu Gln

1               5                   10                  15

Gln Thr Phe Pro Leu Gly Leu Gly Asp Gly Gln Phe Tyr Ser Trp Thr

            20                  25                  30

Asp Gly Leu Arg Arg Lys Asp Trp His Asp Tyr Glu Ser Ile Gln Lys

        35                  40                  45

Glu Ala Met Arg Ser Gly Lys Gly Glu His Gly Lys Pro Tyr Pro Leu

    50                  55                  60

Thr Glu Glu Asp His Asp Asp Ser Ala Tyr Arg Glu Asn Gly Phe Asn

65                  70                  75                  80

Ile Phe Val Ser Asn Asn Ile Ala Leu Glu Arg Ser Leu Pro Asp Ile

                85                  90                  95

Arg His Ala Asn Cys Lys His Lys Met Tyr Leu Glu Arg Leu Pro Asn

            100                 105                 110

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gttgcgagcg gccgcctgta caaggat                          27

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gataatgagt cgaccgtttg gcagcctttc                       30