具有低桔霉素表达与高红色素表达特性的重组红曲霉菌

摘要

本发明涉及一种具有低桔霉素表达与高红色素表达特性的重组红曲霉菌，该菌株命名为紫色红曲霉ZD19，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208199，其基因组上存在的桔霉素合成相关基因ctnR基因被敲除，由红曲霉聚酮合成酶基因pks1基因序列取代ctnR基因序列，且该菌的基因组内不含外源抗性基因。本发明还提供该红曲霉菌的制备方法，包括以下步骤：用红曲霉聚酮合成酶基因pks1基因序列通过同源重组方式置换红曲霉菌基因组内的桔霉素合成相关基因ctnR基因，然后利用桔霉素对枯草杆菌的抑制特征作为遗传标记进行目标重组子的筛选。本发明还提供了将所述的红曲霉菌用于制备红曲色素的用途。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域和基因工程领域，涉及一种新的基因改造的红曲霉菌，尤其是一种具有低桔霉素表达与高红色素表达特性的红曲霉菌，并涉及该红曲霉菌的制备方法，以及该红曲霉菌的用途。

背景技术

紫色红曲霉(Monascus purpureus)是食用色素和降血脂药物的重要生产菌，其发酵物红曲也常常直接食用。该菌已用于食品添加剂红曲色素、抗血脂药物洛伐他汀等生产。

自Blanc等(1995，Int.J.Food Microbiol.27(2-3)：201-213)通过质谱分析等方法确定红曲霉色素中的抑菌物质monascidin A为桔霉素以来，红曲的食用安全性受到质疑，对红曲相关产品的销售产生了影响。桔霉素是一种聚酮类的真菌次级代谢物，对包括人类在内的脊椎动物具有慢性肾毒性和肝毒性作用。我国红曲色素中桔霉素含量与国际标准相比普遍超标，使我国传统食品添加剂红色素的国际声望及出口贸易造成很大影响。

为了降低红曲产品的桔霉素产量，近年一些研究者已开始进行红曲霉的菌种改良及生产工艺的改良研究。通过培养条件或工艺的改良可能使桔霉素含量降低，但此法不是最有把握的和最有效的方法，因为桔霉素和红色素等产物总是同步产生，它们同属于聚酮类化合物，有相似的合成途径。

有人应用传统育种方法对红曲霉菌进行遗传育种，如通过物理方法(紫外线照射等)和化学方法(EMS等)诱变可以获得一些较低桔霉素的菌株(王雅芬和袁康培，2003，食品科学，24(8)：93-96)，但由于传统诱变多数没有完全破坏桔霉素合成基因，其回复突变的可能性明显存在。(Wang et al.2003，JInd Microbiol Biotechnol，30(11)：669-676；Wang et al.，2004，J.Agric FoodChem.，52(23)：6977-6982)

红曲霉菌另一类育种方法是基因工程育种，即分子育种。Shimizu等(2005，Appl.Environ.Microbiol.71(7)：3453-3457)，周礼红等(2005，江南大学博士论文)以及Fu等(2007，Asia Pac.J.Clin.Nutr.suppl.1：137-142)均针对桔霉素合成基因pksCT进行敲除并获得降低桔霉素的效果；2007年Shimizu等(2007，Appl.Environ.Micrbiol.73(16)：5097-5103)把敲除目标瞄准到pksCT基因的转录激活因子ctnR基因，结果也得到降低桔霉素产量的效果。但这些方法的问题是：基因操作中整合了潮霉素等抗药性基因，如果用于生产将会产生食品安全和生态安全隐忧；和/或者pksCT的敲除会影响了红色素或洛伐他丁(lovastatin)等有用产物的合成，因为桔霉素合成途径和红色素、洛伐他丁的合成途径有密切关系。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有低桔霉素表达与高红色素表达特性的红曲霉菌。

本发明所述的一种具有低桔霉素表达与高红色素表达特性的重组红曲霉菌，该菌株命名为紫色红曲霉ZD19，即Monascus purpureus ZD19，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208199，其基因组上存在的桔霉素合成相关基因ctnR基因被敲除，由红曲霉聚酮合成酶基因pks1基因序列取代ctnR基因序列，且该所得菌株的基因组内不含外源抗性基因。

本发明还提供了一种具有低桔霉素表达与高红色素表达特性的红曲霉菌的制备方法。

本发明所述的重组红曲霉菌的制备方法，包括以下步骤：用红曲霉聚酮合成酶基因pks1基因序列通过同源重组方式置换红曲霉菌基因组内的桔霉素合成相关基因ctnR基因，然后利用桔霉素对枯草杆菌的抑制特征作为遗传标记进行目标重组子的筛选，选择对枯草杆菌没有抑菌圈或抑菌圈变小的红曲霉菌落，从而获得所述的具有低桔霉素表达与高红色素表达特性的红曲霉菌。

本发明还提供了一种具有低桔霉素表达与高红色素表达特性的重组红曲霉菌的用途，即将所述的红曲霉菌用于制备红曲色素的用途。

本发明在生物信息学指导下，应用重叠延伸PCR(gene splicing byoverlap extension PCR，SOE PCR)技术制备桔霉素合成酶基因pksCT的转录激活因子ctn R两端的无效等位基因片段，通过限制性内切酶介导(REMI)的方法转化红曲霉孢子原生质体，借助基因组同源重组原理实现该转录激活因子的敲除。转化子通过桔霉素自身的对枯草芽孢杆菌的抗性进行筛选，整个过程不涉及任何抗生素标记。高效液相色谱及色价分析表明，工程菌株具有较低的桔霉素含量和更高的红色素含量。

本发明所述的基因改造的红曲霉菌，具有以下特点和优点：

(1)以自身聚酮合成基因pks1作为替换片段，通过同源重组，取代或部分取代了桔霉素合成基因pksCT的转录激活子基因ctnR。

在已报道的文献中，均是采用抗药性基因如潮霉素等抗药性基因来作为置换片断，这样虽然便于检测到突变的菌株，但基因操作中整合了潮霉素等抗药性基因，如果用于生产将会产生食品安全和生态安全隐忧；而且由于桔霉素合成途径和红色素、洛伐他丁的合成途径有密切关系，这种pksCT的敲除方案会影响红色素或洛伐他丁等有用产物的合成，因此所得的新菌株应用价值不大。而本发明采用了新的设计思路，以自身的非桔霉素合成相关的聚酮合成基因pks1序列代替了桔霉素合成基因pksCT的转录激活子基因ctnR，然后筛选出抑菌能力降低的克隆。该桔霉素基因敲除的新方案既可以破坏桔霉素合成酶基因的转录，又不影响甚至可能加强红曲色素的合成。

(2)在基因敲除操作中不需要整合抗药性基因作为筛选重组体的遗传标记，目标重组体的检出依赖桔霉素本身的抑菌特性。本发明利用了桔霉素对枯草杆菌的抑菌作用实现对野生型的淘汰，重组菌株对枯草芽孢杆菌抑菌圈缩小或消失为桔霉素基因敲除的标志。至今报道的对该菌的pksCT或者ctnR基因的敲除实验均没有应用本发明的筛选方法，而多应用抗药性标记筛选。

(3)获得的重组菌株桔霉素含量比原菌株大大下降，而红曲色素产量没有受到影响，反而有所升高。在已有的报道中，桔霉素基因敲除所得的菌株一般引起红色素产量的下降。而根据本发明所述的实验，新的重组菌株的桔霉素产生量比野生菌株的桔霉素产生量约下降55％，而并没有减弱红曲色素的生成，红色素产生量比野生菌株反而有所增加，增加高达33％或更高。

附图说明

图1为本发明所述的ctnR基因敲除原理和流程示意图；

图2为用于重组的各基因片段的PCR产物的电泳鉴定图谱；图中，M1为分子量标记DL2000；M2为分子量标记DL15000；1，3分别为ctnR基因的前面部分(A)和后面部分(B)；2为用于置换ctnR基因的pks1部分(C)；4为A+C；5为B+C；6为融合基因(A+C+B)；

图3为本发明所述的重组红曲霉的获得和发酵流程图；

图4为本发明所述的重组子分子鉴定的相关序列图。图中第6行从左至右第24个碱基开始为引物F2(41bp)，其前面的序列与C片段(pks1)的末端序列完全一致，而其后的序列与B片段完全一致，表明B左侧的ctnR序列已被pks1序列取代。

具体实施方式

实施例一红曲霉菌ctnR基因的敲除

1、红曲霉基因组DNA制备

采用发酵工业通用的红曲霉菌株TY0701作为出发红曲霉菌株，经发明人所在实验室传代保存。

红曲霉基因组DNA通过下述步骤制备：1)从培养了10d的PDA平板上刮下菌丝体，滤纸吸干，称重为200mg。2)锡纸包裹称重后的菌丝体置于液氮中冷冻10min；3)取1ml CTAB(2×)于通风厨内加β-巯基乙醇20μl(终浓度2％)，65℃水浴待用；4)取预冷冻于-20℃的研钵置于冰上，擦干，加入少量石英砂，然后加液氮2次预冷研钵；5)将冷冻的菌丝体加至研钵中，研磨成粉状，约10min；6)将研磨后的粉末转移至1.5ml EP管中，加65℃预热的CTAB，枪头轻轻吸打混匀，颠倒2-3次后置于65℃水浴30min。水浴结束后取出，自然冷却至室温，分成2管操作；7)加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，12000rpm离心5min。取上清至一个新的1.5ml EP管；8)重复一次；9)加DNase Free的RNase I至终浓度20μg/ml，37℃温浴30min以消除RNA的影响；10)加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次；11)上层水相加1/10体积NaAc(3M，pH5.2)颠倒混匀，-20℃放置1h；12)12000rpm离心10min，弃去上清；13)沉淀用70％乙醇洗涤2次，干燥10min，加50μl TE Buffer(pH8.0)充分溶解。14)取3μl进行电泳检测，其余以15μl/管分装后于-20℃保存。

2、用于重组的各基因片段的制备

以红曲霉菌出发菌株基因组DNA为PCR模板，通过以下各组引物制备基因替换片段。

根据红曲霉聚酮合成酶基因pks1基因(GenBank登录号：AJ414729)和桔霉素合成相关基因ctnR基因(GenBank登录号：AB243687)设计PCR扩增所用引物。

1)制备ctnR左侧(orf1)序列片段A(1957bp)，PCR扩增所用引物为：

F1：5’GGCCAAGCTT CTTGCTCCTGACCAGATTGT 3’(SEQ ID NO.1)

R1：5’ATTGACGAATGGCGGAATATCCCACTGACTTTGCGGACTTTAT 3’(SEQ ID NO.2)

PCR条件：预变性94℃，4min；变性94℃，30s；复性55℃，30s；延伸72℃，2min30s；30个循环。

2)制备ctnR右侧(orf3)片段B(1530bp)，方法条件同上，但引物为：

F2：5’TAAGAGCGTTTGGACCAGGCCGGCGTTCATAAGGTTGGTTA 3’(SEQ ID NO.3)

R2：5’GGCCAAGCTT GTGAGCGAAGCCCTGTCT 3’(SEQ ID NO.4)

3)制备替换片段C，扩增目标为pks1(2125bp)，引物：

F3：5’ATAAAGTCCGCAAAGTCAGTGGGATATTCCGCCATTCGTCAAT 3’(SEQ ID NO.5)

R3：5’TAACCAACCTTATGAACGCCGGCCTGGTCCAAACGCTCTTA 3’(SEQ ID NO.6)

方法和PCR条件同上。

4)PCR产物的电泳鉴定电泳条件：0.8％琼脂糖凝胶，恒压80v，电泳30min。结果如图2。电泳图谱显示所得PCR产物大小与设计预测相符。

3、重组片段的融合

本发明所述的ctnR基因敲除原理和流程示意图如图1所示。因为引物R1和F3，R3和F2设计了相互粘性末端，可以使产物相互套叠，因而上述PCR产物A(1.9kb)片段和C(2.1kb)片段可以连接并通过引物F1和R3扩增获得“A-C”片段；C和右侧B(1.5kb)片段可以连接并通过引物F3和R2扩增获得“C-B”片段，把产物“A-C”和“C-B”放到一起变性退火将形成“A-C-B”的连接方式，最后通过引物F1和R2扩增得到大量“A-C-B”片段产物(图2)，该产物通过红曲霉原生质体转化继而同源重组把ctnR基因替换，得到低桔霉素的菌株，整个流程如图3所示。

实施例二低桔霉素含量的重组体的筛选和检出

1.红曲霉原生质体制备

1)将玻璃纸上菌龄为40-50h菌丝体洗脱下来，置于5mmol的DTT溶液中浸泡20-30min；无菌水洗涤后用灭菌滤纸吸干，转入无菌三角瓶中；

2)往三角瓶中加入一定量的(每三皿的菌丝体加10ml)以1M的MgSO₄溶液为溶剂配制的酶解液(蜗牛酶∶溶菌酶∶纤维素酶＝0.6％∶0.4％∶0.8％)和少量的已灭菌的石英砂；无菌状态下30℃，100rpm，酶解；

3)过滤，滤液于3,200rpm，离心10min；弃上清，用预冷的1M MgSO4溶液重悬沉淀；

4)重复3)，平均分成等体积的两小管。

5)此等体积的两小管分别重复3)步骤，最后两小管分别用等体积的预冷的1M MgSO₄溶液和无菌水重悬沉淀(对照)，使其达到要求细胞浓度，用于转化。

2.REMI法原生质体转化

1)将原生质体液通过等渗溶液调整至120μl冰上放置10min；

2)取20μl作为对照，其余加入纯化的融合基因片段10μl轻轻混匀；

3)加入HindIII内切酶11μl，约100个单位；手指轻弹混匀，冰上放置30min；

4)稀释10^-4倍，接种于预先涂布枯草芽孢杆菌过夜培养物的再生PDA平板，30℃倒置培养。

5)挑取对芽孢杆菌的抑菌圈变小的菌落转移至新的PDA平板上纯化培养，获得疑似重组子。

3.目的转化子筛选及验证

1)从上述平板中挑取对枯草杆菌没有抑菌圈或抑菌圈变小的红曲霉菌落。转接抗生素平板，排除枯草芽孢杆菌；

2)重复枯草杆菌平板筛选以验证抑菌圈特征，获得抑菌圈明显缩小的菌株ZD19，ZD4等重组子。

3)重组子的分子鉴定

根据替换序列pks1和ctnR右侧的pksCT特有区域设计PCR引物，以检查ctnR是否被pks1替换。以重组子基因组DNA为模板，PCR产物经电泳显示了片段大小的合理性，再经测序，正确显示了融合置换片段的整合位置，ctnR位置已由pks1序列代替(图4)。图4中，第6行从左至右第24个碱基开始为引物F2(41bp)，其前面的序列与C片段pks1)的末端序列完全一致，而其后的序列与B片段完全一致，表明B左侧的ctnR序列已被pks1序列取代。

实施例三红曲霉重组子ZD19发酵菌丝体的色素和桔霉素检测

红曲霉重组子ZD19斜面菌种接种液体米粉培养基(米粉6％、黄豆粉3％、NaNO₃ 0.3％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.3％，调节发酵液初始pH值为3)，30℃，150rpm培养7d，提取桔霉素并通过高效液相色谱进行桔霉素含量分析。通过HPLC分析可知，桔霉素标杆的出峰时间为18.195min，出发菌株发酵液的桔霉素含量为0.56μg/ml，重组子发酵液的桔霉素含量为0.25μg/ml；桔霉素下降了55％。测定结果见表一。

表一：出发菌株与重组菌株ZD19经发酵产生的桔霉素和红色素的比较

  菌株  桔霉素(μg/mL)  菌丝体色价(u/g)  出发菌株  0.56  6371.3  重组菌株ZD19  0.25  7642.5

结果：重组菌株ZD19所产生的桔霉素比出发菌株所产生的桔霉素降低了55％，而重组菌株ZD19所产生的红色素比出发菌株所产生的红色素增加了19.6％。

实施例四红曲霉ZD19菌株混合发酵物的色素和桔霉素分析

米粉培养基

米粉：                7％

蛋白粉：              3％

NaNO₃：               0.3％

KH₂PO₄：              0.3％

MgSO₄·7H₂O：         0.3％

调节pH至3.0-3.5，

培养条件：34℃，180rpm培养9天

发酵物红曲色素和桔霉素分析：

1.红曲色素分析：取1毫升发酵液(均匀研磨)+9毫升70％乙醇，60℃水浴30min；滤纸过滤；取300微升+2.7毫升70％乙醇，混匀测OD₅₀₅(总稀释倍数为100倍)。

(色价计算公式：色价＝总的稀释倍数×OD₅₀₅值)

表二：出发菌株与重组菌株ZD19发酵所产生的红色素的比较

结果：出发菌株在发酵过程中所产生的红色素变化不大，而重组菌株ZD19在发酵第8天时产生的红色素达到最高峰，同比增加了33％。

2.发酵物桔霉素测定：第8天取样提取桔霉素进行检测

取5毫升发酵液(均匀研磨)+10毫升无水乙醇，60℃水浴2h(中途不时摇晃)；取1毫升溶液，12000rpm，离心10min；取上清500微升再次12000rpm，离心10min；取上清200微升进行HPLC。

表三：出发菌株与重组菌株ZD19发酵所产生的桔霉素的比较

结果：在发酵第8天时，重组菌株ZD19所产生的桔霉素比出发菌株相比降低了55％。

SEQUENCE LISTING(序列表)

<110>东莞市天益生物工程有限公司

     周世宁

<120>具有低桔霉素表达与高红色素表达特性的重组红曲霉菌

<130>

<141>2008-12-22

<160>6

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

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<210>2

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