癌症诊断套件以及癌症诊断方法

摘要

本发明提供一种癌症诊断套件及方法，使用将序列号1或3所示的碱基序列或其部分序列包含在内的多核苷酸、由序列号2或4所示的氨基酸序列或其部分序列所构成的多肽、或与由序列号2或4所示的氨基酸序列或其部分序列所构成的多肽进行特异性结合的抗体，来诊断癌症。由此找到在消化系统癌的检查、诊断或治疗中有用的CT抗原，从而开发出使用所述CT抗原的新型癌症诊断技术。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型癌症诊断技术，具体来讲，本发明涉及一种以CCDC62(Coiled-coil domain containing 62，卷曲结构域62)的表达或抗CCDC62抗体的存在作为指标的癌症诊断套件，以及癌症诊断方法。

背景技术

为了确立针对癌症的有效检查方法、诊断方法以及治疗方法，必须找到对于对象癌症以高频率表达并且抗原性强的癌抗原。但是，对于消化系统癌，特别是胃癌、大肠癌来说，在检查、诊断或治疗中有用的癌抗原少。因此，开发出在消化系统癌的检查、诊断或治疗中有用的癌抗原，是极为重要的。

在人类癌症的检查、诊断或治疗中，从副作用的观点来考虑，一般认为在多种癌症中有所表达、但在正常组织中仅局限于睾丸中的癌-睾丸抗原(Cancer-Testis抗原，以下称为“CT抗原”)是最有用的。迄今为止，已鉴定、报告了约40个CT抗原。但是，并不是这些CT抗原全部对癌症患者具有很强的免疫原性，因此有望用于癌症诊断、癌症检查的标记物，或癌症治疗的CT抗原很有局限性。

目前已报告的代表性CT抗原，可以举例为MAGE(参照非专利文献1)、SSX(参照非专利文献2)、NY-ESO-1(参照非专利文献3)。MAGE以及NY-ESO-1以欧美为中心进行了临床应用，也有获得了一定效果的报导例(例如，对于NY-ESO-1的临床应用，可参照非专利文献4)。这样一来，目前最有望用于癌症治疗等的CT抗原可以说是NY-ESO-1。

[非专利文献1]

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[非专利文献2]

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[非专利文献3]

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[非专利文献4]

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[非专利文献8]

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发明内容

但是，本发明人等调查了患有各种上皮肿瘤的患者对NY-ESO-1的抗体产生能力，结果膀胱癌为7％(9/124，参照非专利文献6)、前列腺癌为4.6％(10/218，参照非专利文献7)、乳腺癌为1.6％(1/62，参照非专利文献8)、食道癌为3.9％(2/51，参照非专利文献9)、肝癌为2.2％(2/92，参照非专利文献10)，无论对于哪一种癌症，抗体产生能力都不是那么高。像这样，以往所报告的CT抗原，在上皮肿瘤患者的血清中存在抗体的频率极低。

另外，以往所报告的CT抗原在胃癌或大肠癌等消化系统癌中有所表达的例子稀少，而且消化系统癌患者中产生抗体的频率也极少。例如已有报告，大肠癌患者对NY-ESO-1、MAGE、SSX的抗体产生能力均为0％(参照非专利文献5)。另外，本发明人等使用了58例大肠癌患者血清，来调查对NY-ESO-1的抗体产生能力，其结果为0％(未发表)。并且，在本发明人等使用胃癌患者血清来进行的预备性分析中，也没能证实对NY-ESO-1的抗体的存在。

这样一来，要找到在包括胃癌或大肠癌等消化系统癌的上皮肿瘤的诊断中有用的癌抗原并不容易，因此非常迫切地需要开发出在消化系统癌的诊断中有用的癌抗原。

本发明是鉴于所述问题而进行的，其目的在于提供一种新型癌症诊断技术，所述新型癌症诊断技术使用了在以消化系统癌为代表的上皮肿瘤的检查、诊断或治疗中有用的癌抗原(优选CT抗原)。

为了解决所述问题，本发明人等实施了使用源自正常睾丸的cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid，互补脱氧核糖核酸)文库与胃癌患者血清的SEREX(serological analysis of cancerantigens by recombinant cDNA expression cloning)，重组eDNA表达克隆癌抗原的血清学分析)法，发现阳性克隆中的CCDC62为CT抗原，从而完成了本发明。

也就是说，本发明所涉及的套件是用于诊断癌症的套件，其特征在于：具备了将序列号1或3所示的碱基序列或其部分序列包含在内的多核苷酸。

另外，本发明的套件是用于诊断癌症的套件，其特征在于：具备了由序列号2或4所示的氨基酸序列或其部分序列所构成的多肽。

此外，本发明的套件是用于诊断癌症的套件，其特征在于：具备了与由序列号2或4所示的氨基酸序列或其部分序列所构成的多肽，进行特异性结合的抗体。

所述本发明的套件优选用于诊断上皮肿瘤或皮肤癌，进一步优选用于诊断选自胃癌、大肠癌、乳腺癌、头颈部癌、肺癌、肾癌、前列腺癌以及恶性黑色素瘤中的至少一种。

本发明的癌症诊断方法，其特征在于包括多核苷酸测定步骤，所述多核苷酸测定步骤，是对存在于源自测试对象的样本中的，将序列号1或3所示的碱基序列或其部分序列包含在内的多核苷酸的水平，进行测定的步骤。

另外，本发明的癌症诊断方法，其特征在于包括多肽测定步骤，所述多肽测定步骤，是对存在于源自测试对象的样本中的，由序列号2或4所示的氨基酸序列或其部分序列所构成的多肽的水平，进行测定的步骤。

此外，本发明的癌症诊断方法，其特征在于包括抗体测定步骤，包括抗体测定步骤，所述抗体测定步骤，是对存在于源自测试对象的样本中的，与由序列号2或4所示的氨基酸序列或其部分序列所构成的多肽，进行特异性结合的抗体的水平，进行测定的步骤。

所述本发明的癌症诊断方法优选用于诊断上皮肿瘤或皮肤癌，进一步优选用于诊断选自胃癌、大肠癌、乳腺癌、头颈部癌、肺癌、肾癌、前列腺癌以及恶性黑色素瘤中的至少一种。

结合以下的叙述，能够充分地理解本发明的其他目的、特征以及优点。另外，通过参照附图进行的下述说明，能够更加明确本发明的优势。

附图说明

图1是表示SEREX法的概略情况的图。

图2是表示人体正常组织中的CCDC62 mRNA的表达分析结果的图。图2(a)表示RT-PCR的分析结果，图2(b)表示实时RT-PCR的分析结果。

图3是表示通过RT-PCR对各种癌组织中的CCDC62-2mRNA的表达进行分析的结果的图。图3(a)表示肺癌中的分析结果，图3(b)表示大肠癌中的分析结果，图3(c)表示前列腺癌中的分析结果。

图4是表示利用噬菌体斑分析法(bacteriophage plague assay)，对各种抗原与肺癌患者血清的反应性进行分析的结果的图。

图5是表示研究癌症患者对CCDC62-2蛋白质的体液免疫应答的结果的图。图5(a)表示使用ELISA法进行分析的结果，图5(b)表示使用蛋白质印迹法(western blotting)进行分析的结果。

具体实施方式

本发明人等使用特定的胃癌患者血清，针对源自正常睾丸的cDNA文库，实施了SEREX法处理。结果发现，阳性克隆为CCDC62表达克隆，且胃癌患者的血清中存在抗CCDC62抗体。也就是说，发现CCDC62为胃癌患者的癌抗原。通过进一步进行的CCDC62的表达分析，确认到：CCDC62在人体正常组织中，仅在睾丸中强烈表达，而在癌组织以及癌细胞株中得到了表达。根据这些见解，使用作为CT抗原的CCDC62，完成了本发明。

SEREX(serological analysis of cancer antigens by recombinantcDNA expression cloning，重组cDNA表达克隆癌抗原的血清学分析)法是从源自癌组织的cDNA表达文库中，鉴定存在于患者血清中的抗体所识别的抗原基因的方法(Sahin U，Tureci O，Schmitt H，Cochlovius B，Johannes T，Schmits R，Stenner F，Luo G，Schobert I，Pfreundschuh M.Human neoplasms elicit multiple specific immuneresponses in the autologous host.Proc Natl Acad Sci USA.1995 Dec5；92(25)：11810-3.)，众所周知其是优异的癌抗原筛选方法。但是，本发明是通过使用源自正常睾丸的cDNA文库，而非来源于自身的癌组织的cDNA文库方能实现。

如上所述，人类的CCDC62的序列是已知的，但关于CCDC62与疾病的相关性并无任何报告。CCDC62在癌症中的表达以及癌症患者血清中存在抗CCDC62抗体，是本发明人等首次发现的。

序列号1表示人类CCDC62基因的转录变异体1(transcriptvariant 1)的碱基序列，序列号2表示由人类CCDC62基因的转录变异体1所编码的蛋白质的氨基酸序列。另外，序列号3表示人类CCDC62基因的转录变异体2的碱基序列，序列号4表示由人类CCDC62基因的转录变异体2所编码的蛋白质的氨基酸序列。另外，人类CCDC62基因的碱基序列的转录变异体1作为NM_032573注册在GenBank(基因库)中，转录变异体2作为NM_201435注册在GenBank(基因库)中。

[1.癌症诊断方法]

本发明提供一种癌症诊断方法。在一个实施方式中，本发明的癌症诊断方法是通过对源自测试对象的样本中的CCDC62的表达水平进行测定，并将该水平与参照值(例如正常水平)进行比较来诊断癌症的方法。也就是说，本实施方式的癌症诊断方法包括多核苷酸测定步骤或多肽测定步骤。CCDC62的表达水平可以通过使用该领域中公知的方法，对转录产物(mRNA，messenger ribonucleicacid)量或翻译产物(蛋白质)量进行测定而确定。

另外，在另一实施方式中，本发明的癌症诊断方法是通过对源自测试对象的样本中的抗CCDC62抗体的水平进行测定，并将该水平与参照值(例如正常水平)进行比较来诊断癌症的方法。也就是说，本实施方式的癌症诊断方法包括抗体测定步骤。抗CCDC62抗体的水平，可以通过对源自测试对象的血清中的抗CCDC62抗体的水平进行测定而确定。

作为本发明癌症诊断方法的应用对象的测试对象没有特殊限制，广泛包括通常的动物，优选为人类。当测试对象为人类时，不仅癌症患者或癌症疑似患者可以成为测试对象，健康人也可以成为测试对象。

本发明的癌症诊断方法中使用的源自测试对象的样本只要是由测试对象所得(也就是说自测试对象分离所得)，即可，没有特殊限制。例如可以举例为：血液(血清、血浆、血球等)、尿、粪便、痰、腹水、腹腔洗液、活检组织、外科切除所得的样本等。

正常水平，是指正常健康个体(健康人)的CCDC62的mRNA的表达水平、CCDC62的蛋白质的表达水平、或抗CCDC62抗体的水平。正常水平，优选是使用与应比较的源自测试对象的样本(也就是说，本发明的多核苷酸测定步骤、多肽测定步骤或抗体测定步骤中使用的样本)相同的正常细胞、组织、体液作为样本进行测定所得到的。另外，进一步优选使用由正常健康个体所组成的集团的平均水平，作为正常水平。

在本说明书中，“诊断”，不仅是指“判定”，也包括“检查”、“检测”以及“预测”。也就是说，诊断癌症，是指判定或预测测试对象是否患有癌症、判定或预测癌症的发展程度、判定或预测治疗效果，进一步优选检查/检测/预测测试对象是否患有癌症、检查/检测/预测癌症发展程度、检查/检测/预测治疗效果。

另外，诊断对象的癌症的种类没有特殊限制，优选上皮肿瘤或皮肤癌。上皮肿瘤例如可以举例为胃癌、大肠癌、乳腺癌、头颈部癌、肺癌、肝癌、肾癌、卵巢上皮癌、前列腺癌等。另外，皮肤癌可以举例为恶性黑色素瘤。

(1)以mRNA水平作为指标的癌症诊断方法

在一个实施方式中，本发明的癌症诊断方法是使用源自测试对象的样本来诊断癌症的方法，只要包括对将序列号1或3所示的碱基序列或其部分序列包含在内的多核苷酸，在源自测试对象的样本中存在的水平进行测定的多核苷酸测定步骤即可。另外，多核苷酸包括DNA(Deoxyribonucleic Acid，脱氧核糖核酸)以及RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)两者。

在本实施方式中，只要在多核苷酸测定步骤中，测定CCDC62的mRNA水平即可。

测定mRNA水平的方法，只要是可以测定特定的mRNA水平的方法既可，没有特殊限制，可以从公知的方法中适当地选择使用。例如可以举例为使用含有下述多核苷酸的引物或探针的方法，所述多核苷酸包含CCDC62的mRNA或它们的cDNA的碱基序列或其互补序列的一部分，且与CCDC62的任一mRNA或cDNA进行部位特异性结合(杂交)。所述引物或探针只要与CCDC62的mRNA或其cDNA部位形成特异性碱基对即可，也可以是被施加了各种用来测定/检测mRNA的修饰的。

作为所述引物使用的多核苷酸，只要是基于序列号1或3所示的碱基序列或其互补序列设计的即可，没有特殊限制。例如可以举例为包含序列号5～8中的任一个所示的碱基序列所组成的多核苷酸。这些多核苷酸，是本发明人等实际实施RT-PCR(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction，逆转录-聚合酶链反应)时所使用的引物，已证实能够使CCDC62的cDNA进行特异性地扩增。作为所述探针而使用的多核苷酸，只要是基于序列号1或3所示的碱基序列设计的即可，没有特殊限制。另外，可以用作使目标mRNA(cDNA)特异性扩增的引物的多核苷酸，能够作为特异性地检测该mRNA(cDNA)的探针使用，这在该领域是众所周知的。

使用所述含有与mRNA或cDNA进行部位特异性结合的多核苷酸的引物或探针，测定mRNA的公知的方法，例如可以举例为：RT-PCR法、实时RT-PCR法、竞争性PCR法、in Situ杂交(原位杂交)法、in Situ PCR法(原位PCR法)、DNA阵列法(DNA array)等。

例如，所述RT-PCR法，是使用逆转录酶，利用由样本所制备的总RNA或mRNA来合成cDNA，并以该cDNA作为模板利用PCR将目标区域扩增的方法。此外，实时RT-PCR法，是在将cDNA作为模板对目标区域进行PCR扩增时，使用实时监控用试剂，对扩增产物的生成过程进行实时监控和分析的方法。实时监控试剂例如可举例为SYBR(注册商标：Molecular Probes公司)Green或TaqMan(注册商标：Applied Biosystems公司)探针等。

例如，所述DNA阵列法，是将CCDC62的cDNA或其片段固定在载持体载持体上，与从样本调制的mRNA或cDNA一起进行培养。此时，通过对所述mRNA或cDNA进行荧光标记等，可以检测固定在载持体上的DNA与从样本调制的mRNA或cDNA的杂交，从而测定样本中mRNA的水平。

在所述比较步骤中，只要将多核苷酸测定步骤中所测定的样本中的CCDC62的mRNA水平，与正常水平进行比较即可。如上文所述，正常水平优选的是使用与应比较的源自测试对象的样本(也就是说，本实施方式的多核苷酸测定步骤中使用的样本)相同的正常细胞、组织、体液作为样本，利用相同的方法测定所得。正常水平，可以通过在多核苷酸测定步骤的同时，对源自正常健康个体的样本进行测定而获得，也可以使用作为背景数据而存储的数据。当源自测试对象的样本中的mRNA水平高于正常水平时，可以判定测试对象患有癌症。高于正常水平的情况，优选为高于正常水平2倍的水平，更优选为高于正常水平3倍的水平。

(2)以蛋白质水平作为指标的癌症诊断方法

在一个实施方式中，本发明的癌症诊断方法，是使用源自测试对象的样本来诊断癌症的方法，且只要包括对由序列号2或4所示的氨基酸序列或其部分序列所构成的多肽，在源自测试对象的样本中存在的水平进行测定的多肽测定步骤即可。

在本实施方式中，只要在多肽测定步骤中测定CCDC62蛋白质的水平即可。

测定蛋白质的表达水平的方法，只要是可以测定特定的蛋白质水平的方法既可，没有特殊限制，可从公知的方法中适当地选择使用。例如可以举例为使用与CCDC62蛋白质进行特异性结合的抗体的方法。抗体既可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。另外，既可以是完全的抗体分子，也可以是能够进行特异性结合的抗体片段(例如Fab片段、F(ab′)₂片段等)。

使用抗体来测定蛋白质水平的公知的方法，例如可以举例为放射免疫分析法(RIA，RadioImmuno Assay)、ELISA法(EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay，酶联免疫分析法)、蛋白质印迹法(Western Blotting)、免疫沉淀法、免疫组织化学法、抗体阵列法等。这些方法中，从灵敏度好、简便考虑，优选ELISA法。

在所述比较步骤中，只要将多肽测定步骤中测定的样本中的CCDC62蛋白质的水平，与正常水平进行比较即可。像上文所述那样，正常水平优选的是使用与应比较的源自测试对象的样本(也就是说，本实施方式的多肽测定步骤中使用的样本)相同的正常细胞、组织、体液作为样本，利用相同方法测定所得。正常水平可以通过在多肽测定步骤的同时对源自正常健康个体的样本进行测定而获得，也可以使用作为背景数据而存储的数据。当源自测试对象的样本的蛋白质水平高于正常水平时，可以判定测试对象患有癌症。高于正常水平的情况，优选为高于正常水平2倍的水平，更优选为高于正常水平3倍的水平。

(3)以抗体水平作为指标的癌症诊断方法

在一个实施方式中，本发明的癌症诊断方法是使用源自测试对象的样本来诊断癌症的方法，只要包括对与由序列号2或4所示的氨基酸序列或其部分序列所构成的多肽进行特异性结合的抗体，在源自测试对象的样本中存在的水平，进行测定的抗体测定步骤即可。

在本实施方式中，只要在抗体测定步骤中对抗CCDC62抗体的水平进行测定即可。另外，测定抗CCDC62抗体的水平时所使用的样本优选血清，但只要是可以测定抗体水平的样本即可，没有特殊限制。

测定抗体水平的方法，只要是测定对特定抗原的抗体效价的水平的方法、或使用对目标抗体的抗体的方法即可，没有特殊限制，可以从公知的方法中适当地选择使用。例如可举例为使用作为抗原的CCDC62蛋白质的ELISA法、蛋白质阵列。抗体的效价测定所使用的抗原蛋白质可以由生物样本纯化而取得，优选作为重组蛋白质而取得。重组蛋白质，可以通过将插入了CCDC62基因的表达载体导入到宿主中并使其表达，进行纯化而取得。

在所述比较步骤中，只要将抗体测定步骤中测定的样本中的抗CCDC62抗体的水平与正常水平进行比较即可。正常水平可以通过在抗体测定步骤的同时，对源自正常健康个体的样本(优选血清)进行测定而获得，也可以使用作为背景数据而存储的数据。当源自测试对象的样本中的抗CCDC62抗体的水平高于正常水平时，可以判定测试对象患有癌症。高于正常水平的情况，优选为高于正常水平2倍的水平，更优选为高于正常水平3倍的水平。

[2.套件]

本发明提供一种用于诊断癌症的套件。本发明的套件只要具备实施所述诊断方法所需要的试剂或器具即可。在本说明书中，术语“套件”，是指具备了内含特定材料的容器(例如瓶、板、管、碟等)的包装。优选为具备使用各试剂或器具时所使用的指示说明。于本说明书中用于套件方面的情况下，“具有(具备)”是指构成套件的各容器的任一个中内含试剂等的状态。“指示说明”可以印刷在纸或其他媒体上，或也可以记录在磁带或计算机可读取的盘或带(tape)、CD-ROM等之类的电子媒体中。本发明的套件，也可以兼具用于诊断癌症所需要的试剂或器具。

在一个实施方式中，本发明的套件，可以是能够应用于以所述mRNA水平作为指标的癌症诊断方法中的套件。本实施方式的套件是用于使用源自测试对象的样本来诊断癌症的套件，且只要具备了将序列号1或3所示的碱基序列或其部分序列包含在内的多核苷酸即可。包含序列号1或3所示的碱基序列或其部分序列的多核苷酸，例如可以举例为测定CCDC62的mRNA而使用的引物、探针。本套件可以适合用于CCDC62的mRNA表达水平的测定。

本实施方式的套件，可以构成CCDC62的mRNA测定用的RT-PCR套件，或CCDC62的mRNA测定用的实时RT-PCR套件。另外，也可以构成用户能够任意选择RT-PCR或实时RT-PCR中的任一的套件。此时，本实施方式的套件只要具备用于利用RT-PCR来使CCDC62的mRNA扩增的引物套组即可，该引物组以外的套件的构成品没有特殊限制，例如优选的是具备用来由组织或细胞调制RNA的试剂、逆转录酶、逆转录反应中使用的缓冲液、耐热性DNA聚合酶、PCR用试剂、实时PCR用试剂、PCR用管、PCR用平板等。

在另一实施方式中，本发明的套件可以是能够应用于以所述蛋白质水平作为指标的癌症诊断方法中的套件。本实施方式的套件，是用于使用源自测试对象的样本来诊断癌症的套件，可以具备与由序列号2或4所示的氨基酸序列或其部分序列所构成的多肽进行特异性结合的抗体。本套件可以适合用于CCDC62蛋白质的水平测定。

在另一实施方式中，本发明的套件可以是能够用于以所述抗体水平作为指标的癌症诊断方法中的套件。本实施方式的套件是用于使用源自测试对象的样本来诊断癌症的套件，可以具备由序列号2或4所示的氨基酸序列或其部分序列所构成的多肽。此时，本实施方式的套件可以适合用于抗CCDC62抗体的效价水平的测定。另外，本实施方式的套件也可以具备对抗CCDC62抗体的抗体。制作此种抗体的技术在该领域中是周知的。

本实施方式的套件可以构成为ELISA用套件。此种套件优选的是，与CCDC62蛋白质进行特异性结合的抗体或CCDC62蛋白质，是以预先在ELISA用平板中固定(成为固相)的状态下包含在套件中。此外，若是具备已使与CCDC62蛋白质进行特异性结合的抗体成为固相的ELISA用平板和已使CCDC62蛋白质成为固相的ELISA用平板两者的套件，则可以形成能够测定CCDC62蛋白质的水平和抗CCDC62抗体的水平这两者的套件。

所述ELISA用平板以外的套件的构成品并无特别限定，例如优选的是具备已标记的二次抗体、显色用试剂、清洗用缓冲液等。

发明的详细说明中记载的具体实施方案以及实施例，不过是用于明确本发明的技术内容，不应被狭义理解为局限于这些具体实施方案以及实施例，在本发明的精神以及权利要求书的范围内，可以加以各种变更来进行实施。

此外，本说明书中记载的所有学术文献和专利文献，在本说明书中得以沿用，作为参考。

[实施例]

以下，使用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不限定于这些实施例。另外，核酸的提取、剪断、连结、大肠杆菌的转化、基因的碱基序列测序等通常的基因重组所需要的方法，只要没有特别记载，则基本上是依照各操作中使用的市售试剂、设备装置等随附的说明书，或实验书(例如“Molecular Cloning，a LaboratoryManual，3rd Ed(分子克隆实验指南(第三版)，Sambrook等人(2001)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社))”)而进行的。

[实施例1：利用SEREX法分析胃癌患者血清中的抗体所识别的抗原]

如图1的概略情况所示，SEREX法是从摘取自癌症患者的癌组织中直接提取mRNA而制作的cDNA表达文库中，使用癌症患者的血清来检索癌抗原的方法。在本实施例1中，为分离出在胃癌的诊断中有用的癌-睾丸抗原，而实施了使用源自正常睾丸的cDNA文库与胃癌患者血清的SEREX法。

(1)胃癌患者血清

从原发病灶与肝转移病灶均表现出缩小倾向的胃腺癌患者获得血清。另外，所选择的血清是事先确认了与源自正常睾丸的蛋白质组分剧烈反应的血清。利用TBS(Tris-Buffered Saline，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水)将血清稀释到10倍之后，使用E.coliY1090/Y1089的亲和层析柱(BioDynamics Lab Inc.，Tokyo)进行抗细菌抗体(对大肠杆菌以及噬菌体的非特异性抗体)的吸附处理。

(2)cDNA表达文库的制作

使用Quick Prep Micro mRNA purification kit(Stratagene，LaJolla，CA，USA)，从正常睾丸Total RNA(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA)纯化mRNA。由5μg的mRNA来合成cDNA，重组到γZAP Express vector(Stratagene)上而包装成为噬菌体，制作cDNA表达文库。

(3)正常睾丸cDNA文库的免疫筛选

在每个150mm平板上播撒约4,000个噬菌体，培养6～8小时。将经IPTG(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导的蛋白质转录到直径为135mm的硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell，Dassel，Germany)上后，与吸附了抗细菌抗体的胃癌患者血清(用TBS稀释到200倍)进一步反应15小时，利用过氧化物酶标记的抗人类IgG抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pa.，USA)进行检测。此时，为了除去源自抗体产生细胞的IgG克隆，事先仅利用二次抗体来处理膜。分离阳性克隆，分别使用直径为82mm或47mm的膜进行2次、3次筛选，而成为单克隆。

(4)插入cDNA的碱基序列的测定

通过体内切除(in vivo excision)使阳性克隆成为pBK-CMV质体之后，对插入cDNA的碱基序列(ABI PRISM R310 GeneticAnalyzer；PE Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行分析，而进行利用基因数据库(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)的同源性检索。

(5)结果

筛选约20万个克隆，分离出表1所示的55个阳性克隆。

[表1]

利用SEREX法鉴定出的抗原基因

同源性检索的结果为，鉴定出23种基因(OY-ST-1～23)。这些基因中，根据利用数据库的正常组织表达的检索得知，4种基因具有睾丸特异性(表1)。关于其他19种基因，是在正常组织中广泛地表达，或无法获得是否表达的数据。

作为睾丸特异性表达的基因，获得了2克隆的OY-ST-3(Gkinase anchoring protein 1(GKAP1)，G激酶锚定蛋白1)。关于GKAP1，本发明人等目前正在专利申请中(目前尚未公开)。另外，获得了1克隆的OY-ST-6(synaptonemal complex protein 1，SYCP1(SCP-1)，联会复合体蛋白1)。SCP-1(OY-ST-6)是开发出SEREX法的初期发现的代表性癌-睾丸抗原(CT抗原)之一，已知其免疫原性较弱(Tureci，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998)。

分离出了2克隆的OY-ST-18，同源性检索的结果为CCDC62(coiled-coil domain containing 62，卷曲结构域62)，但各克隆分别为转录变异体1(CCDC62-1，NM_032573：序列号1)以及转录变异体2(CCDC62-2，NM_201435：序列号3)。另外，并无CCDC62与人类癌症等的疾病有关的报告。

[实施例2：CCDC62的表达分析]

利用DNA合成机，合成

C62-1-S(sense：5′-TCCCCGGCAAGTGAGCTAAT-3′，序列号5)以及

C62-1-AS(antisense：5′-ATACATCCCCATTCCCGAGG-3′，序列号6)

来作为CCDC62(变异体1)特异性引物，且合成

C62-2-S(sense：5′-AAGTCAGAGGTCCCAGAAGA-3′，序列号7)以及

C62-2-AS(antisense：5′-CTATGCAGGGGTTCTTTCTC-3′，序列号8)来作为CCDC62(变异体2)特异性引物。利用RT-PCR来使源自人体正常组织的cDNA(MTC panel，BD BiosciencesClontech)以及源自各种癌症的cDNA扩增，对基因的表达进行了分析。

癌组织，使用了通过手术或活查而获得的组织。另外，实施例1以及2中使用的源自癌症患者或健康人的样本，全部是事先由主治医师以口头及书面形式直接向提供者进行了说明，并获得了知情同意(informed consent)后所得的样本。源自癌患者或健康人的样本，是进行了匿名处理而严密保护个人信息后用于研究的。该研究的内容以及知情同意所用的说明文件和同意文件受到冈山大学大学院医齿药学研究科“人类基因组/基因分析研究”伦理委员会的承认。

癌细胞株，使用了11种肺癌细胞株、8种恶性黑色素瘤细胞株以及3种前列腺癌细胞株。恶性黑色素瘤细胞株是由美国斯隆-凯特琳(Sloan-Kettering)癌症研究所构建的，本发明人等自该研究所获取恶性黑色素瘤细胞株。此外的细胞株是癌症研究中普遍使用的细胞株，通常可以从众所周知的细胞保存机关等获取。

关于癌组织以及癌细胞株，分别提取总RNA(RNeasy；Qiagen，Hilden，Germany)，利用MMLV逆转录酶和oligo(DT)₁₅引物来合成cDNA(Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads；AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)。关于CCDC62的RT-PCR，是进行35个循环的处理的，每循环包括在94℃下变性1分钟、在60℃下退火1分钟、以及在72℃下延伸1.5分钟。利用琼脂糖凝胶电泳来分析PCR产物。对所合成的cDNA同时确认到G3PDH基因的扩增。

关于CCDC62-1 mRNA以及CCDC62-2 mRNA，使用CCDC62-1特异性引物或CCDC62-2特异性引物来分析14种正常组织中的表达。结果，仅在睾丸中确认到强烈的表达(图2(a))。另外，利用实时RT-PCR法对人体正常组织中的CDCC62基因的表达进行定量分析。cDNA是利用随机引物，由2μg的总RNA所合成的(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，AppliedBiosystems，Foster City，CA)。使用CCDC62特异性TaqMan探针(TaqMan Gene Expression Assays，Applied Biosystems)，利用ABIPRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems)进行了定量分析。所使用的TaqMan探针是对CCDC62的两种剪切变异体(CCDC62-1以及CCDC62-2)中共同的序列具有特异性的探针(AssayID：Hs00261486)。使用G3PDH作为内因性参照物(TaqManPre-Developed Assay Reagents，Applied Biosystems)。作为校准的方法，CCDC62的表达是以相对于用作校准物的正常睾丸的表达之比来表示的。在睾丸中确认到强烈的表达，该表达与同样进行分析的作为代表性CT抗原的NY-ESO-1相同(图2(b))。

对各种癌组织中的CCDC62-1 mRNA以及CCDC62-2 mRNA的表达进行分析，结果确认不到CCDC62-1的表达。关于CCDC62-2，使用特异性引物且利用RT-PCR法对各种癌组织中的表达进行分析，其结果示于表2。

[表2]

癌组织以及细胞株中的CCDC62-2 mRNA的表达(RT-PCR法)

在口腔癌、食道癌、胃癌、乳腺癌、大肠癌、肺癌、前列腺癌、肾癌中，观察到CCDC62-2 mRNA的表达(图3)。特别是在胃癌中确认到8/117(7％)的表达，在肺癌中确认到5/19(26％)的表达，在前列腺癌中确认到3/9(33％)的表达。另外，在源自肺癌以及前列腺癌的癌细胞株中，也确认到表达。并且，在恶性黑色素瘤中确认到3/8(38％)的高表达。

[实施例3：肺癌患者血清对于SEREX鉴定抗原的反应性]

利用噬菌体斑分析法对CCDC62-1、CCDC62-2以及另一种已鉴定的CT抗原GKAP1克隆与肺癌患者血清的反应性进行了分析(图4)。

[表3]

肺癌患者血清对各种抗原的反应性

所调查的29人的肺癌患者血清中，4人对于CCDC62-2呈阳性。并且，2人对于GKAP1呈阳性。所有的患者血清与CCDC62-1均未反应(表3)。另外，这些抗原与所调查的7个健康人的血清完全未发生反应。

[实施例4：癌症患者对CCDC62-2蛋白质的体液免疫应答的分析]

将CCDC62-2蛋白质的C-末端(氨基酸残基366～684)编码的cDNA导入到pGEX-6P-1表达载体中。将其转化为大肠杆菌BL21株。使用GSTrap FF柱(Amersham Biosciences)对经IPTG诱导所得的GST融合CCDC62-2蛋白质进行了纯化。

利用ELISA法来分析癌症患者对CCDC62-2的体液免疫应答(图5(a))。具体来说，使GST融合重组CCDC62-2蛋白质(1μg/ml)吸附在96well(孔)平板上(100ng/well)，用5％的FCS/PBS封闭(blocking)1小时后，添加血清(100μl)反应2小时。清洗平板后，与过氧化物酶标记抗人类IgG抗体(JacksonImmunoResearch)反应1小时。利用底物(1，2-phenylenediaminedihydrochlolide，邻苯二胺盐酸盐)进行显色之后，对191个癌症患者的血清以及41个健康人的血清测定了吸光度。利用400倍稀释血清来评价抗体效价，将健康人的OD值(490nm)平均值的4SD(Standard Deviation，标准偏差)以上评价为阳性。其结果示于表4。

[表4]

癌症患者血清中的CCDC62-2特异性IgG抗体的检测(ELISA分析)

191人中13人(6.8％)为抗体阳性。所研究的41个健康人全部为阴性。104个胃癌患者中6人(5.8％)为抗体阳性，76个肺癌患者人中5人(6.6％)为抗体阳性，11个大肠癌患者人中2人(18％)为抗体阳性。

利用蛋白质印迹法(western blotting)对胃癌及肺癌患者血清进行研究(图5(b))。具体来说，利用SDS-PAGE分离出重组CCDC62-2蛋白质之后，转录到硝酸纤维素膜上，使其与稀释到100倍的ELISA阳性及阴性癌症患者血清进行反应。通过使用过氧化物酶标记抗人类IgG抗体(Jackson Immuno Research)来检测反应后的蛋白质，而分析血清中抗体是否对CCDC62-2蛋白质具有特异性。结果确认到ELISA阳性患者血清中的抗体对CCDC62-2蛋白质具有特异性。

根据本发明，可以提供一种使用在胃癌、大肠癌等消化系统癌的诊断中有效的CT抗原的新型癌症诊断套件以及癌症诊断方法。该CT抗原并不限定于用于诊断消化系统癌，也可以有效地用于诊断乳腺癌、头颈部癌、肺癌、肾癌、前列腺癌等其他上皮肿瘤或恶性黑色素瘤等皮肤癌。

发明的详细说明中记载的具体实施方式以及实施例，不过是用于明确本发明的技术内容，不应被狭义理解为局限于这些具体实施方案以及实施例，在本发明的精神以及权利要求书的范围内，可以加以各种变更来进行实施。

[产业上的可利用性]

本发明可以提供一种用于癌症的检查或诊断(癌症的存在有无、癌症的发展程度、或癌症患者的预后判定等)、癌症预防或癌症治疗(例如癌症疫苗)等的癌抗原基因、载体、蛋白质、抗体、细胞毒性T细胞(CTL，cytotoxic T lymphocyte)等的群体。通过单独或组合使用这些物质，或作为套件使用，能够判断癌症的恶性程度、癌症的组织型、治疗效果或预后。通过使用CCDC62，能够进行高精度的癌症的检查或诊断。并且，与本发明人等已鉴定的CT抗原(例如OY-TES-1、RFX4、AKAP3、XAGE-1、GKAP1)组合使用，可以应用于更广泛的癌症种类中。

本发明用于诊断癌症，不仅有助于以癌症为对象的医学、医疗的发展，而且可以用于临床检查用试剂产业、试剂产业、医疗设备产业等中。

序列表

 

<110>国立大学法人冈山大学

<120>癌症诊断套件以及癌症诊断方法

 

<130>0U0827

 

<150>JP 2007-236048

<151>2007-09-12

 

<160>8

 

<170>PatentIn Ver.2.1

 

<210>1

<211>2481

<212>DNA

<213>human

 

<400>1

ggttggagta cggggcgggg gtcggccgag ggcgcggggc cccggggctc cgggctcgcc 60

cccgccgctc ggggcaggcg cgccgatggc gtttctgagg tgacgccgcc cacaccgggc 120

ttctccgggg gcggaggaaa cacctatgaa ccctccggca gccttccttg ccgggcgcca 180

gaacatcggg tcagaagttg agatttccac tatcgagaaa caacggaagg agctgcagtt 240

gctcattgga gaattaaaag atcgagataa agagctcaat gacatggttg cagtgcacca 300

gcaacagctt ctttcatggg aagaggatcg gcagaaagtg ttgacactgg aagaacgttg 360

cagcaaatta gaaggtgaac tacataaaag aactgaaata atcaggtcac tcacgaagaa 420

ggtaaaagct cttgaatcca atcaaatgga atgccaaaca gctctccaaa agacccaact 480

acagcttcag gaaatggctc aaaaggcaac gcattcttct cttctctctg aagaccttga 540

ggctagaaac gaaactctca gcaacacgtt agtggaactt tctgcccagg taggacagct 600

acaagctcga gaacaagctc ttacgacaat gataaagcta aaggacaaag atattattga 660

ggcagttaat cacattgcag attgttcggg taaatttaaa atgctagagc atgccctacg 720

tgatgccaag atggcggaga cttgtattgt gaaagaaaag caagattata agcagaaatt 780

gaaggcactt aagattgaag tcaacaaact aaaagaggac ctcaatgaaa agacgacaga 840

aaataatgag caacgagaag agatcattcg cctcaagcaa gagaaaagtt gcctgcacga 900

tgaattgctt tttactgtag agagagaaaa gaggaaagat gaattgctta atattgcgaa 960

gtcaaagcaa gaacgcacaa attcagaact gcacaatctg agacagattt atgtaaaaca 1020

acagagtgat ctgcagtttc ttaatttcaa tgtggaaaat tctcaggaat taatacagat 1080

gtatgactca aagatggagg aatcaaaggc tctggactcc agcagagaca tgtgtttatc 1140

agaccttgaa aataaccacc caaaagtcga tattaagagg gaaaaaaatc agaagtcact 1200

gtttaaggac cagaaatttg aagccatgtt ggttcagcaa aataggtcag acaagagctc 1260

ttgcgatgaa tgcaaagaga agaaacaaca gatcgatact gtgtttgggg agaaaagtgt 1320

aattacgctg tcatccatat tcaccaaaga cttagtagag aaacacaacc tcccttggtc 1380

tctgggagga aaaacccaga ttgaacccga aaacaaaatt acattgtgca agatccacac 1440

aaaatcacca aaatgtcatg gcactggggt tcagaacgaa ggaaaacaac cctcagaaac 1500

acccacttta tctgatgaga agcagtggca tgatgtcagt gtttacctgg gcctgaccaa 1560

ctgtccaagt tcaaaacatc cagaaaagct ggatgtagaa tgtcaagatc agatggaaag 1620

gtccgaaatc tcatgctgcc agaaaaatga agcctgtctg ggcgaaagtg gcatgtgtga 1680

ctccaagtgc tgccacccga gtaacttcat aattgaagcc ccaggccaca tgtctgacgt 1740

ggagtggatg agtattttca agccttccaa aatgcagaga attgtccgcc tcaaatctgg 1800

gtgcacctgt tcagaaagca tctgtggcac acaacatgac tccccggcaa gtgagctaat 1860

tgccatccaa gattcccact ctttgggttc ttcaaaatct gccttgagag aagatgagac 1920

ggagtcctct tccaataaaa agaactcacc tacgagtttg ttaatctaca aagatgcacc 1980

agcattcaat gaaaaggctt caattgtgtt accctcccag gatgatttct cgcccacgag 2040

caagctccag cgtttgctgg cggaatctcg tcagatggtg acggacctgg agctgagcac 2100

actgctgccc atcagccatg agaatctcac tggcagtgcc acaaatattt ctcatctatg 2160

tggaaggcag aaagcagaca ccaatactga atgaatactt aaccgtaaaa ctgaaagagg 2220

attctagttc ttcataaacg gcacttaatt ccagctggga gcagaactag aaagttaatt 2280

tttaaacatc tacacttcat tttcaagtta accatttttg tgctgaagaa atattttcat 2340

gtgagtaaaa taaggaagga acgttcatca ctttaaactg aacctggcaa gttaatttcc 2400

tcgggaatgg ggatgtattt ttttaagcat tgcagatatc aaagttctat tgtgctgaat 2460

aaatgcccct ttgttaacag g                                           2481

 

<210>2

<211>682

<212>PRT

<213>human

 

<400>2

Met Asn Pro Pro Ala Ala Phe Leu Ala Gly Arg Gln Asn Ile Gly Ser

  1               5                  10                  15

Glu Val Glu Ile Ser Thr Ile Glu Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gln Leu

             20                  25                  30

Leu Ile Gly Glu Leu Lys Asp Arg Asp Lys Glu Leu Asn Asp Met Val

         35                  40                  45

Ala Val His Gln Gln Gln Leu Leu Ser Trp Glu Glu Asp Arg Gln Lys

     50                  55                  60

Val Leu Thr Leu Glu Glu Arg Cys Ser Lys Leu Glu Gly Glu Leu His

65                  70                  75                  80

Lys Arg Thr Glu Ile Ile Arg Ser Leu Thr Lys Lys Val Lys Ala Leu

                 85                  90                  95

Glu Ser Asn Gln Met Glu Cys Gln Thr Ala Leu Gln Lys Thr Gln Leu

            100                 105                 110

Gln Leu Gln Glu Met Ala Gln Lys Ala Thr His Ser Ser Leu Leu Ser

        115                 120                 125

Glu Asp Leu Glu Ala Arg Asn Glu Thr Leu Ser Asn Thr Leu Val Glu

    130                 135                 140

Leu Ser Ala Gln Val Gly Gln Leu Gln Ala Arg Glu Gln Ala Leu Thr

145                 150                 155                 160

Thr Met Ile Lys Leu Lys Asp Lys Asp Ile Ile Glu Ala Val Asn His

                165                 170                 175

Ile Ala Asp Cys Ser Gly Lys Phe Lys Met Leu Glu His Ala Leu Arg

            180                 185                 190

Asp Ala Lys Met Ala Glu Thr Cys Ile Val Lys Glu Lys Gln Asp Tyr

        195                 200                 205

Lys Gln Lys Leu Lys Ala Leu Lys Ile Glu Val Asn Lys Leu Lys Glu

    210                 215                 220

Asp Leu Asn Glu Lys Thr Thr Glu Asn Asn Glu Gln Arg Glu Glu Ile

225                 230                 235                 240

Ile Arg Leu Lys Gln Glu Lys Ser Cys Leu His Asp Glu Leu Leu Phe

                245                 250                 255

Thr Val Glu Arg Glu Lys Arg Lys Asp Glu Leu Leu Asn Ile Ala Lys

            260                 265                 270

Ser Lys Gln Glu Arg Thr Asn Ser Glu Leu His Asn Leu Arg Gln Ile

        275                 280                 285

Tyr Val Lys Gln Gln Ser Asp Leu Gln Phe Leu Asn Phe Asn Val Glu

    290                 295                 300

Asn Ser Gln Glu Leu Ile Gln Met Tyr Asp Ser Lys Met Glu Glu Ser

305                 310                 315                 320

Lys Ala Leu Asp Ser Ser Arg Asp Met Cys Leu Ser Asp Leu Glu Asn

                325                 330                 335

Asn His Pro Lys Val Asp Ile Lys Arg Glu Lys Asn Gln Lys Ser Leu

            340                 345                 350

Phe Lys Asp Gln Lys Phe Glu Ala Met Leu Val Gln Gln Asn Arg Ser

        355                 360                 365

Asp Lys Ser Ser Cys Asp Glu Cys Lys Glu Lys Lys Gln Gln Ile Asp

    370                 375                 380

Thr Val Phe Gly Glu Lys Ser Val Ile Thr Leu Ser Ser Ile Phe Thr

385                 390                 395                 400

Lys Asp Leu Val Glu Lys His Asn Leu Pro Trp Ser Leu Gly Gly Lys

                405                 410                 415

Thr Gln Ile Glu Pro Glu Asn Lys Ile Thr Leu Cys Lys Ile His Thr

            420                 425                 430

Lys Ser Pro Lys Cys His Gly Thr Gly Val Gln Asn Glu Gly Lys Gln

        435                 440                 445

Pro Ser Glu Thr Pro Thr Leu Ser Asp Glu Lys Gln Trp His Asp Val

    450                 455                 460

Ser Val Tyr Leu Gly Leu Thr Asn Cys Pro Ser Ser Lys His Pro Glu

465                 470                 475                 480

Lys Leu Asp Val Glu Cys Gln Asp Gln Met Glu Arg Ser Glu Ile Ser

                485                 490                 495

Cys Cys Gln Lys Asn Glu Ala Cys Leu Gly Glu Ser Gly Met Cys Asp

            500                 505                 510

Ser Lys Cys Cys His Pro Ser Asn Phe Ile Ile Glu Ala Pro Gly His

        515                 520                 525

Met Ser Asp Val Glu Trp Met Ser Ile Phe Lys Pro Ser Lys Met Gln

    530                 535                 540

Arg Ile Val Arg Leu Lys Ser Gly Cys Thr Cys Ser Glu Ser Ile Cys

545                 550                 555                 560

Gly Thr Gln His Asp Ser Pro Ala Ser Glu Leu Ile Ala Ile Gln Asp

                565                 570                 575

Ser His Ser Leu Gly Ser Ser Lys Ser Ala Leu Arg Glu Asp Glu Thr

            580                 585                 590

Glu Ser Ser Ser Asn Lys Lys Asn Ser Pro Thr Ser Leu Leu Ile Tyr

        595                 600                 605

Lys Asp Ala Pro Ala Phe Asn Glu Lys Ala Ser Ile Val Leu Pro Ser

    610                 615                 620

Gln Asp Asp Phe Ser Pro Thr Ser Lys Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu

625                 630                 635                 640

Ser Arg Gln Met Val Thr Asp Leu Glu Leu Ser Thr Leu Leu Pro Ile

                645                 650                 655

Ser His Glu Asn Leu Thr Gly Ser Ala Thr Asn Ile Ser His Leu Cys

            660                 665                 670

Gly Arg Gln Lys Ala Asp Thr Asn Thr Glu

        675                 680

 

<210>3

<211>3044

<212>DNA

<213>human

 

<400>3

ggttggagta cggggcgggg gtcggccgag ggcgcggggc cccggggctc cgggctcgcc 60

cccgccgctc ggggcaggcg cgccgatggc gtttctgagg tgacgccgcc cacaccgggc 120

ttctccgggg gcggaggaaa cacctatgaa ccctccggca gccttccttg ccgggcgcca 180

gaacatcggg tcagaagttg agatttccac tatcgagaaa caacggaagg agctgcagtt 240

gctcattgga gaattaaaag atcgagataa agagctcaat gacatggttg cagtgcacca 300

gcaacagctt ctttcatggg aagaggatcg gcagaaagtg ttgacactgg aagaacgttg 360

cagcaaatta gaaggtgaac tacataaaag aactgaaata atcaggtcac tcacgaagaa 420

ggtaaaagct cttgaatcca atcaaatgga atgccaaaca gctctccaaa agacccaact 480

acagcttcag gaaatggctc aaaaggcaac gcattcttct cttctctctg aagaccttga 540

ggctagaaac gaaactctca gcaacacgtt agtggaactt tctgcccagg taggacagct 600

acaagctcga gaacaagctc ttacgacaat gataaagcta aaggacaaag atattattga 660

ggcagttaat cacattgcag attgttcggg taaatttaaa atgctagagc atgccctacg 720

tgatgccaag atggcggaga cttgtattgt gaaagaaaag caagattata agcagaaatt 780

gaaggcactt aagattgaag tcaacaaact aaaagaggac ctcaatgaaa agacgacaga 840

aaataatgag caacgagaag agatcattcg cctcaagcaa gagaaaagtt gcctgcacga 900

tgaattgctt tttactgtag agagagaaaa gaggaaagat gaattgctta atattgcgaa 960

gtcaaagcaa gaacgcacaa attcagaact gcacaatctg agacagattt atgtaaaaca 1020

acagagtgat ctgcagtttc ttaatttcaa tgtggaaaat tctcaggaat taatacagat 1080

gtatgactca aagatggagg aatcaaaggc tctggactcc agcagagaca tgtgtttatc 1140

agaccttgaa aataaccacc caaaagtcga tattaagagg gaaaaaaatc agaagtcact 1200

gtttaaggac cagaaatttg aagccatgtt ggttcagcaa aataggtcag acaagagctc 1260

ttgcgatgaa tgcaaagaga agaaacaaca gatcgatact gtgtttgggg agaaaagtgt 1320

aattacgctg tcatccatat tcaccaaaga cttagtagag aaacacaacc tcccttggtc 1380

tctgggagga aaaacccaga ttgaacccga aaacaaaatt acattgtgca agatccacac 1440

aaaatcacca aaatgtcatg gcactggggt tcagaacgaa ggaaaacaac cctcagaaac 1500

acccacttta tctgatgaga agcagtggca tgatgtcagt gtttacctgg gcctgaccaa 1560

ctgtccaagt tcaaaacatc cagaaaagct ggatgtagaa tgtcaagatc agatggaaag 1620

gtccgaaatc tcatgctgcc agaaaaatga agcctgtctg ggcgaaagtg gcatgtgtga 1680

ctccaagtgc tgccacccga gtaacttcat aattgaagcc ccaggccaca tgtctgacgt 1740

ggagtggatg agtattttca agccttccaa aatgcagaga attgtccgcc tcaaatctgg 1800

gtgcacctgt tcagaaagca tctgtggcac acaacatgac tccccggcaa gtgagctaat 1860

tgccatccaa gattcccact ctttgggttc ttcaaaatct gccttgagag aagatgagac 1920

ggagtcctct tccaataaaa agaactcacc tacgagtttg ttaatctaca aagatgcacc 1980

agcattcaat gaaaaggctt caattgtgtt accctcccag gatgatttct cgcccacgag 2040

caagctccag cgtttgctgg cggaatctcg tcagatggtg acggacctgg agctgagcac 2100

actgctgccc atcagccatg agaatctcac tggcagtgcc acaaataagt cagaggtccc 2160

agaagagtca gctcaaaaaa atacctttgt cagttattga aggaaacaaa aggcaacttc 2220

agtattcatc gtgatcacga atttctcatc tatgtggaag gcagaaagca gacaccaata 2280

ctgaatgaat acttaaccgt aaaactgaaa gaggattcta gttcttcata aacggcactt 2340

aattccagct gggagcagaa ctagaaagtt aatttttaaa catctacact tcattttcaa 2400

gttaaccatt tttgtgctga agaaatattt tcatgtgtaa gaaagtagac cttattgtac 2460

atatagaaag ttggaattat gctaagaatg aaaaagactt ctctgtaaag atacggacta 2520

cagttaaatg ctagagaagc tctttaaaaa tgtgaatgtc aaatagagaa agaacccctg 2580

catagaaagt gctgttttaa ctatctgatt tttaaaaaat ctgtgcatac atttaaattc 2640

taaacaatag cttatcagag tcagctcaaa atatatgaga aacagtattc tctcatggtt 2700

ttagcttttg actttgctgt gtaaatagac ataaggtgct ttgatataaa atataaaatg 2760

taactggaaa atagctcgag gtccttctgt cccaagctga gcagagcccc atctttctgg 2820

gtctatatta gtcccaccta ctgacacaaa caaaagcttg ctggaagatc gagttttaga 2880

cgcattttta aaaatcttaa agactaaaac acttccattt taacttgtaa agtaatttaa 2940

ttttttaaag attatactat atgcctctgt gtcttctcta aaagaataga tcaacttcag 3000

tccataaaag atatttttaa tattaaagaa aaaaaaaaaa aaaa                  3044

 

<210>4

<211>684

<212>PRT

<213>human

 

<400>4

Met Asn Pro Pro Ala Ala Phe Leu Ala Gly Arg Gln Asn Ile Gly Ser

  1               5                  10                  15

Glu Val Glu Ile Ser Thr Ile Glu Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gln Leu

             20                  25                  30

Leu Ile Gly Glu Leu Lys Asp Arg Asp Lys Glu Leu Asn Asp Met Val

         35                  40                  45

Ala Val His Gln Gln Gln Leu Leu Ser Trp Glu Glu Asp Arg Gln Lys

     50                  55                  60

Val Leu Thr Leu Glu Glu Arg Cys Ser Lys Leu Glu Gly Glu Leu His

 65                  70                  75                  80

Lys Arg Thr Glu Ile Ile Arg Ser Leu Thr Lys Lys Val Lys Ala Leu

                 85                  90                  95

Glu Ser Asn Gln Met Glu Cys Gln Thr Ala Leu Gln Lys Thr Gln Leu

            100                 105                 110

Gln Leu Gln Glu Met Ala Gln Lys Ala Thr His Ser Ser Leu Leu Ser

        115                 120                 125

Glu Asp Leu Glu Ala Arg Asn Glu Thr Leu Ser Asn Thr Leu Val Glu

    130                 135                 140

Leu Ser Ala Gln Val Gly Gln Leu Gln Ala Arg Glu Gln Ala Leu Thr

145                 150                 155                 160

Thr Met Ile Lys Leu Lys Asp Lys Asp Ile Ile Glu Ala Val Asn His

                165                 170                 175

Ile Ala Asp Cys Ser Gly Lys Phe Lys Met Leu Glu His Ala Leu Arg

            180                 185                 190

Asp Ala Lys Met Ala Glu Thr Cys Ile Val Lys Glu Lys Gln Asp Tyr

        195                 200                 205

Lys Gln Lys Leu Lys Ala Leu Lys Ile Glu Val Asn Lys Leu Lys Glu

    210                 215                 220

Asp Leu Asn Glu Lys Thr Thr Glu Asn Asn Glu Gln Arg Glu Glu Ile

225                 230                 235                 240

Ile Arg Leu Lys Gln Glu Lys Ser Cys Leu His Asp Glu Leu Leu Phe

                245                 250                 255

Thr Val Glu Arg Glu Lys Arg Lys Asp Glu Leu Leu Asn Ile Ala Lys

            260                 265                 270

Ser Lys Gln Glu Arg Thr Asn Ser Glu Leu His Asn Leu Arg Gln Ile

        275                 280                 285

Tyr Val Lys Gln Gln Ser Asp Leu Gln Phe Leu Asn Phe Asn Val Glu

    290                 295                 300

Asn Ser Gln Glu Leu Ile Gln Met Tyr Asp Ser Lys Met Glu Glu Ser

305                 310                 315                 320

Lys Ala Leu Asp Ser Ser Arg Asp Met Cys Leu Ser Asp Leu Glu Asn

                325                 330                 335

Asn His Pro Lys Val Asp Ile Lys Arg Glu Lys Asn Gln Lys Ser Leu

            340                 345                 350

Phe Lys Asp Gln Lys Phe Glu Ala Met Leu Val Gln Gln Asn Arg Ser

        355                 360                 365

Asp Lys Ser Ser Cys Asp Glu Cys Lys Glu Lys Lys Gln Gln Ile Asp

    370                 375                 380

Thr Val Phe Gly Glu Lys Ser Val Ile Thr Leu Ser Ser Ile Phe Thr

385                 390                 395                 400

Lys Asp Leu Val Glu Lys His Asn Leu Pro Trp Ser Leu Gly Gly Lys

                405                 410                 415

Thr Gln Ile Glu Pro Glu Asn Lys Ile Thr Leu Cys Lys Ile His Thr

            420                 425                 430

Lys Ser Pro Lys Cys His Gly Thr Gly Val Gln Asn Glu Gly Lys Gln

        435                 440                 445

Pro Ser Glu Thr Pro Thr Leu Ser Asp Glu Lys Gln Trp His Asp Val

    450                 455                 460

Ser Val Tyr Leu Gly Leu Thr Asn Cys Pro Ser Ser Lys His Pro Glu

465                 470                 475                 480

Lys Leu Asp Val Glu Cys Gln Asp Gln Met Glu Arg Ser Glu Ile Ser

                485                 490                 495

Cys Cys Gln Lys Asn Glu Ala Cys Leu Gly Glu Ser Gly Met Cys Asp

            500                 505                 510

Ser Lys Cys Cys His Pro Ser Asn Phe Ile Ile Glu Ala Pro Gly His

        515                 520                 525

Met Ser Asp Val Glu Trp Met Ser Ile Phe Lys Pro Ser Lys Met Gln

    530                 535                 540

Arg Ile Val Arg Leu Lys Ser Gly Cys Thr Cys Ser Glu Ser Ile Cys

545                 550                 555                 560

Gly Thr Gln His Asp Ser Pro Ala Ser Glu Leu Ile Ala Ile Gln Asp

                565                 570                 575

Ser His Ser Leu Gly Ser Ser Lys Ser Ala Leu Arg Glu Asp Glu Thr

            580                 585                 590

Glu Ser Ser Ser Asn Lys Lys Asn Ser Pro Thr Ser Leu Leu Ile Tyr

        595                 600                 605

Lys Asp Ala Pro Ala Phe Asn Glu Lys Ala Ser Ile Val Leu Pro Ser

    610                 615                 620

Gln Asp Asp Phe Ser Pro Thr Ser Lys Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu

625                 630                 635                 640

Ser Arg Gln Met Val Thr Asp Leu Glu Leu Ser Thr Leu Leu Pro Ile

                645                 650                 655

Ser His Glu Asn Leu Thr Gly Ser Ala Thr Asn Lys Ser Glu Val Pro

            660                 665                 670

Glu Glu Ser Ala Gln Lys Asn Thr Phe Val Ser Tyr

        675                 680

 

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>5

tccccggcaa gtgagctaat    20

 

<210>6

<211>20

<212>DNA 

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>6

atacatcccc attcccgagg    20

 

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

  

<220>人工序列

 

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>7

aagtcagagg tcccagaaga    20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>8

ctatgcaggg gttctttctc    20