BACILLUS VELEZENSIS AH2菌株的纯培养物以及用于植物致病真菌的生物防治的产品

摘要

本发明涉及Bacillus velezensis AH2菌株的纯培养物以及用于生物防治植物致病真菌的产品。本发明涉及用于生物防治植物致病真菌的新型杀真菌剂产品，其含有一种新的Bacillus velezensis AH2菌株分离物，该分离物保藏于西班牙普通微生物保藏中心(CECT)，保藏号为CECT-7221，其对这些类型的病原体具有高拮抗剂活性，同时其可以利用不同的机制刺激植物生长。本发明也涉及一种液体配制品，其在环境温度下具有良好稳定性并可有效治疗由植物致病真菌所引起的疾病以及刺激植物生长。

说明书

发明目的

本发明的目的是用于植物致病真菌生物防治的产品，其由新的Bacillusvelezensis(RuizGarcía et al.，2005)AH2菌株的新分离物的活细胞所形成，具有高抗真菌活性，特别是抗不同的植物致病真菌，同时具有通过不同机制刺激植物生长的良好能力。该产品通过经发酵肉汤得以配制，发酵肉汤通过振荡深层培养获得，其被直接用于该配制品中。该配制品在环境温度下可维持至少6个月的高活性。本发明的另一目的是提供用于制备该配制品的Bacillus velezensis AH2菌株。

背景技术

为了减少农业中大范围使用的化学产品的不利影响，作为替代，发展并扩大综合生产和有机农业生产过程的需求和重要性早已为人所知。在这样的背景之下，利用来自微生物的生物制品对害虫和疾病进行生物防治以及对具有商业价值的作物进行施肥是最有前途的替代之一。更进一步地，由于可能通过可再生资源进行生产，这些生物制品在可持续农业模式中扮演了重要角色(Altieri，1997)。

该路线的主要优点在于由于基于天然机制，其为环境友好型、无污染的生态学替代，其大大减少病原体获得抗性的风险。同时，由于其作用模式是选择性的，其通常很少可能伤害其他有益生物体，并且在许多情况下，它们有益于生态系统并刺激植物生长，由此使得农业生产更可持续发展，而同时对人类健康的影响最小或是没有影响。事实上，所有害虫和疾病在某种程度上都会受到敌对生物体的影响。在许多情况下，这些生物体代表了自然界中调节病原生物体群体的最重要因素。

在引起植物疾病的生物体中最重要的一类是植物致病真菌，包括例如葡萄孢属(Botrytis)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、链格孢属(Alternaria)、镰孢属(Fusarium)、疫霉属(Phytophthora)、串珠根霉属(Thielaviopsis)以及葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)，它们能够在土壤中生存多年。

在寻找具有商业价值的生物防治物质时，必须考虑一系列因素，对它们同时进行研究才可以可获得成功的结果。其中例如可以提及的是可单独使用也可在混合接种物中使用的生物体、特定的生物活性、对抗病原体的作用机制、使用的生产系统以及配方的类型及其稳定性(Warrior，2000)。

已经有几种机制描述并解释了这些病原体生物防治的现象，例如寄生、交叉保护、抗生、竞争和抗性诱导(Shoda，2000，Walsh et al.，2001)。

由于植物和其他生物体之间在本文所建立的联系，研究的最多的生态位之一是根际(Warrior，2000)。从1980年代就已经开始对根际微生物作为化学杀虫剂的可能替代物来控制大量疾病进行了研究。由于它们在土壤中的大量分布、移植到植物根系中的能力和产生大量有益化合物及大量病原体拮抗剂的能力，这些生物体非常适用于害虫和疾病的生物防治(Angaiah等，1998；Hill等，1994；Maurhofer等，1991；Rodriguez，和Pfender.1997；Ross等，2000和Thomashow等，1997)。

在根际的微生物群体中，已被作为生物防治由所述微生物导致的害虫和微生物所致疾病的物质进行广泛研究的是由真菌所形成的群。它已经被成功用于病原体真菌的防治，所述真菌包括葡萄孢属、镰孢属、腐霉属、疫霉属、丝核菌属、核盘菌属(Sclerotinia)、青霉属(Penicillium)和大壳球孢属(Macrophomina)等(Whipps and Lumsden，2001，McQuilken等，2001，Jones and Whipps，2002等)。由于它的各种代谢作用，该微生物群能够产生大量各种可用于生物防治的物质。基于这些原因，基于真菌的菌株和产物的数量不断增大且更加多样化(Cook等，1996，Whipps，1997，Fravel等，1998，EPA USA 2006.美国专利6,306,386和美国专利6,890,530等)。疾病的生物防治机制是复杂的，并且已知其可能是几种机制的加合或协同的结果。在这当中竞争是针对营养和空间、产生防止孢子萌发(抑真菌作用)或者引起细胞死亡(抗生作用)和通过酸化土壤、防止病原体的增殖来对根际进行修饰的能力。生物防治也可能是病原体和生物防治物质(寄生现象)之间直接相互作用的结果，例如通过如几丁质酶、葡聚糖酶之类的水解酶，或者后者与毒性代谢物的联合作用(Benitez等，2004)。

促进植物生长的根际细菌(rizobacterias)(PGPR)在害虫和疾病的生物防治中的用途也已经被广泛研究。该类物质的主要特性除了它们的保护作用外还具有较强的移植到植物根系中的能力和较强的刺激植物生长的能力，这使得作物的健康得到了全面地改善，并由此植物对病原体的攻击也具有更强的抗性。这类物质已经用于由如丝核菌属、镰孢属、腐霉属、串珠根霉属、青霉属、链格孢属及葡萄孢属的植物致病真菌所引起的疾病(Emmert和Handelsman，1999，ligon等，2000，Cavaglieri等，2004以及Roberts等，2005，美国专利7,118,739等)。

由于假单胞菌属(Pseudomonas)是根际中最活跃且占优势的物质之一，在过去几年中其已经成为许多研究的目标(Geel和Schippers，1983，deFreitas和Germida 1991，de la Cruz等，1992，Ligon等，2000，美国专利7,087,424)。该属成员产生与植物疾病的减少和抑制紧密相关的不同抗生素。在该现象中其重要作用的另一因素是铁载体的产生，其通过铁供应途径进一步促进植物生长。该能力在假单胞菌属成员中高度扩张。然而，该菌属无法在其生长期内产生抗性结构，这在一定程度上限制了用该种菌属菌株获得的生物制品的稳定性和有效性。

由于芽孢杆菌属(Bacillus)在这方面具有高度潜力，对它也已经进行了广泛研究。作为主要特点，它实际遍布于所有类型的土壤中，这赋予其高耐热性、在液体介质中快速生长以及形成使其长时间生存的抗性孢子。所有这些赋予该属菌株具有作为生物防治物质的高潜力。美国环境保护局(EPA)已经登记了超过10个该属不同种的菌株作为生物杀虫剂并且特别是作为生物杀真菌剂(EPA 2006)。该属菌株对植物致病真菌生物防治相关的主要机制也包括产生抗生素、铁载体、表面活性剂以及如几丁质酶的水解酶(Utkhede，1984，Acea等，1988，Stanghellini和Miller 1996，Shoda2000，Banat等，2000，zhang等，2001，Ruiz-Garcia等，2005，美国专利7,087,424及EP1647188)。

也已经对其它细菌菌属作为生物防治物质进行了广泛研究，所述细菌包括肠杆菌属(Enterobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)及链霉菌属(Streptomyces)(McClure等，1998，Brewster等，1997，Sabaratnam和Traquair，2002，Cavaglieri等，2004等)。

生物制品产品的物理形式也是必须考虑的非常重要的因素。所要寻求的是微生物在非活性状态下维持存活状态或维持代谢活性(Fernández，1995)。后者是农业生物科技中最重要的问题之一，因为微生物细胞不仅要长时间保持存活而且它们还必须能在环境中生存和实现所要实现的功能。

当提及产孢子微生物时，由于这些生物体能够长时间存活并且一旦重新建立合适条件便能够生长和繁殖，因此它们总体上在配制方面具有较大的弹性。细胞固定化技术提供了相对于游离细胞的一系列优点，使得它们对实际应用而言非常具有吸引力(Fernández，1995，Vassileva等，1998a和1998b等)并且对环境生物技术而言是非常特殊的。固定化细胞的应用能在不制造污染问题的情况下加强微生物的作用，由此产生非常有活性且新颖的产品(Bellota等，1994，1998，Fonseca，1998，西班牙专利ES2234417)。

发明内容

本发明的目标在于提供用于生物防治植物致病真菌的产品，其由新型Bacillus velezensis(Ruiz-García et al.，2005)AH2菌株的新分离物的活细胞形成。所述菌株分离自Murcia地区的土壤中。该分离物的主要特点在于它具有高抗真菌活性，能对抗导致经济作物疾病的不同物质，如葡萄孢属、腐霉属、丝核菌属、链格孢属、镰孢属、疫霉属、串珠根霉属及葡萄座腔菌属等。此外，它具有通过不同机制刺激植物生长的能力。所述微生物已经保藏于西班牙普通微生物保藏中心(CECT)，保藏编号为CECT-7221。该菌株已经由作者鉴定并且进一步请求CECT进行鉴定。CECT所作的物种鉴定通过直接PCR扩增16S rRNA基因进行，测定其部分序列(从两个方向阅读)并对序列进行分析，最终得到的结果是该菌为Bacillus velezensis。用于植物致病真菌的生物防治以及刺激植物生长的产品由液体配制品组成，其含有培养物的活孢子为主要活性成分。

微生物Bacillus velezensis AH2菌株CECT-7221及其突变体都是本发明的目标。它通过把分离物组合到营养琼脂培养基(Oxoid)中，除去植物细胞后根据其对不同植物致病真菌的拮抗能力进行选择，同时进一步考虑刺激植物生长能力的过程来得到(Fernández 2004)。在土豆葡萄糖琼脂(PDA)培养基(Oxoid)中体外生物测定中确定抑制真菌生长的能力。通过这些生物检测，基于抑制不同植物致病真菌生长的高能力而从所有被测试的分离物中选择AH2菌株，所述真菌如葡萄孢属、腐霉属、丝核菌属、链格孢属、镰孢属、疫霉属、串珠根霉属和葡萄座腔菌属。刺激植物生长的能力通过实验室生物检测进行证实，检测方法参见Bashan et al.，1986，Fenández 1995和Bashan 1998所述。然后通过温室生物检测(Villaverde et al.2004)验证其刺激植物生长的能力。此外，已经证实它能溶解磷酸盐/酯、产生吲哚-3-乙酸和其它促进植物生长的物质以及铁载体。1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的存在也通过以1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)作为唯一氮源的培养基中生长情况得以确定。所有这些活性都确证其刺激植物生长的能力。Villaverde etal.，2004。

同样地，制备用于治疗由植物致病真菌所致疾病的产品的方法也是本发明的目标，该方法由如下步骤构成：

a)在合适的培养基中通过深层发酵使Bacillus velezensis AH2菌株生长并产生孢子。在该步骤中细胞计数值达到每毫升10⁹个菌落形成单位(CFU.ML^-1)的水平。

b)通过往含细胞的发酵肉汤中添加其它成分来制备配制品。

该产品具有良好的稳定并在不超过30℃的温度下保持而不显著丧失细胞存活至少6个月。已经证实该配制品的抗真菌和刺激植物生长的活性在超过6个月的时间里保持了其初始特性。其在温室检测应用中在治疗由不同植物致病真菌所致疾病以及刺激植物生长当中表现出有效性。其也在田间检测中显示出对植物致病真菌的治疗特别是对灰色葡萄孢(Botrytiscinerea)的效力。

本发明优选实施方式

Bacillus velezensis AH2菌株的增殖

取一安瓿瓶保存的Bacillus velezensis AH2菌株分离物，接种在PDA培养板中并在30℃下温育72小时对其进行激活。从该板中制备用于发酵罐的接种物，用接种环取一部分培养物，接种于装在1000mL Erlenmeyer烧瓶的100mL土豆葡萄糖(PD)肉汤培养基中并在30℃下振荡温育16小时。此后烧瓶中的内容物被接种到含PD培养基的3L Braun BiotechB发酵罐中，终体积为2L。在600rpm的振荡速度及1v.v.m(2L.min^-1)的通气量、30℃温度下发酵24小时。pH允许自由变动，最终值≤5.5。终浓度为2×10⁹个细胞.mL^-1，并且实现约80％的孢子化。指数生长期(μ)的特定生长速率为0.40h^-1。在第一个14小时的培养中形成不同的生长阶段，并且随后的孢子化过程达24小时。

发酵一结束，便取出2L的发酵肉汤，并分别加入0.5％、0.1％和0.2％的丙酸、山梨酸和抗坏血酸。

周期性地确定该产品在营养琼脂培养基中的细胞存活率，结果确定在温度不超过30℃的情况下保存六个月后其存活率超过80％。

所有的抗真菌和植物生长刺激能力的检测都采用按照本发明的制造流程所制备的产品并获得十分满意的结果。

体外拮抗检测

这些检测在培养皿中进行。病原体在PDA板中于25℃下培养48-72小时。然后取直径约为1cm的一部分，该部分被置于具有PDA培养基的培养板中心。所述板在最后通过接种环接种Bacillus velezensis AH2菌株。然后在28℃下温育48-72小时直至观察到抑制现象。在用葡萄座腔菌进行检测的情况下，也进一步在PD培养基中振荡培养，离心并取上清加入到同一块板的1cm²的孔中以确定无细胞发酵肉汤的抗真菌能力。

图1显示对一些试验病原体的体外拮抗作用测定。根据所能观察到的，在每个所检测的植物致病真菌中都存在强真菌生长抑制活性。

此外，在用葡萄座腔菌进行检测的情况下，利用培养物上清所进行的检测显示细菌具有胞外抗真菌活性，该活性在许多其它芽孢杆菌属的菌株中都存在。

植物生长刺激检测

为了鉴定刺激植物生长的能力，在试验温室条件下在植物容器中对黄瓜进行检测。来自Probelte S.A的Bioprón PMC3产品由于已知具有刺激不同作物的植物生长的能力而被用作阳性对照。

图2显示了该检测的结果。

由图2中观察到的结果可知，绿色部分及根部在总鲜重上有明显的增加。虽然这些值比较低，它们与采用Bioprón PMC3时所获得的值相比没有统计学上95％置信的差异，但是如图中所观察到的，它们与对照的值是有差异的。在其它如西红柿、莴苣等作物上进行这些检测获得了类似结果，这可认定从Probelte S.A研究实验室中分离的Bacillus velezensis AH2菌株的植物生长刺激能力。

生产条件下的功效检测

检测参考：        AFS Mazarron西红柿2006

产品商用名：      AFS

作物：            Amadeo西红柿(Lycopersicon esc.M)

条件：            生产温室，局部灌水

种植模式：        1m×0.6m

种植密度：        约16600植物/ha

土壤类型：        砂壤

有效成分：        Bacillus velezensis AH2菌株，10⁸CFU/mL

产品的一般用途：  杀真菌剂

配制品的类型：    可溶性液体

应用模式：        叶面喷施

检测的目标病原体：灰色葡萄孢

参考产品：        Karbel(注册地R.O.P.M.F(植物保护产品和材料

                  的官方注册)，注册号23506/14(Probelte S.A.的

                  25％carbendazime+25％Diethofencarb.1g/L)

                  检测事项

序号     名称    剂量        活性成分

1        对照

2        AFS     15(mL/L.)    Bacillus velezensis 10⁸CFU/mL

3        TRL     5(mL/L)      Trichoderma harzianum+绿色木霉(T.viride)10⁸CFU/mL

4        AFS     5(L/ha)      Bacillus velezensis 10⁸CFU/mL

5        KARBEL  1(g/L)       25％carbendazime+25％Diethofencarb

重复4次进行完全随机分组设计检测。每次处理的基本区域大小是15m²和60m²的总面积。

在检测过程中利用叶面喷施法施用两次，T₁和T₂，肉汤体积为1200L/ha。第一次施用在种植后2.5个月，第二次施用在第一次施用后17天。

为了对检测进行评价，计数了基本区域中每株植物的西红柿总数，对带有葡萄孢属的西红柿作了标记并根据病原体的攻击强度给出数值1-4，基于此对受侵害情况作了计算。在检测过程中进行了3项评估，初始评估V₀和处理终结时作2次评估，V₁为实施第二次处理后的7天，以及过15天后为V₂。

检测结果

V₀评估，没有观察到疾病症状

第一次评估V₁(在第2次处理后一周)

ABBOTT功效

  事项   平均   ％功效   对照   0.108    AFS(15mL/L)   0.01   90.82   TRL(5mL/L)   0.015   85.99   AFS(5L/ha)   0.035   67.16   KARBEL(1g/L)   0.020   81.17

Duncan`s多范围测试

  事项   显著差异   对照   b   AFS(15mL/L)   a   TRL(5mL/L)   a   AFS(5L/ha)   b   KARBEL(1g/L)   a

第二次评估V₂(第2次处理后的15天)

ABBOTT功效

  事项   平均   ％功效   对照   0.192    AFS(15mL/L)   0.036   81.30   TRL(5mL/L)   0.041   78.57   AFS(5L/ha)   0.062   67.79   KARBEL(1g/L)   0.051   73.25

Duncan`s多范围测试

  事项   显著差异   对照   b   AFS(15mL/L)   a   TRL(5mL/L)   a   AFS(5L/ha)   a   KARBEL(1g/L)   a

如所观测到的，在两次评估中15mL/L AFS的处理引起有效保护并好于作为对照的商用化学产品。在对照下，侵害一直维持而所检测产品的有效性非常高。进行的统计分析表明所检测的生物学产品和对照化学产品之间没有显著差异。结论：

·在Mazarron(Murcia)进行的检测中，在为防治灰色葡萄孢而进行的叶面喷洒和在将来观察其行为中，AFS相对于未受任何处理的对照而言具有非常良好的活性。

·在V₁评估中，用15mL/L剂量的获得水平为90％的功效。

·在V₂评估中功效高，超过70％，特别是在用AFS的情况下高于80％。

·需要强调的是在用对照进行处理的情况下作物上病原体发生水平得以维持。

·当实施Duncan`s多范围测试时，基于所测定的参数分析两次评估中的差异，可以发现在所研究的剂量之间不存在差异，其置信值为99％，而相对于未处理的对照而言则有差异。

·作物在最高剂量下没有观察到毒性症状。

·因此可以得出结论：15mL/L剂量的AFS是防治西红柿中灰色葡萄孢的合适配制品。