丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法

摘要

本发明公开了一种丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法，是分别合成羟基磷灰石粉末和制备丝胶蛋白溶液，将两者按不同质量比例混合，通过冷冻干燥方法制备丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架材料。本发明制备的丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架材料制备工艺简单，需时短，制备条件容易满足；不添加致孔剂，所用试剂少且廉价，成本低；本发明所制备的支架材料孔隙率较高，孔隙分散均匀且孔与孔之间相互贯通；具有一定的力学性能。

说明书

技术领域

本发明涉及丝胶蛋白的加工利用领域，特别涉及一种骨组织工程中丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架材料的制备方法。

背景技术

骨损伤和骨缺损是日常生活中非常常见的疾病。传统医学主要采用自体和异体移植的方法进行骨缺损的修复，但这种方法有出现新损伤以及发生免疫排斥反映等弊端，并不是理性的骨修复方法。而骨组织工程是用少量的组织细胞经体外培养扩增后修复骨缺损，同时可依据骨缺损情况任意塑型达到完善的形态修复，为实现无损伤修复开辟了新的途径。

丝胶蛋白(Silk Sericin简称SS)是一种球状蛋白，相对分子量为1.4～31.4万，由18种氨基酸组成。丝胶蛋白具有良好的水溶性、吸水性、生物相容性，能抑制酪氨酸酶的活性，具有抗氧化性、抗凝血、抗肿瘤等特性。作为一种天然蛋白质资源，丝胶可应用于生物材料和医药领域等。

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA，图1)是一种生物活性陶瓷，其化学组成和结晶结构类似于人体骨骼中的磷灰石。HA分子中的Ca2+可以与含有羧基的氨基酸、蛋白质、有机酸等发生交换反应，具有良好的骨传导性能和生物活性，能与骨组织形成牢固的骨性结合促进骨骼生长，相态较稳定，无毒性、发炎性，是公认的性能良好的骨修复替代材料。但也存在脆性大、韧性较差、力学性能不足，降解缓慢且易从植入位点迁移等缺点，这都限制了其作为人体材料种植体的使用。

发明内容

本发明的目的是分别合成羟基磷灰石粉末和制备丝胶蛋白溶液，将两者按不同质量比例混合，通过冷冻干燥方法制备丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架材料。

本发明的一种丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)量取一定量丝胶溶液置于烧杯中，按比例向其中加入羟基磷灰石粉末，保持丝胶蛋白与羟基磷灰石的总量在溶液中的比例相一致；

(2)将丝胶蛋白与羟基磷灰石的混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处理3～5min；

(3)取出混合溶液，向其中缓慢滴加微量的浓度为0.5％的戊二醛交联剂，磁力搅拌器缓慢搅拌均匀；

(4)将混合溶液快速移入96孔细胞培养平板，并立即放入-20℃冰箱中预冷冻12h；

(5)将冷冻12h后平板样品取出，在室温20℃条件下，进行回温处理4h；

(6)将回温后的平板样品再次放入-20℃冰箱中冷冻，然后放入-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥，制得不同比例的丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架。

所述的丝胶溶液，它的制备方法，包括以下步骤：

(1)将去蛹后的桑蚕茧层，放入沸水中进行脱胶处理；

(2)30min后，停止蒸煮，过滤去杂；

(3)将过滤后的丝胶溶液放入旋转蒸发仪中浓缩，获得目的浓度的丝胶溶液。

所述的羟基磷灰石粉，它的制备方法，包括以下步骤：

(1)取饱和Ca(OH)₂溶液，置于60℃水浴中，滴加10％wt的H₃PO₄溶液，和Ca(OH)₂溶液和H₃PO₄溶液的体积比为70∶1～2，期间不断快速搅拌并保持水温；

(2)以滴加氨水的方法，调整溶液的pH保持在8.7；

(3)滴加完H₃PO₄溶液后继续搅拌3h，搅拌结束后置于室温静置48h；

(4)倾去上层清液，收集下部沉淀；沉淀先用无水乙醇清洗2-3次，再用蒸馏水清洗3-4次；

(5)将得到的沉淀放入冰箱中冷冻，然后移入冷冻干燥器中干燥，研磨，得到羟基磷灰石粉末。

一种丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法，所述步骤(1)中丝胶蛋白与羟基磷灰石的重量比为10∶1～1∶1。

丝胶溶液的制备方法，所述步骤(1)中水的用量是到将茧层浸没。

丝胶溶液的制备方法，还包括获得目的浓度的丝胶溶液后，抽取丝胶溶液，进行SDS凝胶电泳，测定丝胶蛋白分子量。

羟基磷灰石粉的制备方法，其中步骤(1)是取700ml饱和Ca(OH)₂溶液，置于60℃水浴中，滴加10％wt的H₃PO₄溶液11ml，期间使用磁力搅拌器不断快速搅拌并保持水温。

本发明的有益之处在于：

将丝胶蛋白与羟基磷灰石制成骨组织工程复合支架材料，一方面丝胶蛋白可以作为羟基磷灰石粒子的粘结剂，抑制羟基磷灰石粒子在植入点的脱离和迁移；另一方面可以提高材料的力学性能，获得聚合物的韧性和无机粒子的强度和硬度。

本发明采用共混法制备丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架材料，综合两者的优良性能，获得一种性能优良的生物活性骨修复材料。

本发明所用的丝胶蛋白的分子量范围为97.2～200.0KDa，制备的丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架材料制备工艺简单，需时短，制备条件容易满足；不添加致孔剂，所用试剂少且廉价，成本低；本发明所制备的支架材料孔隙率较高，孔隙分散均匀且孔与孔之间相互贯通；具有一定的力学性能。

附图说明

图1为羟基磷灰石的孔隙结构照片。

图2为发明实施例的浓度比例为9∶1的丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架材料的孔隙结构照片。

图3为发明实施例的浓度比例为7∶3的丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架材料的孔隙结构照片。

图4为发明实施例的浓度比例为5∶5的丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架材料的孔隙结构照片。

具体实施方式

下面结合实施例来说明本发明的技术方案：

实施例1：丝胶溶液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将去蛹后的桑蚕茧层，放入沸水中进行脱胶处理；水的用量以能将茧层浸没为宜；

(2)30min后，停止蒸煮，过滤去杂；

(3)将过滤后的丝胶溶液放入旋转蒸发仪中浓缩，获得目的浓度的丝胶溶液；

(4)抽取丝胶溶液，进行SDS凝胶电泳，测定丝胶蛋白分子量，丝胶蛋白的分子量范围为97.2～200.0KDa。

实施例2、羟基磷灰石粉的制备方法，包括以下步骤：

(1)取700ml饱和Ca(OH)₂溶液，置于60℃水浴中，滴加10％wt的H₃PO₄溶液11ml，期间使用磁力搅拌器不断快速搅拌并保持水温；

(2)采用数显pH计监测溶液的pH，以滴加氨水的方法，调整溶液的pH保持在8.7；

(3)滴加完H₃PO₄溶液后继续以较快的转速搅拌3h，搅拌结束后置于室温静置48h；

(4)倾去上层清液，收集下部沉淀；沉淀先用无水乙醇清洗2-3次，再用蒸馏水清洗3-4次；

(5)将得到的沉淀放入冰箱中冷冻，然后移入冷冻干燥器中干燥，研磨，得到羟基磷灰石粉末。

实施例3、一种丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)量取一定量丝胶溶液置于烧杯中，按比例向其中加入羟基磷灰石粉末，保持丝胶蛋白与羟基磷灰石的总量在溶液中的比例相一致；

(2)将丝胶蛋白与羟基磷灰石的混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处理3～5min；

(3)取出混合溶液，向其中缓慢滴加微量的浓度为0.5％的戊二醛交联剂，磁力搅拌器缓慢搅拌均匀；

(4)将混合溶液快速移入96孔细胞培养平板，并立即放入-20℃冰箱中预冷冻12h；

(5)将冷冻12h后平板样品取出，在室温20℃条件下，进行回温处理4h；

(6)将回温后的平板样品再次放入-20℃冰箱中冷冻，然后放入-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥，制得不同比例的丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架。

实施例4、丝胶/羟基磷灰石复合材料的力学性能测试

采用万能试验机(AGS-J型，SHIMADZU公司，日本)对各样品进行弹性模量的测定。将各支架材料统一制成直径5mm，高5mm的圆柱状，尽量使支架上下表面相互平行并尽量平整。环境温度和湿度保持一致。每组样品取三个平行样，取平均值。

实施例5、一种丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)精确量取一定量的丝胶溶液置于烧杯中，按比例向其中加入羟基磷灰石粉末。使HA∶SS的比例为1∶9。

(2)将丝胶蛋白与羟基磷灰石的混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处理3～5min。

(3)取出混合溶液，向其中缓慢滴加微量的浓度为0.5％的戊二醛交联剂，磁力搅拌器缓慢搅拌均匀。

(4)将混合溶液快速移入96孔细胞培养平板，并立即放入-20℃冰箱中预冷冻12h。

(5)将冷冻12h后平板取出，在室温条件下，进行回温处理4h，将成型的样品小心地取出。

(6)将样品再次放入-20℃冰箱中冷冻，然后放入-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥，最终制得丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架HA10。其密度为33mg/ml，孔隙率为50.1％，弹性模量为7.41MPa，图2。

实施例6、一种丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)精确量取一定量的丝胶溶液置于烧杯中，按比例向其中加入羟基磷灰石粉末。使HA∶SS的比例为3∶7。

(2)将丝胶蛋白与羟基磷灰石的混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处理3～5min。

(3)取出混合溶液，向其中缓慢滴加微量的浓度为0.5％的戊二醛交联剂，磁力搅拌器缓慢搅拌均匀。

(4)将混合溶液快速移入96孔细胞培养平板，并立即放入-20℃冰箱中预冷冻12h。

(5)将冷冻12h后平板取出，在室温条件下，进行回温处理4h，将成型的样品小心地取出。

(6)将样品再次放入-20℃冰箱中冷冻，然后放入-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥，最终制得丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架HA30。其密度为39.7mg/ml，孔隙率为51.3％，弹性模量为10.56MPa，图3。

实施例7、一种丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)精确量取一定量的丝胶溶液置于烧杯中，按比例向其中加入羟基磷灰石粉末。使HA∶SS的比例为5∶5。

(2)将丝胶蛋白与羟基磷灰石的混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处理3～5min。

(3)取出混合溶液，向其中缓慢滴加微量的浓度为0.5％的戊二醛交联剂，磁力搅拌器缓慢搅拌均匀。

(4)将混合溶液快速移入96孔细胞培养平板，并立即放入-20℃冰箱中预冷冻12h。

(5)将冷冻12h后平板取出，在室温条件下，进行回温处理4h，将成型的样品小心地取出。

(6)将样品再次放入-20℃冰箱中冷冻，然后放入-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥，最终制得丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架HA50。其密度为52.7mg/ml，孔隙率为33％，弹性模量为15.64MPa，图4。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。