用于医学组织工程的通用脂肪源性干细胞的制备方法

摘要

本发明请求涉及一种用于医学组织工程的通用脂肪源性干细胞的制备方法，有以下步骤：1)切取脂肪组织；2)使用I型胶原蛋白酶对步骤1得到的脂肪组织37℃消化40～60min后分离，获得原代的脂肪源性干细胞；3)构建表达US2和US3基因的融合表达重组质粒pEGFP-N-US2和pEGFP-N-US3，将重组质粒以脂质体法转染到原代的脂肪源性干细胞中，经筛选、扩大培养，即得本发明所述的用于医学组织工程的通用脂肪源性干细胞。采用本发明方法制备脂肪源性干细胞，大大降低了异体移植的免疫排斥反应，具有良好的生物安全性和较低的免疫原性，具有通用性，适用于组织工程的干细胞批量生产，为医学治疗提供一种新的材料来源。

说明书

技术领域

本发明属于医学组织工程的技术方法领域，特别涉及一种用于医学组织工程的通用脂肪源性干细胞的制备方法。

背景技术

干细胞自发现以来一直是研究的焦点，其意义在于作为细胞治疗与组织工程人造器官替代治疗的干细胞、探讨胚胎发育的调控机制、作为疾病基因治疗的载体、利用胚胎干细胞体外整合外源基因用于研究基因功能、药物筛选平台的建立以及药理研究与新药开发等。我国人口众多，需要干细胞治疗的患者数目惊人，尤其是独生子女多，能提供具有相同或相关基因组织器官的可能性低，因此对干细胞及其衍生组织需求量巨大、也更为迫切。

成体干细胞存在各种组织及器官中，来源广泛，不涉及伦理问题，是一类具有多向分化潜能的细胞群体，已成为普遍研究和应用的对象。脂肪组织源性干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是2001年发现的一类成体干细胞。该类细胞在合适诱导剂的作用下可向成骨、软骨、脂肪和成肌等多向分化，且它的获取比常用的骨髓间充质干细胞容易，给患者带来的痛苦很小；其次，脂肪组织比骨髓中所含的间充质干细胞比率大，成纤维细胞集落形成单位试验表明，脂肪组织中干细胞数目至少是骨髓的500多倍；甚至脂肪组织抽取后供区残留的脂肪组织仍可扩增，容易大量获得，ADSCs对培养条件的要求宽松，体外扩增能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞，从应用的角度考虑ADSCs是做为干细胞良好来源。

然而干细胞的应用都不可避免地面对一个关键的问题即跨个体应用时干细胞的免疫排斥反应。目前用于临床治疗的干细胞多为自体干细胞，经体外扩增、定向诱导分化后再回植到体内以完成修复，即所谓的一对一“个性化治疗”。但存在着操作费时，需经过分离、培养、扩增、鉴定才能植入体内，无法解决急症手术、恶性肿瘤切除后等修复的难题；更无法跨个体应用，难以满足组织工程的产业化需求。

“通用型干细胞”是新近提出的一种概念细胞，特指可跨个体和/或跨种属应用的干细胞。通用型干细胞的建立将跨越时限性和个体间的免疫限制，极大程度地拓展干细胞在组织工程上的应用范围。关于该领域的国内外文献仅限于理论而未见研究报道。理想的通用型干细胞应该具有：免疫豁免特性，同时保持干细胞的自我复制和多向分化的特性以及良好的生物安全性。考虑到需应用于不同个体，免疫排斥当是首要解决的问题。

人类主要组织相容性复合物(major histocompibility complex，MHC)在免疫排斥中至关重要，作为代表个体特异性的主要组织抗原，在排斥反应中起关键作用。通常认为，避免免疫排斥的理想途径一是使供、受体MHC尽可能匹配，二是降低移植物MHC的表达以逃避受体T细胞的识别。已经证实，MHC I抗原表达缺失的肿瘤细胞可以避免T细胞的识别和攻击，导致肿瘤的免疫逃逸，若将I类基因转染肿瘤细胞株，则后者的成癌性和转移自行消失。这就表明可以通过干细胞的基因改型以下调其MHC I抗原表达来解决免疫排斥反应对干细胞跨个体应用的限制，以达到建立一种通用型干细胞的技术方法。

病毒逃逸免疫的一种典型方式是以潜伏形式存在于宿主细胞内或整合于细胞DNA中，降低移植物MHC的表达，对抗免疫清除。已知人巨细胞病毒(HumancytomegaloVirus，hCMV)产物US2，US3可以不同方式不同程度地降低细胞表面MHC I抗原的表达。US2与MHC I类分子结合，使之转运至胞浆内，被蛋白酶小体降解而破坏；而US3能使MHC I类分子滞留于内质网(ER)内，不能输送至细胞表面而进行表达；此外，人巨细胞病毒(HCMV)感染细胞后，产生病毒的磷酸化蛋白65，抑制HCMV特异Ag肽的产生，则不能被APC提呈，使T细胞不能识别、不能活化。这就为我们下调干细胞MHC I抗原性提供了技术上的支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于医学组织工程的通用脂肪源性干细胞的制备方法，采用本发明方法制备脂肪源性干细胞，大大降低了异体移植的免疫排斥反应，具有良好的生物安全性和较低的免疫原性，具有通用性，适用于组织工程的干细胞批量生产，为医学治疗提供一种新的材料来源。本发明还有操作简单，成本低的优点。

用于医学组织工程的通用脂肪源性干细胞的制备方法，有以下步骤：

1)切取脂肪组织；

2)使用I型胶原蛋白酶对步骤1得到的脂肪组织37℃消化40～60min后分离，获得原代的脂肪源性干细胞；

3)构建表达US2和US3基因的融合表达重组质粒pEGFP-N-US2/US3，将重组质粒以脂质体法转染到步骤2得到的原代的脂肪源性干细胞中，通过G418对新霉素敏感位点进行筛选，待阳性细胞克隆生成进行扩大培养，即得本发明所述的用于医学组织工程的通用脂肪源性干细胞。

所述步骤3)中的重组质粒pEGFP-N-US2/US3包含载体片段pEGFP和基因片段US2/US3。

所述用于医学组织工程的通用脂肪源性干细胞稳定表达US2及US3基因。

对采用本发明的制备方法得到脂肪源性干细胞进行生物安全性检测，检测内容包括急性毒理试验、慢性毒理试验、致瘤试验、致畸试验、局部刺激试验、发热试验、溶血试验和干细胞生长增值及凋亡试验。结果表明所述脂肪源性干细胞未产生不良的生物反应和其他副作用，具有良好的生物适用性。

对采用本发明的制备方法得到脂肪源性干细胞进行对全身免疫反应的影响和对局部免疫反应的影响的检测。全身免疫反应的影响检测项目包括外周血T淋巴细胞(CD4⁺、CD8⁺和CD25⁺)检测试验及脾细胞增殖反应试验；局部免疫反应的影响的检测包括注射局部组织淋巴细胞免疫组化试验和组织病理学观察。试验结果表明，所述脂肪源性干细胞对动物全身和局部造成的免疫反应明显地低于改型前，与自体获取的脂肪源性干细胞免疫反应无明显差异。证明本发明所述脂肪源性干细胞，能够有效地建立起跨个体应用的安全的通用型干细胞。

采用本发明方法制备的脂肪源性干细胞，能下调脂肪源性干细胞MHC I的表达，降低异体移植的免疫排斥反应，通过动物体内和体外实验证明，所述脂肪源性干细胞具有良好的生物安全性和较低的免疫原性。

本发明人致力于干细胞研究，用多年积累的知识和经验开展用于医学组织工程的通用脂肪源性干细胞研究。通过大量的研究和实验证明，采用本发明方法制备脂肪源性干细胞，大大降低了异体移植的免疫排斥反应，具有通用性，适用于组织工程的干细胞批量生产，为医学治疗提供一种新的材料来源，因此本发明被列为编号CSTC，2008BC5004的重庆市科委自然科学基金资助项目。

附图说明

图1为第四代正常兔腹壁脂肪源性干细胞(×200)；

图2为pEGFP-N-US2和pEGFP-N-US3质粒图谱；

图3A为获得改型的脂肪源性干细胞US2基因表达检测；图3B为US3基因表达检测；

图4A为毒理试验裸鼠第1周观察；图4B为第4周观察；图4C为第4周大体解剖；

图5A为毒理试验4周裸鼠肝切片；图5B为脾切片；图5C为心切片；

图6A为致瘤实验接种后瞬时；图6B为接种后1周；图6C为接种后12周；

图7为致畸试验胎鼠检查图，图7A为超高浓度组；图7B为培养基对照组；

图8为转染前后脂肪源性干细胞生长增殖曲线图；

图9为转染前后脂肪源性干细胞凋亡情况直方图；

图10为不同处理细胞注入对脾细胞增殖的对比影响；

图11为局部免疫反应免疫组化结果，图11A为转染后异体兔脂肪源性干细胞组；图11B为正常异体兔脂肪源性干细胞组。

具体实施方式

为了实现建立通用型干细胞的目的，本发明采用了上述的技术方案：从干细胞的获得，到对该细胞进行基因改型，再到检测改型的脂肪源性干细胞生物安全性和改型后免疫原性变化。

现在就具体步骤参考附图或附表对本发明的实施做详细的说明。

一、脂肪源性干细胞的分离培养

(一)试剂和材料

1、主要试剂

生理盐水                大坪医院药剂科

戊巴比妥钠              SERVA，进口分装

I型胶原酶               Sigma，美国

DMEM/F12培养基          HyClone，美国

胎牛血清()              HyClone，美国

胰酶                    Gibco，美国

EDTA                    重庆化学试剂总厂

2、主要溶液及配制

(1)3％戊巴比妥钠溶液    100ml

戊巴比妥钠              3g

生理盐水                100ml

混匀，常温备用

(2)0.75g/L I型胶原酶溶液  100ml

I型胶原酶                 0.075g

DMEM/F12培养基溶液        100ml

混匀，过滤灭菌后4℃备用

(3)0.25％胰酶-0.02％EDTA消化液  100ml

胰蛋白酶                0.25g

EDTA                     0.02g

DMEM/F12培养基溶液       100ml

混匀，0.22um微孔滤器过滤灭菌，4℃备用

(4)D-Hank’s溶液(pH7.4)  1000ml

NaCl                     8g

KCl                      0.4g

Na2HPO4·12H2O           0.135g

KH2PO4                   0.06g

NaHCO3                   0.35g

Glucose                  1g

去离子水                 1000ml

混匀，高温蒸汽消毒，常温备用

(5)DMEM/F12培养基溶液    1000ml

DMEM/F12培养基粉末       包装好的一袋

NaHCO3                   1.2g

青霉素                   10万U

链霉素                   10万mg

定容后混匀，0.22um微孔滤器过滤灭菌后分装为100ml，4℃备用

3、主要器械及仪器

手术器械及消毒物品       国产

100目和50目金属滤网      国产

血球计数板和计数器       国产

CO2细胞恒温培养箱        Shellab，美国

倒置成像显微镜           Olympus CK2，日本

超净工作台               BCM-1000，苏州

低速常温离心机           Sigma 2-5型，美国

培养板(6孔、24孔)        Nunc，丹麦

25、50培养瓶             Nunc，丹麦

微量可调移液器           Eppendorf，德国

电子分析天平             Precisa12A，瑞士

(二)方法

新西兰大耳白兔经1.5％戊巴比妥那腹腔注射麻醉，行常规消毒铺单切取腹壁皮下脂肪组织约3ml左右，立即浸于加有青、链霉素的生理盐水中转入细胞培养室。用D-HANKS液和生理盐水各冲洗组织块一次除去血迹，迅速用眼科剪将脂肪组织剪碎，加入2-3倍体积的I型胶原酶(0.75g/L)，37℃消化60min左右。待消化的脂肪呈粘糊状，加入等体积的DMEM/F12培养基，中和多余的胶原酶，用50目的滤网过滤，滤液离心(10min，1000rm/min)，弃上清，再用DMEM/F12培养基重悬，100目滤网过滤，离心，弃上清。最后，沉淀细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，种植于25cm²培养瓶中，置37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。24小时后以半换液方式进行首次换液，以后每间隔两日全换液。细胞达到80-90％融合时，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA，37℃消化约10分钟后按1∶2比例进行传代培养，传代细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，间隔两日全换液。所有培养均在25cm²培养瓶完成，一直持续到第六代脂肪源性干细胞。

图1为第四代正常兔腹壁脂肪源性干细胞。此时细胞生长较为稳定。种植后6小时可见有细胞贴壁，48小时贴壁基本完成细胞充分伸展，6日可达50％的融和，7-8日有80％以上的融和。生长状态佳，台盼蓝实验活细胞率在80％以上。形态则过渡为成纤维样和梭形细胞为主，间或有一些条索状和多角形细胞。且多角形细胞较以前相比出现了较长的突足，H.E.染色观察核较大核仁明显。细胞排列成漩涡状或放射样分布。

二、pEGFP-N-US2/US3表达质粒的构建及纯化

(一)试剂和材料

1、主要试剂

pEGFP-N表达质粒载体     ATCC，美国

Sac II内切酶            NEB，美国

BamH I内切酶            NEB，美国

T4 DNA连接酶            Omega，美国

US2和US3的基因片段     上海生工合成

DH5α感受态菌          Genmed，美国

胰化蛋白胨             重庆化学试剂总厂

酵母提取物             重庆化学试剂总厂

氯化钙                 重庆化学试剂总厂

氯化钠                 重庆化学试剂总厂

琼脂糖                 重庆化学试剂总厂

小量质粒提取试剂盒     OMEGA，美国

无水乙醇               重庆化学试剂总厂

Tris碱                 重庆化学试剂总厂

冰醋酸                 重庆化学试剂总厂

Na2EDTA·2H2O          重庆化学试剂总厂

G418                   Calbiochem，德国

2、主要溶液及配制

(1)LB液体培养基        200ml

胰化蛋白胨             2g

酵母提取物             1g

氯化钠                 2g

去离子水               190ml

混匀，调PH值为7.2，定容至200ml，高温蒸汽灭菌后冷却到50℃以下，加入青霉素使其终浓度为100U/ml，4℃备用。

(2)0.01M PBS应用液     2000ml

①A液：0.2mol/L Na2HPO4：

Na2HPO4·12H2O         71.632g

蒸馏水                 1000ml

②B液：0.2mol/L NaH2PO4：

NaH2PO4·2H2O          31.2g

蒸馏水                 1000ml

PB：取A液190ml+B液810ml，调整测pH为7.4；吸取PB100ml，加入NaCl 17.8g，加蒸馏水至2000ml，即为0.01M PBS应用液

(3)PBS磷酸盐缓冲液  1000ml

NaCl                 8g

KCl                  0.2g

Na2HPO4              1.44g

KH2PO4               0.24g

加三蒸水800ml，用HCL调PH值至7.4，定容11。高温蒸汽灭菌，室温保存。

3、主要器械及仪器

超净工作台           BCM-1000，苏州

-70℃低温冰箱        Sanyo-382AT，日本

电子分析天平         Precisa12A，瑞士

微量可调移液器       Eppendorf，德国

高速冷冻离心机       Beckman，美国

低速常温离心机       Sigma 2-5型，美国

0.2、0.5、1.5mlEP管  国产

恒温细菌振荡培养箱   DYY-III6B，北京

微量移液器           Eppendorf，德国

核酸蛋白测定仪       Eppendorf，德国

(二)方法

1、质粒构建

通过pEGFP-N质粒上的酶切位点，使用Sac II和BamH I两种酶切割质粒，把US2和US3的基因片段以正向连接的方式用T4 DNA连接酶与质粒载体结合。同时，因为pEGFP-N-US2/US3载体表达的US蛋白是加在GFP蛋白的N端，因此要表达融合蛋白需把US基因的终止密码去掉。图2为构建成的pEGFP-N-US2/US3表达质粒图谱。

2、转化、筛选、扩增

用低温(冰浴)和氯化钙低渗溶液理化处理，使大肠杆菌E coli DH5α处于感受态。42℃热处理后加入表达质粒进行转化。丰富培养基培养使细菌形态复原，保存带有pEGFP-N-US2/US3质粒的DH5α菌液。

用含G418的LB平板对带有pEGFP-N-US2/US3质粒的DH5α菌液的Neo^r抗性位点进行筛选，获得转化成功的pEGFP-N-US2/US3质粒菌落。

将获得的筛选后感受态菌，用LB培养基在37℃恒温细菌培养箱中225转/分钟，震荡扩增，过夜直至菌液混浊(10～12小时)。

对E coli DH5α感受态菌以碱裂解法进行抽提。氯仿、无水乙醇等进行纯化。溶于TE buffer，蛋白核算测定仪测算其浓度，-20℃保存备用。

三、pEGFP-N-US2/US3质粒转染兔ADSCs腹壁脂肪源性干细胞

(一)试剂和材料

1、主要试剂

Lipofectamine^TM2000        Invitrogen，英国

G418                       Calbiochem，德国

DMEM/F12培养基             HyClone，美国

胎牛血清                   HyClone，美国

胰酶                       Gibco，美国

2、主要器械及仪器

微量移液器                 Eppendorf，德国

0.2、0.5、1.5 mlEP管       国产

六孔细胞培养板             国产

(二)方法

1、转染

实验共分三组进行，pEGFP-N-US2质粒和pEGFP-N-US3质粒共转染组，空质粒载体PCDNA3-blank转染对照组和空白转染对照组，每组各两孔细胞，以脂质体法进行转染。将在六孔板中培养达到90％融和的第四代ADSCs于转染前30分钟更换未添加血清和抗生素的DMEM/F12培养基。

配制质粒脂质体复合物：分别将2ug的纯化pEGFP-N-US2及pEGFP-N-US2质粒各自加入125ul无血清无抗生素培养基中，轻轻混匀；用前250ul无血清无抗生素培养基稀释10ul Lipofectamine^TM2000转染试剂，室温下孵育5分钟；将上述三液合并混匀为质粒脂质体复合物，室温下孵育10-20分钟。

将500ul质粒脂质体复合物逐滴加入到含ADSCs的单孔培养基中，总体系在2ml左右，前后摇动培养板以轻轻混匀。细胞置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，4-6小时后更换等体积含10％胎牛血清正常DMEM/F12培养基。在转染成功后48小时，将转染细胞传代培养。

2、筛选

实验分组如上。转染后48小时进行传代，待传代细胞生长达到80％融合后进行G418抗性筛选：300ug/ml持续筛选一周左右(未转染的细胞大量死亡)；150ug/ml维持筛选3-4天(已有转染细胞克隆生成)；阳性细胞克隆生成；小心挑取细胞克隆，并转移到24孔板中培养；待24孔板长满细胞后，传代到6孔板中继续扩大培养，扩增后得到的细胞用于下一步实验。

图3A为转染筛选后细胞的US2免疫荧光检测结果；图3B为转染筛选后细胞的US3免疫荧光检测结果。二者都可见荧光结果为阳性，证实通过该方法成功获得携带US2和US3基因的本发明所述的脂肪源性干细胞。

四、脂肪源性干细胞的生物安全性检测

(一)动物体内试验

本实验标准按照ISO10993.1.3.4.5.10.11的国际标准和GB/T16886.1.2.3.4.5.8.10.11.12-2000的国家标准中关于干细胞临床前安全试验进行。

1、主要试剂及仪器

转染US基因的异体ADSCs  本实验室自制

正常的异体ADSCs        本实验室取材培养

DMEM/F12培养基         HyClone，美国

胎牛血清               HyClone，美国

H.E.常规染色试剂       大坪医院野战外科研究所四室

生理盐水               西南药业，重庆

酶联免疫检测仪(MK3型)  Thermo，德国

2、方法

(1)急性和慢性毒理试验

健康成熟裸小鼠35只，随机分为7组即A、B、C、D、E、F和G组。

将转染了pEGFP-N-US2和pEGFP-N-US3的脂肪源性干细胞调整浓度为1×10⁶/ml。按0.5ml/只的量，自尾静脉注射转染细胞液。G组为阴性对照组，注射单纯培养基。

于注射后24h(A组)、48h(B组)、72h(C组)、1w(D组)、3w(E组)和4w(F组及G组)时分别相应组别的动物，观察动物于处死前有无呼吸抑制、呼吸急促等不良反应，活动是否正常，反应是否灵敏，有无惊厥、瘫痪、死亡；体重与试验前有无明显变化，剖腹观察有无腹水、腹腔内容物有无粘连；断颈处死后取心、肝、肾及脾脏标本，4％多聚甲醛溶液固定24h，制作石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察。

毒性程度根据中毒症状分为无毒、轻度毒性、中度毒性、重度毒性和死亡5个等级。

图4尾静脉注入转US基因的ADSCs后大体观察：A第一周观察动物反应灵敏，精神状态佳；B第四周观察动物活动自如，状态良好；C第四周大体解剖中腹腔未见腹水和粘连。

图5注入转US基因的ADSCs后病理切片取材：A肝切片未见异常；B脾切片未见异常；C心切片未见异常。

综合试验结果，判断转染US基因的脂肪源性干细胞为无毒性。

(2)裸鼠接种致瘤实验

健康成熟裸小鼠20只，随机分为4组。A组0.3ml的1×10⁶个/ml转染了pEGFP-N-US2和pEGFP-N-US3的脂肪源性干细胞注入背部皮下；B组0.3ml的1×10⁶个/ml转染了pEGFP-N-US2和pEGFP-N-US3的脂肪源性干细胞注入左腋下；C组0.3ml单纯培养基注入背部皮下；D组0.3ml单纯培养基注入背部皮下。

连续观察注射部位的是否有肿瘤生成的情况12w。12w断颈处死后取背部和腋下皮肤标本，4％多聚甲醛溶液固定24h，制作石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察。

图6接种致瘤实验大体观察：A接种后瞬时；B接种后1周，注射物吸收；C接种后12周，动物精神状态良好，背部和腋下未见肿块和异质物生成。

如图所示长时间观察结果表明，改型的脂肪源性干细胞无肿瘤生成趋势。

(3)致畸试验

30只怀孕10天的SD大鼠分成6组，尾静脉注射转染了相应液体，每只0.4ml。A组转染正常浓度组(1×10⁶个/ml)；B组转染高浓度组(0.5×10⁷个/ml)；C组转染超高浓度组(1×10⁷个/ml)；D组培养基对照组；E组未转染细胞对照组(1×10⁶个/ml)。于孕20天处死大鼠观察胎鼠有无流产、死胎、畸形的情况。

图7 SD大鼠致畸试验胎鼠检查图

表1 SD大鼠致畸试验统计表

注：每组试验动物为5只

试验统计结果提示改型的脂肪源性干细胞不对动物胎鼠产生明显的致畸、流产和死亡。

(4)皮肤刺激试验

新西兰大耳白兔背部脱毛后，暴露出皮肤4cm×8cm；于脊柱旁2cm处选3个注射点，点间距2cm，分别用转染脂肪源性干细胞1×10⁶个/ml、未转染的异体兔脂肪源性干细胞和单纯培养基在每侧皮内各注射1个点，注射量为0.2ml；于注射后6、24、48和72h观察皮肤反应情况。

试验动物注射改型的脂肪源性干细胞和单纯培养基组6、24、48和72h都未发现明显的红斑及水肿。而未转染的异体兔脂肪源性干细胞组则在24和48小时之间出现红肿，至72小时红肿有所减少的趋势，未出现坏死。

(5)发热试验

取健康成年新西兰大耳白兔5只，于注射转染细胞前测定兔基础体温(肛温)，每日2次，连续3d；自耳缘静脉按2ml/kg剂量，注射转染细胞1×10⁶个/ml；于注射后30min、8、24、48及72h测定体温；观察注射前后体温变化。

表2动物注射前后体温改变

试验结果统计表明注射前后动物体温波动在1.4℃以下可以认为浸提液中不含热源物质，符合要求。

(6)溶血试验

自耳缘静脉抽取正常兔血4ml，用2％草酸钾抗凝后，加入5ml生理盐水稀释，制得新鲜抗凝血9ml。取试管9只，分为3组，每组3支，作标记。阴性对照组3支试管中均加入2ml培养基作为阴性对照组；未转染异体兔脂肪源性干细胞对照组3支试管各加入2ml正常异体兔脂肪源性干细胞(1×10⁶个/ml)作为阳性对照；实验组3支试管各加入2ml转染后异体兔脂肪源性干细胞(1×10⁶个/ml)。将所有试管置于37℃水浴中维持30min，然后取出，加入0.2ml稀释新鲜兔血，缓慢混合，轻轻振动后，放置在37℃水浴中维持60min。1200转/min离心所有9只试管5min；取上清液100μl，置96孔板中，每管重复3孔，用酶标仪测定吸光度OD值(波长540nm)，取平均值，按下面公式计算溶血程度：测试物溶血程度(％)＝(试验组吸光度-阴性对照组光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100％，(按照标准，溶血度＜5％为合格)。

表3溶血试验各管吸收光值(OD值)

(二)动物体外试验

1、主要试剂及仪器

转染US基因的异体ADSCs      本实验室自制

正常的异体ADSCs            本实验室取材培养

MTT                        上海生物化学研究所

二甲基亚砜(DMSO)           重庆化学试剂总厂

AnnexinV及PI               ALEXIS

生理盐水                   西南药业，重庆

微量移液器                 Eppendorf，德国

流式细胞仪                 BD，美国

酶联免疫检测仪(MK3型)      Thermo，德国

2、方法

(1)转染前后脂肪源性干细胞生长增殖的影响

把获得的正常第六代和转染筛选后传两代脂肪源性干细胞的细胞悬液浓度调到5×10⁴个/ml，以每孔200ul的量接种于96孔酶标培养板中(每孔含1×10⁴个细胞)置5％CO2培养箱、37℃培养。连续培养一周，第三天和第五天换液。两组细胞每天各取三孔，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)继续培养4小时，吸去培养液，加入150ulDMSO，振荡10分钟使结晶物充分溶解后，在酶联免疫检测仪上选择492nm波长测定各孔光吸收值(OD)。以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制细胞生长曲线。对比rhBMP-2转染前后对ADSCs的影响情况。

图8转染前后脂肪源性干细胞生长增殖曲线图

转染后的脂肪源性干细胞生长增值速度有所降低，但与未转染细胞增值度无显著差异。

(2)转染前后脂肪源性干细胞凋亡试验

把获得的正常第六代和转染筛选后传两代脂肪源性干细胞的细胞悬液浓度调到5×10⁴个/ml，以每孔200ul的量接种于96孔酶标培养板中(每孔含1×10⁴个细胞)置5％CO2培养箱、37℃培养。于培养的第24、48、72h取出，加入10μl的AnnexinV(凋亡试剂盒产品)，置于暗盒中、37℃孵育30min；PBS洗涤3次×5min，加入20μl的PI(凋亡试剂盒产品)，反应10min；反应体系加生理盐水至1000μl，流式细胞法测定凋亡细胞的比例。

图9转染前后脂肪源性干细胞凋亡情况直方图

试验数据对比，转染前后脂肪源性干细胞凋亡程度(P＞0.05)在统计学上无明显差异。

四、动物对改建前后的异体脂肪源性干细胞免疫反应的实验研究

(一)主要试剂及仪器

转染US基因的异体ADSCs      本实验室自制

正常的异体ADSCs            本实验室取材培养

MTT                        上海生物化学研究所

二甲基亚砜(DMSO)           重庆化学试剂总厂

CD4+、CD8+、CD25+及阴性对  ANTIGENIX，美国

照单克隆一抗

FITC标记二抗               PIERCE，美国

HRP标记三抗                PIERCE，美国

通用型SP检测试剂盒         中杉金桥

多聚甲醛                   重庆化学试剂总厂

H.E.常规染色试剂           大坪医院野战外科研究所四室

不锈钢网100，300目         今日成套仪器公司，重庆

光学显微镜                 Olympus，日本

荧光显微镜               Leica，德国

微量移液器               Eppendorf，德国

流式细胞仪               BD，美国

酶联免疫检测仪(MK3型)    Thermo，德国

低温离心机               Beckman，美国

低速常温离心机           Sigma 2-5型，美国

(二)方法

1、全身的免疫反应

(1)外周血T淋巴细胞

组织器官移植免疫反应分为体液免疫和细胞免疫，而细胞免疫在移植排斥中起重要作用。辅助T细胞(CD4⁺)和抑制T细胞(CD8⁺)。它们在免疫排斥反应中分别主要起正向和负向调节作用，其数目及比例的变化往往代表了免疫功能的紊乱或器官移植时的排斥反应。CD25⁺分子的数量则反映T细胞活化的程度。因此外周血中三者最能反应免疫的改变情况。

分4个实验组，每组5只新西兰大耳白兔：A组转染后异体兔脂肪源性干细胞组；B组正常异体兔脂肪源性干细胞组；C组自体兔脂肪源性干细胞组；D组培养基组。自耳缘静脉按2ml/kg剂量，注射1×10⁶个/ml浓度的相应细胞。

注射1、2和4周后自兔耳缘静脉采集抗凝血2ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞；取100μl浓度为2×10⁶个/ml的细胞悬液置于4管中，分别加入抗CD4⁺、CD8⁺、CD25⁺分子和阴性对照一抗30μl，37℃孵育30min；2000转/min，离心10min，PBS洗涤3次×5min；去上清液，剩余液体及细胞约20μl，加入FITC标记二抗10μl，37℃孵育30min；2000转/min，离心10min，PBS洗涤3次×5min，加PBS缓冲液至1000μl；上机测定各阳性细胞占总淋巴细胞比例(激发波长为488nm)。

表4不同细胞注入后对外周血CD4⁺、CD8⁺、CD25⁺淋巴细胞改变影响表

通过上述试验数据的统计可以发现：转染后异体兔脂肪源性干细胞组、自体兔脂肪源性干细胞组和培养基组之间无明显差异(P＞0.05)；而正常异体兔脂肪源性干细胞组则CD4⁺、CD8⁺、CD25⁺T淋巴细胞不同程度的显著增高(P＜0.05)。

(2)脾细胞增殖反应

分4个实验组，每组5只新西兰大耳白兔：A组转染后异体兔脂肪源性干细胞组；B组正常异体兔脂肪源性干细胞组；C组自体兔脂肪源性干细胞组；D组培养基组。自耳缘静脉按2ml/kg剂量，注射1×10⁶个/ml浓度的相应细胞。

脾淋巴细胞悬液的制备：注射4周后将动物放血致死，立即无菌条件下取脾，用剪刀剔除结缔组织和脂肪并剪碎脾脏；在冰浴中，将碎脾组织置于平皿内不锈钢丝网上(80目，孔径0.28～0.15mm)，一手持网，另一手用注射器的针芯轻轻压挤脾组织，使单个核细胞经网孔入平皿内的Hanks液中，吸取Hanks液冲洗网上细胞；将细胞悬液再依次通过100目(孔径0.1mm)和300目(孔径0.04mm)的不锈钢丝网，以便形成单个细胞悬液；用红细胞裂解液破坏红细胞；再次用Hanks液洗涤，1200转/min，离心10min；用无血清的RPMI1640培养液重悬细胞，作细胞计数，调整细胞浓度在1×10^6-7个/ml，备用。

取上述各组脾细胞悬液100μl都加100μl培养基，完毕后混匀，在低温离心机上以2000转/min，离心5min；置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内培养4d；培养结束前4h，倾去培养液，加入15μl 5mg/ml的MTT液，混匀后继续培养4h；2000转/min，离心5min，倾去上清液，使残余液体量小于20μl；加入DMSO150μl，混匀后反应10min；以2000转/min，离心10min；吸取上清夜100μl，在酶标仪上测定吸光度OD值。

图10不同处理细胞注入对脾细胞增殖的对比影响

试验资料表明：转染后异体兔脂肪源性干细胞组、自体兔脂肪源性干细胞组和培养基组对兔脾细胞增殖无明显差异(P＞0.05)；而正常异体兔脂肪源性干细胞组脾细胞增殖有显著增高(P＜0.05)。

2、局部的免疫反应

(1)局部组织T淋巴细胞免疫组化观察

健康成熟SD大鼠20只，随机分为4组，每组5只动物：A组转染后异体兔脂肪源性干细胞组；B组正常异体兔脂肪源性干细胞组；C组自体兔脂肪源性干细胞组；D组培养基组。将0.5ml浓度为1×10⁶个/ml的各组细胞注入SD大鼠背部皮肤。

注射7天后，取局部组织的石蜡切片；3％H₂O₂室温孵育10min，消除内原性过氧化物酶活性；PBS洗涤5min×3次；10％正常山羊血清封闭，室温下15min；倾去血清，滴加30μl 1∶100的一抗(抗CD4⁺、CD8⁺、CD25⁺)，置湿盒中，4℃冰箱中过夜；PBS洗涤5min×3次；滴加30μl 1∶100的生物素标记的二抗，37℃孵育30min；PBS洗涤5min×3次；滴加30μl 1∶100的HRP标记的三抗，37℃孵育30min；PBS洗涤5min×3次；DAB显色3-10min，显微镜下观察；显色满意后自来水冲洗，终止反应；系列酒精脱水，二甲苯透明DPX封片，光镜下观察。

图11A转染后异体兔脂肪源性干细胞组，仅有少量阳性细胞；图11B正常异体兔脂肪源性干细胞组，可见大量阳性染色细胞。

对比二者可以发现，在局部T淋巴细胞反应上存在明显差别。转染后异体兔脂肪源性干细胞，不会引起强烈的局部T淋巴细胞反应。

(2)局部组织病理学观察

健康成熟SD大鼠20只，随机分为4组，每组5只动物：A组转染后异体兔脂肪源性干细胞组；B组正常异体兔脂肪源性干细胞组；C组自体兔脂肪源性干细胞组；D组培养基组。将0.5ml浓度为1×10⁶个/ml的各组细胞注入SD大鼠背部皮肤。

注射7天后，取局部组织的石蜡切片，HE染色，光镜下观察。

转染后异体兔脂肪源性干细胞组局部组织病理切片，组织周围没有明显的炎细胞存在；正常异体兔脂肪源性干细胞组局部组织病理切片，可见注射处组织有大量炎细胞浸润。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所

<120>用于医学组织工程的通用脂肪源性干细胞的制备方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>957

<212>DNA

<213>US2基因序列

<400>1

gattgtgacg tcagatccgc tagcgctacc ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat   60

tctgcagtcg acggtaccgc ggccaccatg aacaatctct ggaaagcctg ggtgggtctt  120

tggacctcca tgggtccctt gatccgcctg cccgatggaa tcactaaagc cggggaagac  180

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<210>2

<211>987

<212>DNA

<213>US3基因序列

<400>2

gtgcgtagtg acgtcagatc cgctagcgct accggactca gatctcgagc tcaagcttcg     60

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