检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法及其专用试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法及其专用试剂盒。本发明提供了特异性引物对和特异性探针。所述特异性引物对是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对。所述特异性探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本发明提供的方法，是以提取待测植物样本的基因组DNA作为模板，用所述特异性引物和所述特异性探针进行实时荧光PCR检测，确定待测植物样本是否含有植原体第V组成员。本发明公开的特异性引物对和特异性探针，可快速、方便、高灵敏度检测出植物样品是否携带或含有植原体第V组成员。检测过程中无需核酸染料，因此还具有环保安全的优点。可应用于植物检疫、植物保护、科研等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法及其专用试剂盒。

背景技术

植原体(phytoplasma)，原称类菌原体(mycoplasma-like organism，MLO)，为单细胞原核生物，无细胞壁，由生物膜包围，它可引起多种病害。植原体属于细菌界(Bacteria)，硬壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)，非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)。在1992年的第九届国际菌原体系统大会(International Organization forMycoplasmology，IOM)上，提出了用植原体(Phytoplasma)作为一个新的属名。在整个柔膜菌纲的分类鉴定中，16SrDNA是系统鉴定的首选标记。之后，众多研究者陆续根据16SrDNA序列结果将植原体分为若干16S组。根据最新分类研究，以植原体16S rDNA基因序列为对象进行分析，将植原体分为28个组。其中，植原体第V组成员包括枣疯病植原体、樱桃致死黄化植原体、重阳木丛枝植原体等。

尤其对于枣树来讲，在我国栽培范围极广，以山东、河北、山西、陕西、甘肃、安徽、浙江产量最多。在枣树病害中，枣疯病(Jujube Witches’Broom)发生普遍，并且由于其防治难度大，具有毁灭性，全国每年因枣疯病致枣树死亡带来的损失达数亿元。因此急需一种简便快速的检疫检测方法，来有效的检测植原体第V组病害，达到早期预防和控制的目的。

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术是一种20世纪八十年代处发展起来的分子生物学技术，用于富集特定的DNA片段。它运用从温泉细菌中分离出的DNA聚合酶(DNA Polymerase)，通过变性、复性(退火)和延伸等三步反应，模拟体内DNA复制。能够将极微量的核酸在短时间内迅速扩增复制，获得大量的目的DNA片段。

实时荧光PCR是在常规PCR体系中加入了一条Taqman探针。Taqman探针5’端标记有荧光分子，3’端标有淬灭基团。在PCR扩增过程中，与模板DNA配对正确的Taqman探针在Taq DNA聚合酶的5’端外切酶活性作用下，将荧光分子切下，检测荧光信号。实时荧光具有高灵敏度、快速的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法及其专用试剂盒。

本发明提供了用于检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的特异性引物对和特异性探针。

所述特异性引物对是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对。

上游引物(F)：5’-CAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGG-3’；

下游引物(R)：5’-TCGCTAAAGTCCCCACCATT-3’；

所述特异性探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。

特异性探针(P)：5’-FAM-TAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTC-TAMRA-3’。

所述特异性引物对和/或所述特异性探针在制备检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述植原体第V组成员具体可为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。

本发明还保护一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的试剂盒，包括所述特异性引物对和/或所述特异性探针。所述试剂盒具体可由所述特异性引物对和所述特异性探针组成。所述植原体第V组成员具体可为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。

本发明还保护一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法，是提取待测样本的基因组DNA作为模板，用所述特异性引物和所述特异性探针进行实时荧光PCR检测，确定待测样本是否含有植原体第V组成员。所述植原体第V组成员具体可为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。所述实时荧光PCR的PCR反应体系中，反应起始时，序列表的序列1所示核苷酸的浓度具体可为0.3mM，序列表的序列2所示核苷酸的浓度具体可为0.9mM，所述特异性探针的浓度具体可为0.2mM；所述实时荧光PCR的参数具体可为：50℃、2min；95℃、5min；95℃、15s，60℃、1min，40个循环。

用所述特异性引物对和特异性探针对待测植物样品进行检测时，若结果有Ct值读出并且阴性对照无Ct值，则可判断该样品携带有植原体第V组成员。

本发明提供的方法具有以下优点：

1)检测结果准确性高：在发明开发过程中，选取枣疯病植原体(植原体第V组)、樱桃致死性黄花植原体(植原体第V组)，重阳木丛枝植原体(植原体第V组)，以及泡桐丛枝植原体(植原体第I组)和杏褪绿卷叶植原体(植原体第X组)为对象，进行特异性检测，结果表明本发明检测准确性高。

2)稳定性及重现性高：在用本发明检测时，因为本发明基于模板数检测，相比于普通PCR，检测结果重复性好，稳定性高。

3)检测方法安全：应用本发明探针及引物检测时，无需进行凝聚、染色等步骤，减少了试剂对人体的伤害，因此具有安全性。

4)省时：本发明基于实时荧光PCR技术，省去凝聚、染色等步骤，减少了检测时间。

5)检测结果易于判断：本发明基于实时荧光PCR技术，检测结果呈现为数字和图形，排除了主观因素，易于判断分析。

6)检测灵敏度高：应用本发明检测，具有较高的灵敏度，能够满足实际检测检验的需要。

7)易于操作掌握：其操作过程与普通PCR反应操作相似，因此易于操作。

8)应用：可应用于检疫、科研等领域，尤其是对高通量和高灵敏性有要求的领域。

本发明公开的特异性引物对和特异性探针，可快速、方便、高灵敏度检测出植物样品是否携带或含有植原体第V组成员。检测过程中无需核酸染料，因此还具有环保安全的优点。可应用于植物检疫、植物保护、科研等领域。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR特异性；1：枣疯病植原体DNA；2：樱桃致死性黄花植原体DNA；3：重阳木丛枝植原体DNA；4，5：无反应的泡桐丛枝植原体和杏褪绿卷叶植原体。

图2为枣疯病植原体DNA梯度实时荧光PCR检测(图中标注为分子拷贝数)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

枣疯植原体(枣疯病植原体)、泡桐丛枝植原体(泡桐丛枝病植原体)、重阳木丛枝植原体(重阳木丛枝病植原体)、樱桃致死性黄花植原体(樱桃致死黄花病植原体)和杏褪绿卷叶植原体(杏褪绿卷叶病植原体)均来自野外发病植物，并经过了测序验证，其中枣疯植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESSIONNUMBER：FJ445390所示，泡桐丛枝植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESSIONNUMBER：FJ263621所示，重阳木丛枝植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESSIONNUMBER：EF432569所示，樱桃致死性黄花植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESSIONNUMBER：31074425所示，杏褪绿卷叶植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESSIONNUMBER：EU168758所示。

ABI Mix(ABI公司)；探针及引物(由大连宝生物公司合成)。7300实时荧光PCR仪(ABI公司)；ND-1000核酸/蛋白检测仪(Thermal公司)。

实施例1、试剂盒的制备

试剂盒由如下特异性引物对和特异性探针组成：

特异性引物对：

上游引物(F)：5’-CAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGG-3’(序列表的序列1)；

下游引物(R)：5’-TCGCTAAAGTCCCCACCATT-3’(序列表的序列2)；

特异性探针(P)：5’-FAM-TAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTC-TAMRA-3’(核苷酸序列为序列表的序列3)。

实施例2、试剂盒的特异性

将枣疯病植原体(植原体第V组)、樱桃致死性黄花植原体(植原体第V组)，重阳木丛枝植原体(植原体第V组)、泡桐丛枝植原体(植原体第I组)和杏褪绿卷叶植原体(植原体第X组)分别提取基因组DNA作为模板(阴性对照中，用水代替DNA模板)，用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR，以确定试剂盒的特异性。

实时荧光PCR扩增的体系见表1，循环参数见表2。

表1实时荧光PCR扩增的体系

  ABIMix  12.5uL  上游引物(7.5mM)  1uL  下游引物(7.5mM)  3uL

  ABIMix  12.5uL  探针(10mM)  0.5uL  DNA模板  5uL  ddH₂O  3uL

表2实时荧光PCR扩增的循环参数

结果见图1。从图1可看出，试剂盒中的特异性引物对和特异性探针能够检测出同属第V组的枣疯病植原体DNA、樱桃致死黄花植原体DNA和重阳木丛枝植原体；而属于第I组的泡桐丛枝植原体和属于第X组的杏褪绿卷叶植原体无扩增(位于基线下方)，可见探针引物具有较好特异性。

实施例3、试剂盒的灵敏性和稳定性

一、标准质粒的制备

以枣疯植原体基因组DNA为模板，用引物R16F2n：5’-GAA ACG ACT GCT AAGACT GG-3’，R16F2：5’-TGA CGG GCG GTG TGT ACA AAC CCC G-3’扩增枣疯病植原体16S rDNA片段，得到1.2kb PCR产物，克隆至PMD^TM-18T载体(takara)，提取质粒送北京诺赛生物技术有限公司测序验证，确定为目的质粒(标准质粒)。采用ND-1000核酸/蛋白检测仪测定浓度，并进行10倍梯度稀释。

二、试剂盒的灵敏性

10倍梯度稀释标准品质粒，分别用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光PCR扩增的体系和循环参数同实施例2(反应初始体系中分别含有1×10⁸拷贝、1×10⁷拷贝、1×10⁶拷贝、1×10⁵拷贝、1×10⁴拷贝、1×10³拷贝、1×10²拷贝、1×10¹拷贝)。反应结束后，以拷贝数以10为底的对数和Ct值关系作函数，构建标准曲线，以确定试剂盒的灵敏性。构建的标准曲线方程为：y＝-3.328x+37.99(其中y为Ct值，x为拷贝数对数；标准曲线决定系数R²＝0.998)。

提取枣疯病植原体的总DNA，进行10倍梯度稀释，分别用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光PCR扩增的体系和循环参数同实施例2。对照标准曲线可知样品中枣疯病植原体的拷贝数。

结果见图2。结果表明，采用本发明的试剂盒可检测枣疯植原体8.5×10¹拷贝。

三、试剂盒的稳定性

对4种不同浓度的标准质粒(反应初始体系中含有1×10⁸拷贝～1×10⁵拷贝)分别用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR，每个浓度重复检测3次，通过实时荧光PCRCt值的平均值和变异系数来评价试剂盒的稳定性。变异系数(CV)＝测定结果的标准差与其平均值的百分比。

结果见表3。结果均能判断为阳性，并且Ct值变异系数均小于5％，证明该试剂盒重复性好。

表3实时荧光PCR重复性检测

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法及其专用试剂盒

<130>CGGNARY92568

<160>3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

cagttcgtgt cgtgagatgt tagg    24

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

tcgctaaagt ccccaccatt              20

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

taagtcctaa aacgaacgca acccctgtc    29