虫草菌种或其提取物在禽蛋生产中的应用

摘要

本发明涉及虫草菌提取物以及其应用。特别是本发明涉及一种含有至少一种虫草菌种或其提取物的膳食补充剂或动物饲料。这种膳食补充剂和/或动物饲料较适合于卵生动物，且特别适合于禽蛋的生产。

说明书

技术领域

本发明涉及虫草菌提取物以及其应用。特别是本发明涉及一种含有虫草菌种提取物的膳食补充剂。这种膳食补充剂可以添加至饲料和/或饮用液体中从而改善动物特别是卵生动物的保健和一般健康。本发明也涉及在动物饲料和/或饮用液体中使用这种膳食补充剂从而改善生产禽蛋的质量。

背景技术

畜牧业是一种繁殖和饲养牲畜的农业实践，有很长的历史。畜牧业的范畴包括动物的管理、控制、营养和福利。培育动物是为了生产肉类产品以及其它如羊毛、奶类和禽蛋。通常为这些目的饲养的动物包括牛、山羊、绵羊、猪、鸡和家禽。

动物营养和动物饲料配方的研究旨在改善动物的生长、健康、福利以及动物产品的质量。这样的动物饲料配方可以包括全部的饲料，它包含全部所需的营养素，提供部份所需营养素的浓缩物(例如蛋白质或碳水化合物)或提供附加的微量营养素(例如维生素和矿物质)的补充剂。养殖者购买浓缩物和补充剂作为独立的配方在需要时拌和搀入动物饲料。

家禽特别是鸡是非常重要的农用动物，养殖它们作为食用和禽蛋。这些典型的家禽大多是鸡形目(Galliformes)种(例如鸡和火鸡)，和雁形目(Anseriformes)种(水禽如鸭和鹅)。除了饲养家禽作为肉用外，禽蛋也是一种重要的食用家禽产品。

禽蛋的营养价值很高，含有大量的蛋白质，以及维生素和矿物质，包括维生素A、核黄素、叶酸、维生素B6、维生素B12、胆碱、铁、钙、磷和钾。然而，蛋黄中含有相当数量的胆固醇，其含量超过建议每日胆固醇摄入量的三分之二，正是由于禽蛋的胆固醇含量很高以及与之相关的负面宣传从而给禽蛋的生产者带来挑战。

胆固醇是合成性类固醇和肾上腺激素的重要前体，并在许多生化过程中起着中心作用。人体是能够重新合成胆固醇，但可以从膳食中得到。心血管疾病与高水平胆固醇之间有某种联系，所以消费者倾向于担忧膳食中的胆固醇。

因此，为迎合消费者满意的目的，最好是要有降低禽蛋胆固醇含量的生产方法。这也将有利于提高禽蛋的营养价值。

发明内容

发明概要：

根据第一方面，本发明提供一种包含至少一种虫草菌种，或至少一种虫草菌种的至少一种提取物的膳食补充剂。一般来讲，任何一种虫草菌种可以考虑接受。

虫草菌种是可以选自下列组，包括冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)、蛹虫草菌(Cordyceps militaris)、藻虫草菌(Cordyceps gracilis)、大团囊虫草菌(Cordyceps ophioglossoides)、cordyceps memorabillis、cordycepssphecocephala、亚香棒虫草菌(Cordyceps hawkesii)、珊瑚虫草菌(Cordycepsmartialis)、蝉花虫草菌(Cordyceps sobolifera)或实蝇虫草菌(Cordycepscapitata)。虫草素提取物可以是粉状类型或液体浆状物。

根据另一方面，本发明提供补充至少一种虫草菌种或其提取物于动物饲料的方法。较适合的方法是由提取物组成的膳食补充剂与饲料和/或饮用的液体混合，然后提供给动物。较适合的动物是一种卵生动物，较适合的方法是生产至少一种禽蛋。更适合的卵生动物是家禽。最适合的家禽是鸡。膳食补充剂较适合与饲料混合并提供给动物。

根据另一方面，本发明提供补充了包括至少一种虫草菌种的至少一种提取物的膳食补充剂的饮用液体。

根据进一步方面，本发明提供了一种动物饲料，它包含至少一种饲料原料和至少一种虫草菌种的至少一种提取物。虫草菌种是可以选自下列组，包括冬虫夏草菌、蛹虫草菌、藻虫草菌、大团囊虫草菌、cordyceps memorabillis、cordycepssphecocephala、亚香棒虫草菌、珊瑚虫草菌、蝉花虫草菌、实蝇虫草菌。虫草菌提取物可以是粉状或浆状。任何主要饲料原料，包括玉米，大豆，高粱，燕麦和大麦，可用于制备这种动物饲料。

本发明还提供用上述的动物饲料饲养至少一种动物的方法。较适合的动物是一种卵生动物，更适合的动物是家禽。最适合的动物是鸡。此外，喂养方法是为了生产禽蛋。

根据另一方面，发明还涉及到一种通过上述的方法和/或其膳食补充来喂养的动物。特别是，这种动物是用来生产肉类。因此，本发明还涉及到来自于上述的方法和/或其膳食补充的肉类。特别是肉类可以是加工的肉、和/或来自于畜体的肉。特别是肉类可以是加工的肉、分割的肉、和/或来自于畜体的肉。

在另一个方面，本发明提供一种用于生产至少一种禽蛋的方法，包含补充至少一种动物的膳食，它包括至少一种虫草菌种的至少一种提取物，和/或用一种含有至少一种饲料原料加上至少一种虫草菌种的至少一种提取物的动物饲料来饲养动物。

在另一个方面，本发明涉及到至少一种虫草菌种的至少一种提取物在制备一种为生产至少一种禽蛋的膳食补充剂中的应用。

根据另一方面，本发明还涉及到根据上述发明的任何一种方法来获取得的一种禽蛋。

定义：

提取物包括：由原始材料提取出的一种产品、一种精华、一种浓缩物、一种乳状液，通过干燥、研磨或压缩原始材料而生产的一种产品，例如成为一种粉状、一种饼，或从原始材料衍生出的任何产品和原料包括浆液和沉淀物。

卵生动物指产卵动物，没有或完全没有母体胚胎发育。卵生动物包括许多鱼类、两栖动物和爬行动物、所有的鸟类、单孔目(产卵的哺乳动物)以及大多数昆虫和蜘蛛。

家禽是指任何驯养的禽鸟或圈养的禽鸟生产肉类或禽蛋；例如鸵鸟有时作为家禽被圈养。

禽是指人类经常使用作为食物的某些鸟类。它包括一些如鸡，火鸡，猎鸟如野鸡或鹧鸪，野禽类的孔雀珍珠鸡，和水禽如鸭和鹅。

这种被称为“禽”的鸟属于两个目之一，即猎禽或陆禽(鸡形目)和水禽(雁形目)。

动物饲料，是指饲养动物的物质，不论是固体、液体或浆液，包括混合了原料、饲料，饮用液体例如水的复合饲料。

本文提到的，主要是指50％以上，特别是60％以上、70％以上、80％以上、高于90％，或超过99％。

详细说明：

本发明所述的用于膳食补充剂和/或动物饲料的至少一种虫草菌种的至少一种提取物可以从自然界中存在的虫草菌种取得。天然存在的虫草菌种生长在寄主毛毛虫或昆虫幼虫中，通过虫草菌丝体的内部丛簇，昆虫木乃伊化。最终，一种大个棍棒状子座，有时从其木乃伊寄主上长出10-15厘米的长度并在其上部支撑埋入的子囊壳。野生虫草菌是非常昂贵，会含有高含量的重金属，并带有微生物污染。使用的虫草提取物可以通过大规模培养虫草菌种来获得。特别是，使用的虫草提取物可以根据在新加坡专利申请SG 200400686-2(新加坡专利129276)所公开的方法来制备(参见SG 200400686-2(SG patent 129276))。然而，任何其他作为用于制备虫草提取物的已知方法，如果对本发明的目的有用也可以使用。

给予动物膳食补充剂和/或含有本发明膳食补充剂的动物饲料对动物是有益的。这将加强动物健康和福利。在膳食补充剂和/或动物饲料中的虫草菌提取物也可激发家禽的免疫系统，提高抵抗力抗击有关疾病，包括但不限于禽霍乱疾病，禽流感及H5N1病毒，新城疫和/或马立克氏病。

膳食补充剂和/或动物饲料两者都可以用于卵生动物的畜棚饲养，放养型饲养和/或高密度饲养类型。含有至少一种虫草菌种提取物的膳食补充剂和/或动物饲料可有一个重要的优势，即提高免疫力、减少对疾病的敏感性，特别对于高密度动物饲养类型。

本发明人也令人惊讶的发现，本文所述的方法在禽蛋生产时可以得到降低其胆固醇含量的结果。据报道鸡蛋胆固醇含量范围是从368.20±22.54毫克/100克新鲜蛋液物质至437.63±24.61毫克/100克新鲜蛋液物质(Vorlová L.etal.，Acta Vet.Brno，2001，Vol 70，387-390)。由本发明方法生产的鸡蛋含胆固醇低于350毫克/100克蛋液物质。尤其是，本发明方法生产的鸡蛋含胆固醇低于300毫克/100克蛋液物质。更具体地说，本发明的鸡蛋含胆固醇202-293毫克/100克蛋液物质。因此，与至少一种不是由本发明方法生产的鸡蛋比较，本发明的鸡蛋含有降低了的胆固醇含量。

因此，根据另一个方面，本发明提供了一种鸡蛋含胆固醇低于350毫克/100克蛋液物质。特别是，本发明提供了一种鸡蛋含胆固醇低于300毫克/100克蛋液物质。

更进一步，本发明人竟然发现，使用上述方法可以将虫草素转移入所生产的鸡蛋中。据发现，每一个生产的鸡蛋含虫草素0.06-0.08克，虫草素量的高低取决于供给动物膳食补充剂的数量。虫草素主要在蛋黄中。

因此，根据另一个方面，本发明提供一种含虫草素的鸡蛋。特别是，本发明提供一种鸡蛋含0.006到0.08毫克虫草素/100克蛋液物质。

虫草素(3’-脱氧腺苷)是由虫草菌种产生的核苷腺苷衍生物。虫草素通常用作虫草菌种的生物标记。在这种情况下，生产的鸡蛋中存在虫草素表明虫草菌提取物中的其他活性物质和/或有益成份也转移到鸡蛋中。

下面的冬虫夏草药理作用或通过动物模型和/或人类临床试验已进行了研究：

·免疫调节：冬虫夏草可以大大加强机体的免疫力。

·抗肿瘤和抗微生物效应：与免疫调节功能有关，冬虫夏草可以抑制病毒，细菌和真菌感染。

·抗糖尿病活性：据报道冬虫夏草多糖可以显著降低血糖水平。

·能量代谢和增强体能：据报道冬虫夏草可以刺激肝脏能量代谢水平。

·呼吸和肺功能：据报道冬虫夏草可以放宽支气管壁以及具有镇静，镇咳，抗发炎的特性，因此它可以有效地预防咳嗽，咳痰，哮喘和其他呼吸道疾病。

·胆固醇和脂肪代谢：有关报告指出冬虫夏草可以降低血浆甘油三酯、“坏胆固醇”即低密度脂蛋白胆固醇和非常低密度脂蛋白胆固醇、以及总胆固醇水平。

·对肾功能障碍有效：有证据表明冬虫夏草可以用于治疗伯杰氏病(IgA肾病)。

·对性功能障碍和生殖系统疾病有效：据报道冬虫夏草对阳萎有临床改善。

·其他：有关报告指出冬虫夏草能够刺激小鼠骨髓中红细胞和抑制血小板聚集。

此外，化合物虫草素已被广泛研究并已被证明具有抗肿瘤和抗真菌特性。在一项研究中的结果表明，虫草素能在RNA细胞中抑制核糖核酸分子的合成(SievM.et al.，J.Cell Biol.，1969，Vol 41，510-520)

因此，本发明的另一个方面提供一种治疗和/或预防至少一种病害的方法，包括处理至少一种此处所述的鸡蛋，来自于至少一种此处所述的鸡蛋的提取物或蛋制品。

本发明还涉及到至少一种此处所述的鸡蛋的应用，由来自于至少一种此处所述鸡蛋的蛋提取物或蛋制品所制备的一种成份用于治疗和/或预防至少一种疾病。疾病包括呼吸系统疾病，肾脏疾病，糖尿病，癌症，肿瘤和/或传染病。

附图说明

图1展示高压液相色谱(HPLC)测定结果：图1中的(A)由含有冬虫夏草菌提取物的动物饲料饲喂的蛋鸡所生产的全鸡蛋；图1中的(B)由对照蛋鸡生产的鸡蛋；图1中的(C)虫草素标准；图1中的(D)由含有冬虫夏草抽提物的动物饲料饲喂的蛋鸡所生产的蛋的蛋黄；图1中的(E)由含有冬虫夏草抽提物的动物饲料饲喂的蛋鸡所生产的蛋的蛋白。

图2展示用补充了冬虫夏草粉的膳食所饲喂的三黄鸡(测试组)和对照鸡组的对比。图2中的(A)和(B)展示了测试组的两只鸡，图2中的(C)和(D)展示了对照组的两只鸡。

具体实施方式

现在已一般地阐述了本发明，通过参考以下提供实例的举例方式同样会更容易理解，但无意以这些实例对本发明作限制。

实施例1

至少一种虫草菌种的提取物，最好是根据公开的新加坡专利申请号200400686-2(新加坡专利129276)中描述的方法培养获得。FIRDI编号的虫草菌株是来自台湾食品工业发展研究所。

下面阐述的是不同虫草菌株的生产方法。应当指出生长参数，例如发酵时间、温度、搅拌速度、通气量、pH值范围等，不一定限于所示值，但可能会在一个合理的程度变动，这是本领域技术人员通常可以理解的。

在发酵罐中培养冬虫夏草菌：

用葡萄糖，麦芽糖或粉末，酵母提取物原料以及表1所列的食品级化学制品来配制一种含有一种碳源，一种氮源，维生素，矿物质和其他生长因子的液体培养基。为了生产虫草菌，例如冬虫夏草菌，一分离菌株首先在固体培养基上培养。冬虫夏草菌株APN4-1(FIRDI-36421)25℃下在麦芽酵母(YM)斜面或平板琼脂培养基(表2)、或马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面或平板琼脂培养基(见表3)上生长和/或保持3天。

培养一级种子使用锥形瓶的摇动培养。1升液体培养基(表4，或表5)装入5升锥形瓶，在121℃消毒20分钟后，接种3-6个APN4-1冬虫夏草菌种斜板，然后在下列情况下生长：

·pH值5.5(接种前调节)

·25℃

·瓶以大约150rpm的旋转速度在摇床上转动

·培养期：48小时。

培养冬虫夏草菌二级种子使用搅拌生物反应器(BioLafitte)75升(或更大)，发酵培养基(表1)装液量50升或以上，在121℃下消毒30分钟，接种2升一级种子细胞(4％的接种量)，保持下列生长条件：

·pH值5.5

·25℃

·通气率：1∶0.2-1∶0.9(M3/分钟)(1500-2700升/小时每50公升液量)

·搅拌速度：200rpm

·培养期：48小时。

培养冬虫夏草菌丝体，使用800升(或更大)搅拌式反应器(例如BioLafitte)，装600升发酵培养基液量(见表1)接种50升或更多的二级种子(8％接种量)。发酵罐和培养基接种前需在121℃下消毒30分钟。

·pH值5.5

·25-29℃

·搅拌速度：200rpm

·典型的通气率：1∶0.5-1∶1.1(M3/分钟)(18-36立方米/小时每600公升液量)

·培养期：48-72小时。

当菌丝成长已达到其指数生长后期，或已达到成倍繁殖的生产目的，打开800升生物反应器的底部阀门收集冬虫夏草菌丝体，然后经真空过滤器或压力过滤器过滤，每个生物反应器获得含30％干物质的100公斤菌丝体滤饼。滤饼通过双锥形回转真空干燥器或冷冻干燥器干燥获得含27-28％蛋白质的干菌丝体，再用碾磨机将干菌丝体粉碎至100-200目粒度的粉末，然后用铝箔袋包装。

表1液体培养基

新培养基(克/升)括弧中是最佳值葡萄糖，30-50(40)麦芽糖，30-60(40)KH₂PO₄，0.05-2.0(1.5)MgSO₄，0.05-1.0(0.3)酵母提取物，15-30(20)

表2YM斜面/平板琼脂培养基

组分含量酵母提取物3克麦芽提取物3克蛋白胨5克葡萄糖10克琼脂20克蒸馏水到1升

表3马铃薯葡萄糖琼脂培养基

组分含量马铃薯提取物4.0克葡萄糖20.0克琼脂15.0克pH5.6蒸馏水到1升

表4摇瓶培养基-1

组分含量克/升葡萄糖40.0麦芽糖粉20.0克马铃薯葡萄糖液24.0克酵母提取物10.0水到1升

表5摇瓶培养基-2

组分含量克/升葡萄糖40.0麦芽糖粉40.0KH₂PO₄1.5MgSO₄.7H₂O0.3酵母提取物/蛋白胨20.0水到1升

在发酵罐中培养藻虫草菌、大团囊虫草菌、cordyceps memorabillis：

藻虫草菌株APN4-2(FIRDI 32217)、cordyceps memorabillis APN4-3(FIRDI32218)及大团囊虫草菌株培养和保存在YM斜面或平板琼脂培养基(表2)上，温度25℃、时间3-5天。藻虫草、C.memorabillis或大团囊虫草菌种的斜面培养用于接种300毫升锥形瓶装液50毫升培养基(表4，5)。接种培养基在25℃、150转摇瓶机上培养菌丝72小时。

所阐述的用于培养冬虫夏草菌的多阶段发酵法也用于商业化生产藻虫草菌、C.memorabillis或大团囊虫草菌。

蛹虫草菌：

也已发现，这种菌种在温度高于25℃下的琼脂斜面/平板上不会良好的生长。通过对YM琼脂培养基(对照，表2)添加0.6％硝酸钠或0.01％核黄素(维生素B2)，培养时间可从7天缩短至3天(生长在强化培养基中)。蛹虫草菌株APN的4-5(FIRDI 32219)在强化YM培养基上，17-23℃最好是20℃下，培养和保持3天，然后用于实施例3的多阶段发酵。

用于培养所有其他虫草菌品种的培养基(表1)，与专门用于蛹虫草菌的培养基(表6)稍有不同。所有其他菌株用磷酸二氢钾和MgSO₄.7H₂O作为矿物质源，而蛹虫草菌则使用硝酸钠(表6)。

热水提取可以增加药用真菌有效成分的收回率。使用的水可以与pH缓冲液混合，调节其pH值至10左右。

表6培养蛹虫草菌的液体培养基

组分含量克/升葡萄糖40克麦芽糖粉40克NaNO₃2克酵母提取物/蛋白胨20克水到1升

实施例2虫草菌生物活性成分的抽提工艺

根据已知技术的传统方法，虫草的生物活性成分可以提取成水溶性和乙醇溶解的化合物。然而，这些传统方法提取不包括热水提取，这种方法更详细地描述如下。一个没有热水抽提的传统方法在提取水溶性多糖时无效。热水也可用缓冲液调节到pH10，可以进一步增强功效。

1700克湿虫草菌丝体用6升热水(约90℃)浸泡过夜，并轻轻搅拌，约24小时或以上。虫草菌过滤后，滤液与2体积的99％乙醇混合(1体积为6升)。过滤除去滤液并收集乙醇造成的沉淀，沉淀物用50％乙醇洗涤，随后冻干，获得虫草菌多糖2.9克。

残渣再用4升80％的乙醇溶液轻轻搅拌抽提4次来提取其它的活性化合物。蒸发乙醇并浓缩物冻干后得到101克固体。使用甲醇、丙酮以外的任何其他溶剂，这对本领域任何技术人员来讲将是显而易见的。

浓缩物是一种粉剂形式，可以用作膳食补充剂。该粉剂的产品规格见表7。

表7由所阐述方法生产的虫草菌粉剂的产品规格

  产品说明  虫草菌丝体粉剂。由深层培养法培养后干燥、碾磨和消毒  产品指纹蛋白质/糖蛋白：总体：SDS-电泳和western免疫印迹傅立叶变换红外光谱

  产品说明  虫草菌丝体粉剂。由深层培养法培养后干燥、碾磨和消毒  外观：颜色：气味：粒度：流动性：  粉末，流动性好棕色或浅棕色轻微发酵100 to 200目自由流动  pH(10％水溶液)：  4.5-5.5  水分％：  低于5％  活性成分：全部的蛋白：全部的水溶性多糖：虫草酸(甘露醇)：虫草素(3’-脱氧腺苷)：腺苷：27-28％高于或等于20％高于或等于5％高于或等于0.1％高于或等于0.15％  灰分：  低于5％  重金属：砷铜铅汞＜0.01ppm＜15ppm＜0.2ppm＜0.01ppm  微生物指标：细菌总数，菌落/克霉菌酵母总数，菌落/克大肠杆菌/克  符合新加坡药典＜10²＜10²阴性  金黄色葡萄球菌/克沙门氏菌/克  阴性阴性

实试例3虫草菌浆液的制备

在完成实试例1中描述的规模化培养方法，菌丝体不是被收集后干燥，而是收集经过针刺制聚酯过滤介质，通过重力或由可控制的真空力过滤它，使湿菌丝体含有10-20％的总固体。湿菌丝体用水冲洗两次以去除残余物。

虫草浆液的提取率的范围是每立方米发酵液300-500公斤不等。

将含10-20％的总固形物的湿菌丝体放入胶体磨或均质机或任何适当类型的碾磨机进行均质。均质后可以得到一个0.5-3.0微米大小颗粒的湿菌丝体，这可以让菌丝体很好地分散在液体中。所获得虫草菌制剂称“虫草菌浆”。

所获得的“冬虫夏草菌浆”的具体特点如下表8所示。

已经观察到其他种或菌株与冬虫夏草菌有不同的特点。这些特点列于表9。

表8浆型冬虫夏草菌的产品规格

  产品说明 虫草菌丝体由深层培养法培养后过滤、包装、在110-121℃下消毒  包装形式 浆状物产品，重量3公斤或按顾客要求的数量，用复合蒸煮袋包装  产品指纹蛋白质/糖蛋白：总体：SDS-电泳和western免疫印迹傅立叶变换红外光谱  外观：颜色：气味：性能：棕色或浅棕色轻微发酵浆液  pH(10％水溶液)： 4.5-5.5  固形物％： 10-20％  成分(以干物质计)：全部的蛋白：全部的水溶性多糖：虫草酸(甘露醇)：虫草素(3’-脱氧腺苷)：腺苷：27-28％高于或等于20％高于或等于5％高于或等于0.1％高于或等于0.15％  灰分：  低于5％

  产品说明 虫草菌丝体由深层培养法培养后过滤、包装、在110-121℃下消毒  重金属：砷铜铅汞＜0.01ppm＜15ppm＜0.2ppm＜0.01ppm  微生物指标：细菌总数，菌落/克霉菌酵母总数，菌落/克大肠杆菌/克金黄色葡萄球菌/克沙门氏菌/克  符合新加坡药典＜10²＜10²阴性阴性阴性

表9其他虫草菌的特点

  产品和细胞说明  1)蛹虫草菌丝体视觉上白而细，而冬虫夏草菌是最粗。2)蛹虫草菌浆有牛奶风味。3)蛹虫草菌粉的味觉最甜，大团囊虫草菌则有点酸而冬虫夏草具有苦味。4)蛹虫草菌生物体比大团囊虫草菌和冬虫夏草菌较紧密。5)在显微镜下，蛹虫草菌子囊中有两个孢子而冬虫夏草菌只有一个(见照  片)。  傅立叶变换红外光谱指纹  5种虫草菌的傅立叶变换红外光谱图完全不同。如需索取。  活性化合物：虫草酸  蛹虫草菌和大团囊虫草菌的含量高于9％，而冬虫夏草菌仅为5-7％。

  活性化合物：虫草素  蛹虫草菌高于冬虫夏草菌2-3倍，但未确定大团囊虫草菌含虫草素。  活性化合物：腺苷  蛹虫草菌和大团囊虫草菌的含量高于冬虫夏草菌  活性化合物：Ophiocordin(balanol)  一种有效的蛋白激酶抑制剂，只存在于大团囊虫草菌中。

实试例4饲料的制备

动物饲料是在每吨商用饲料或普通蛋鸡饲料中混合50克，125克或300克的冬虫夏草菌粉而制得，冬虫夏草菌粉通过上述实试例2获得。

另外的选择是将粉添加到饮用液体中，或直接使用浆液。

实试例5鸡的饲养和生产蛋的性能

8000只Bovans Goldline褐壳蛋鸡喂养由实试例4制备的冬虫夏草菌饲料从60周至90周。

在此期间，取样由此生产的鸡蛋，并用高压液相色谱法分析虫草素和胆固醇含量。

高压液相色谱法分析虫草素含量：

虫草素标准样自Sigma化学公司获得。测定鸡蛋虫草素，首先将8个鸡蛋去壳、混合、称重。然后将混合物均匀化。取10克的匀浆样本进行化验，用100毫升正己烷提取3次。收集的提取物在超声波和60℃下作用1.5小时。在上高压液相色谱柱前，超声波后的样品用0.45微米微量注射器过滤。高压液相色谱法分析仪是岛津LC20A R1.24，使用254纳米检测仪。5微升样品注入成环形的0.45微米微量注射器过滤，然后色谱分离则采用C18、300×4.6毫米、5微米的粒子大小、色谱柱(美国Waters公司生产)。洗脱流动相：乙腈-水(体积/体积496)和磷酸盐缓冲液(Na₂PO₄，0.1M，pH值6.8)，流速为1.0ml/分钟。使用岛津LC solution软件分析数据。

高压液相色谱法分析胆固醇含量：

鸡蛋中胆固醇含量则由测试机构新加坡PSB用标准方法测试。

结果：

在用含冬虫夏草菌动物饲料饲喂的蛋鸡产生的鸡蛋中检测到虫草素(图1中的A)，但未在对照组蛋鸡产生的鸡蛋中出现(图1中的B)。此外，虫草素主要存在于蛋黄中(图1中的D)。而在蛋清中没有检出虫草素。

表10展示了含冬虫夏草菌提取物动物饲料喂养的蛋鸡所产生的鸡蛋中虫草素和胆固醇含量。

表10冬虫夏草菌提取物动物饲料喂养的蛋鸡所产生的鸡蛋中虫草素和胆固醇含量

  每吨蛋鸡饲料中冬虫夏草菌粉添加量  喂养时间，(周)  每100克去壳蛋液的虫草素含量(克) 每100克去壳蛋液的胆固醇含量(毫克)  300克  8  0.043-0.08 202  50克  12  0.006-0.007 237  125克  10  0.02-004 293

测定结果显示含冬虫夏草菌提取物饲料喂养的蛋鸡所产生的鸡蛋中的虫草素含量在0.006-0.08克/克全蛋液的范围内，含量高低取决于冬虫夏草菌提取物在饲料中的浓度。同样，生产的鸡蛋中胆固醇含量的变化从202至207毫克/100克蛋液物质不等。如上所述，在正常鸡蛋含较高的胆固醇，含量为368.2±22.54毫克/100克蛋液物质到437.63±24.61毫克/100克蛋液物质(VorlováL.et al.，Acta Vet.Brno，2001，Vol 70，387-390)。

虽然上述描述了本发明较佳实施例的说明，但这是可以理解的，那些熟悉有关技术的人员可能在设计细节，构建或操作上作许多变化或修改，但这些并没有偏离本发明权利要求保护的范围。

实试例6冬虫夏草菌丝体粉对SD大鼠(Sprague Dawley rats)的效果

10只雄性和10只雌性SD大鼠，6-8周龄用于研究。用一个常规的实验室饮食喂养大鼠并无限量提供水。在实验前口服饲喂，夜间不喂食。实验开始前记录体重(第1天)。

具体实验采用新加坡专利申请200400686-2(新加坡专利129276)所述的方法进行。实验组包括5只雄和5只雌大鼠，用剂量2克/20毫升的冬虫夏草菌丝体悬浮液灌胃，剂量相当于2克/公斤鼠。另外的5只雄和5只雌大鼠给予水，剂量为20毫升/公斤老鼠。监测15天，测试大鼠体重。

在第2，3，4，7，10，13和15天对老鼠体重监测。表11展示，对照组和试验组的平均体重。

表11

  天  平均体重/克(对照组)  平均体重/克(实验组)  第1天  193.7  195.4  第2天  213.18  214.6  第3天  220.52  221.6  第4天  227.08  228  第7天  245.3  249.1  第10天  260.6  267.3

  天  平均体重/克(对照组)  平均体重/克(实验组)  第13天  278.2  285.1  第15天  285.4  297

这项研究表明，这些饲喂冷冻干燥冬虫夏草菌丝体老鼠比对照组鼠获得更多的体重增加。

死亡率：没有任何老鼠在实验中死亡。这项研究显示冷冻干燥冬虫夏草菌丝体半数致死量(LD₅₀)可以是比2克/公斤体重更大。

实试例7用冬虫夏草菌丝体饲喂肉鸡

两种肉鸡品种用于实验，一是传统中国的三黄鸡，二是快速生长品种科宝-500，研究的范围包括饲喂冬虫夏草菌丝体对肉鸡成长表现和对鸡肉肉质的改善。

7A)三黄鸡

三黄鸡是一种常见的中国鸡种，它们名字代表了独特性，即黄嘴，黄脚和黄色羽毛。这种传统品种的生长周期在100-180天。

在这项研究中，2000只三黄鸡用于实验。鸡被分成两个组，每组1000只鸡。第一组(试验组)饲喂商业饲料加冬虫夏草菌丝粉，第二组(对照)仅饲喂商业饲料，饲喂时间100天。使用的商业饲料是嘉乐品牌广州九江饲料有限公司生产，产品的成分是72％碳水化合物/脂肪，16％的蛋白质，0.5～0.8％总磷，＞0.3％的蛋氨酸，粗纤维4％，0.7 1.2％钙，0.3-0.8％盐和8％灰份。

实验组饲喂商业饲料和添加冬虫夏草菌丝体粉，添加量不断增加，按新加坡专利申请200400686-2(新加坡专利129276)所描述的方法制备：

第1-第10天：每吨饲料添加250克。

第11-第20天：每吨饲料添加500克。

第21-第0天：每吨饲料添加1000克。

第61-第100天：每吨饲料添加2000克。

下列是两组鸡的实验鸡果。

成长表现：

测试了试验组和对照组各1000只三黄鸡的平均体重、饲料转化率，定义为在特定时间内(在此是100天)，饲料消费量除以鸡只体重。这些结果列于表12。

表12试验组和对照组三黄鸡的平均重量和饲料转化率

  试验组  对照组 平均重量(公斤)  2.8  2.7 饲料转化率(FCR)  3.1  3.5

试验组三黄鸡的平均体重较对照组高(与上例6的研究一致)。此外，试验组饲料转化率比对照组略低，这表明试验组比对照组更有效地使用饲料。

肉质量的比较：

汇集试验组和对照组各5只三黄鸡分析蛋白质，脂肪和氨基酸含量(表13)。

蛋白质，脂肪和肉类的氨基酸含量分析采用标准方法，由广州市农业标准和监督中心的检测实验室测试。

表13试验组和对照组三黄鸡鸡肉蛋白质，脂肪和氨基酸含量的比较

  蛋白质，％  脂肪，％  16种主要氨基酸，％  试验组  23.5  1.5  21.27  对照组  23.1  0.8  21.17

表13的结果表明，试验组比对照的蛋白质和氨基酸的含量略有增加，但脂肪含量增加了一倍。有人建议，增加的脂肪含量可提供更好的风味和质地的三黄鸡肉。

鸡的外观：

如图2所示用冬虫夏草菌丝粉饲料喂养的三黄鸡比对照组有更好的外观。这些三黄鸡鸡冠的红色更亮丽，它们的羽毛更晶莹剔透，以及它们的喙，羽毛，脚有一个更亮丽的黄色。在中国，由于消费者的偏好，外观亮丽的三黄色鸡将转化为更高的价格和更好的销售表现。

品尝测试：

五人组成的品尝小组一致认为，用冬虫夏草菌丝粉补充的饮食喂养的三黄鸡比对照组肉更好吃。

预防和降低疾病：

(I)鸡球虫病

鸡球虫病是一种寄生虫病，由Eimera属原虫引起的。这种寄生虫在肠道生长和繁殖，造成组织损伤。临床球虫病的发病率估计为5％，而亚临床球虫病的估计为20％左右。球虫病每年对全球商业鸡肉生产造成的费用估计至少为8亿美元(Williams，R.B.，Int J.Parasitol.，1998，Vol 28，1089-1098)。这一估计是基于下列成本，添加入饲料的预防药、治疗、鸡只的低产率、和死亡/发病造成的损失。

在这项研究中，补充冬虫夏草菌丝体饲料的三黄鸡组展现了鸡球虫病零发病率。相比之下，对照组多次遇到23％的鸡球虫病的发病率，需要使用磺胺二甲嘧啶治疗以控制感染。整个疗程包括，每1000公斤饲料添加5公斤的磺胺二甲嘧啶治疗三天，隔两天后，再做同样的治疗。在整个饲养中，对照组需要26次采用磺胺二甲嘧啶治疗。相比之下，试验组不需要任何治疗，因为没有观察到鸡球虫病的发生率。

(II)传染性支气管炎

传染性支气管炎是另一个养鸡常见的疾病，而这种疾病的症状包括气管罗音，咳嗽，打喷嚏及其他呼吸道症状。在这项研究中，饲喂补充冬虫夏草菌丝粉饲料的试验组的传染性支气管炎的发病率为零。相比之下，观察到对照组有气管罗音，咳嗽和打喷嚏个别现象。

试验组的鸡球虫病和传染性支气管炎零发病率表明，试验组中的冬虫夏草菌丝粉在提高鸡免疫力和抵抗疾病方面起着重要的作用。

(III)死亡率

在这项研究中，对照组30只鸡死亡，而实验组29只鸡死亡。必须指出，尽管两组死亡率相似，对照组使用药物防止球虫病，这可以提高抗病性从而增加了存活率，不仅对球虫病，还包括其他疾病。

7B)科宝-500

科宝500是一种快速成长的肉鸡品种，在30-45天成熟。两个实验组，每组100只科宝-500鸡用于试验。一组给予添加冬虫夏草菌丝粉的商业饲料，添加量100克冬虫夏草菌丝粉/1000克饲料，饲喂从孵化日起至36天。对照组仅饲喂相同的商业饲料36天。

肌苷单磷酸含量的分析：

对2只试验组科宝500鸡和1只对照组的鸡肉样本进行了肌苷酸含量的分析。测试使用Vani等(Vani，N.D.et al.，LWT Food Science and Technology，2006，Vol 39，627-632)描述的鸡胸肉肌苷酸含量分析法，两只试验组鸡肌苷酸的含量分别为2.31毫克/克和2.41毫克/克。对照组鸡肌苷酸的含量为1.61毫克/克。对照组鸡肌苷酸的含量与Vani等报道的1.885毫克/克鸡胸肉差不多。

肌苷酸的含量与肉类风味成正比(Vani等，2006)。试验组含有更高的肌苷酸表示试验组鸡肉比对照组具有更好的风味。

由一个五人组成的味道测试小组一致认为，对比对照组，试验组肉的味道和香味更好，肉的质地有平滑感。