一种强化植物修复砷污染场地的微生物菌剂及其制备和应用方法

摘要

一种强化植物修复砷污染场地的微生物菌剂及制备方法和应用方法，属于环境修复工程技术领域。所述菌剂所使用的菌种为农杆菌属(Agrobacteriumsp.C13)。该菌剂采用复合载体，其成分包括草炭土、锯末、稻壳、活性炭，其质量百分比为30∶25～30∶25～30∶15。微生物发酵液与复合载体按照质量比0.5～1∶1混合配比，复合载体的微生物吸附量达到109～1012个/克。将制备好的菌剂按5g/kg土用量施加到应用蜈蚣草修复的砷污染场地中，修复植物地上部生物量提高了16-17％，场地中砷的去除率比对照提高了40-41％。本发明的菌剂载体原料丰富，制备方法简单，易于实现大规模生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效微生物菌剂及制备和应用方法，具体的是一种能促进砷超富集植物-蜈蚣草吸收土壤砷的微生物菌剂，属于环境修复工程技术领域。

背景技术

砷的化合物具有致癌、致畸、致突变等性质。砷中毒是以皮肤为主的全身性疾病，它可以危害人体的皮肤、呼吸、消化、泌尿、心血管、神经、造血系统等。由于砷污染地下水的开采、含砷农药化肥的使用、金属冶炼以及矿山开采导致我国大量土地出现严重的砷污染。土壤环境中的砷通过食物、饮用水和呼吸进入人体，超过限量会引起人体砷中毒。近年来我国湖南、广西、云南等地，均出现过砷污染和砷中毒事件，土壤砷污染问题已成为我国重要的环境问题之一。

目前，砷污染场地修复已成为各国的研究热点问题。砷污染场地的植物修复是治理砷污染有效技术手段之一。研究报道发现的砷超富集植物-蜈蚣草以极强的富砷特性和极大的生物量而受到广泛的关注。2003年陈同斌等公开了一种治理土壤砷污染的方法(CN1397390A)，该方法通过蜈蚣草根部吸收大量的砷并向上输送和转运到地上部。2005年陈保东等公开了一种提高砷污染土壤植物修复效率的方法(CN1633834A)，该方法是对蕨类植物蜈蚣草接种丛枝菌根真菌，使其菌根化。2007年廖晓勇等公开了利用植物修复砷污染土壤的方法(CN1981947A)，该方法包括有育苗、种植密度和刈割组合的成套技术，可以提高蜈蚣草的修复砷污染土壤的修复效率。经过多年的努力，利用蜈蚣草修复砷污染的土壤已在实践中取得了成功(廖晓勇等，环境科学学报，2004)。目前，如何进一步提高蜈蚣草修复效率，拓展植物修复技术应用能力是当前国内外的研究焦点。

发明内容

本发明的技术解决问题：克服现有植物修复技术的不足，提供一种强化植物修复砷污染场地的微生物菌剂及其制备和应用方法，能够大大提高蜈蚣草修复效率，拓展植物修复技术应用能力。

本发明的技术解决方案：一种强化植物修复砷污染场地的微生物菌剂，所述微生物菌剂为农杆菌属Agrobacteriumsp.C13发酵的菌液与复合载体按质量百分比0.5～1∶1混合制备而成；所述复合载体为草炭上、稻壳、锯术和活性炭，它们细度均为60目，按质量百分比30∶25～30∶25～30∶15混合而成。复合载体的微生物吸附量达到10⁹～10¹²个/克。

所述的农杆菌属Agrobacteriumsp.C13发酵菌液是在高氏一号培养基中发酵18～24h，发酵培养经过一级斜面培养基培养、二级三角瓶液体培养、三级发酵罐发酵，发酵后菌液中菌数为10⁹～10¹²个/mL。

一种强化植物修复砷污染场地的微生物菌剂的制备方法，步骤如下：

(1)菌种发酵

a.一级斜面培养基

蛋白胨0.5％、牛肉膏0.3％、氯化钠0.5％、琼脂1.5％、pH7.0～7.2，将培养基装入试管；无菌；将农杆菌属Agrobacteriumsp.C13接种；在28℃下培养18-24h保存备用；

b.二级三角瓶液体培养

在步骤a中一级斜面培养基主料中去掉琼脂，作为二级培养主料，pH7.0～7.2，将培养基装入三角瓶，灭菌冷却后，把斜面菌液接种至液体培养基；在28℃下振荡培养18-24h，终止培养，备用；

c.三级发酵罐发酵

发酵罐内培养主料与二级培养主料相同，将二级培养液按1～5％的接种量接入发酵罐中，进行发酵培养，条件为：罐温30～35℃、罐压0.02～0.05MPa通气量1∶1v/v/min、搅拌速度300～350转/min、发酵时间24～36h，生产出来的发酵液备用；

(2)将草炭土、稻壳、锯末、活性炭，用高速粉碎机粉碎过60目，然后按照按质量百分比30∶25～30∶25～30∶15混合而成；

(3)将步骤(1)中得到的发酵液与步骤(2)中的复合载体按质量百分比0.5～1∶1的比例均匀混合。

一种强化植物修复砷污染场地的微生物菌剂的应用方法，将制备好的的微生物菌剂按5g/kg土用量施加到应用蜈蚣草修复的砷污染场地中。

本发明与现有技术相比的优点：

(1)本发明以草炭土、锯末、稻壳、活性炭4种材料为载体，它们都具有来源广泛、成本低廉、使用方便、保藏期长等优点，制备方法简单，易于实现大规模生产，因而能被广泛推广应用。

(2)本发明提高了微生物菌剂的质量、筛选出来的复合载体与现有的单一菌剂载体相比，有效活菌数明显增多。

(3)本发明选用的菌种生长、繁殖能力及适应性较强，并能保证在砷污染环境中对蜈蚣草吸砷能力有较大的促进作用。

(4)本发明将制备好的菌剂按5g/kg土用量施加到应用蜈蚣草修复的砷污染场地中，修复植物地上部生物量提高了16-17％，场地中砷的去除率比对照提高了40-41％。

(5)本发明解决了液态菌剂保存和运输都不方便的问题，将微生物制剂制成固体菌剂，以便于工程应用。

附图说明

图1为不同载体菌含量随时间的变化；

图2为蜈蚣草地上部生物量；

图3为土壤中砷的去除量。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明

实施例1强化修复的菌剂制备

(1)菌种发酵：

a.一级斜面培养

蛋白胨0.5％、牛肉膏0.3％、氯化钠0.5％、琼脂1.5％、pH为7.2，将培养基装入试管；无菌；将农杆菌属Agrobacteriumsp.C13接种；在28℃下培养24h保存备用；

b.二级三角瓶液体培养

在步骤a中一级斜面培养基主料中去掉琼脂，作为二级培养主料，pH为7.2，将培养基装入三角瓶，灭菌冷却后，把斜面菌液接种至液体培养基；在28℃下振荡培养24h，终止培养，备用；

c.三级发酵罐发酵

发酵罐内培养主料与二级培养主料相同，将二级培养液按1～5％的接种量接入发酵罐中，进行发酵培养，条件为：罐温30℃、罐压0.03MPa通气量1∶1v/v/mi n、搅拌速度300转/min、发酵时间36h，生产出来的发酵液备用；

(2)载体原料获取：草炭土、稻壳、活性炭购自北京市花卉市场，锯末取自北京市房山区。

(3)不同复合载体比较：草炭土、稻壳、锯末、活性炭，用高速粉碎机粉碎过60目。按照表1所述比例混合，灭菌备用。将发酵液与各比例复合载体按质量百分比0.5~1∶1的比例均匀混合。

在不同时间段内检测不同配比复合载体有效活菌数量。结果如图1所示，5种复合载体菌含量总体变化规律是一致的，即都表现出随时间先减少后增多。产生这种现象的原因是因为由于微生物从液体环境到固体环境，微生物处在生长停滞期，造成接菌后的两天中菌数迅速下降。当微生物逐渐适应载体环境后迅速繁殖，菌含量急剧增加，这时微生物处在快速生长期，生长第六天趋于稳定。复合载体4和5的有效活菌数最多，效果最好。即载体中草炭土、锯末、稻壳、活性炭的质量百分比为30∶25~30∶25~30∶15是最佳比例。

表1复合载体的配比

(4)菌剂制备：将最佳比例载体与发酵液按照比例混合，无菌条件下风干水分保持在30％左右，以松散不结块为准，分装备用。

实施例2，微生物菌剂室内实施

用上述方法制备的菌剂进行室内盆栽实验。菌剂中有效活菌量10⁹～10¹²个/克。

具体实施方法为：在1kg高砷土中施加5g菌剂，混合均匀后，装入盆中，移栽蜈蚣草幼苗。种植两个月后，收获。

从图2可以看出，施加菌剂后蜈蚣草地上部生物量干重达到2.1g，比对照提高16％。

从如图3可以看出蜈蚣草地上部砷富集量达到3.1mg，比对照提高了41％。

从以上实验结果可以看出，施加耐砷菌剂，明显促进了蜈蚣草的生长，且蜈蚣草地上部富集砷的量也明显增加，砷污染土壤的植物修复效率明显提高。