一种CXC趋化因子受体4(CXCR4)拮抗多肽

摘要

一种具有以下氨基酸序列：Z

说明书

本发明的领域

本发明涉及CXC趋化因子受体4(CXCR4)拮抗多肽(蛋白)，它能抑制CXCR4依赖型病毒，如HIV-1的感染，并且阻断与CXCR4结合的CXCL12所介导的肿瘤细胞转移：人类循环抗病毒白蛋白片段(ALB408-423)及其治疗和诊断用途。本发明包括天然存在形式的ALB408-423以及由它衍生的片段和/或类似物或衍生物，以及最终的含有所述天然，重组和合成肽的药品，它被用于医学指示，并被用作诊断剂。另外，本发明包括ALB408-423的修饰形式和衍生物，它具有特别有效的治疗效果。另外，还包括能与ALB408-423杂交的核酸探针或它的片段之一和/或衍生物，和针对ALB408-423或它的片段之一和/或衍生物的抗体或拮抗剂，其用于诊断或治疗目的，特别是用于治疗HIV-1和HIV-2感染等病毒性疾病的治疗目的，以及用于治疗肿瘤病患，以便预防癌细胞转移或用于治疗慢性炎性疾病，如哮喘，肺纤维化或类风湿性关节炎等。

本发明背景

趋化因子受体是在某些细胞表面上表达的，它能与被称为趋化因子的细胞因子相互作用。CXC趋化因子受体4(CXCR4)是G-蛋白结合受体，它能转导它的内源配体，即趋化因子CXCL12(基质细胞衍生的因子-1，SDF-1)的信号。在CXCR4/CXCL12相互作用之后，启动了细胞内钙(Ca²⁺)离子流通。这导致了一些细胞响应，包括允许细胞在有机体内移动的趋化现象。CXCR4是在骨髓细胞，T-淋巴细胞，B-淋巴细胞，上皮细胞，内皮细胞和树状细胞上表达的。趋化因子CXCL12是唯一已知的CXCR4的刺激性配体。CXCL12和CXCR4之间的相互作用，在心血管，造血或中枢神经系统处于胚胎发育期间的祖细胞迁移方面起着关键作用。已知这种相互作用与若干疾病相关，如HIV感染/AIDS，癌细胞转移，白血病细胞发展，肺纤维化和类风湿性关节炎等。该相互作用可能是上述所有疾病的关键治疗目标。干扰CXCR4/CXCL12信号传导的物质被认为具有药物潜力，例如，用于HIV/AIDS治疗，或预防和癌转移相关的细胞转移过程，白血病，以及炎性疾病，如肺纤维化，类风湿性关节炎或哮喘等(参见Tsutsumi et al.，2007，Peptide Science 88：279-289)。与CXCL12之类的诱导细胞响应的受体刺激剂相反，受体拮抗剂是在与它们的受体结合之后不能诱导生物学响应，即细胞转移或钙离子信号传导的配体或药物。受体拮抗剂是业已在临床上使用的有用药物(例如，血管紧缩素拮抗剂，β-肾上腺素能拮抗剂，血清素拮抗剂或CCR5拮抗剂)，它能抑制HIV-1感染(CCR5拮抗剂)或减弱刺激剂介导的细胞响应。受体拮抗剂与所述受体的相互作用能抑制刺激剂的功能。大部分药物拮抗剂是通过在受体的结构限定的结合位点上与内源配体或底物竞争实现它们的效力。

业已在体外和体内证实，CXCR4拮抗剂能抑制癌细胞转移，并因此抑制肿瘤转移。CXCR4是在多种细胞(骨髓细胞，T-淋巴细胞，B-淋巴细胞，上皮细胞，内皮细胞和树状细胞)的表面上，以及在23种不同类型的癌细胞中表达的。CXCL12-CXCR4相互作用与若干种类型的癌的转移相关，包括乳腺癌，肾癌，前列腺癌，肺癌和胰腺癌，以及黑素瘤，成神经细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，卵巢癌，和恶性脑瘤(参见Tsutsumi et al.，2007，Peptide Science 88：279-289)。业已证实，CXCR4拮抗剂，如T140类似物能抑制CXCL12诱导的胰腺细胞转移和入侵或乳腺癌细胞转移，在体外和体内试验中都是如此(参见Tsutsumi et al.，2007，Peptide Science 88：279-289)。业已证实，CXCR4拮抗剂能在体外有效抑制小细胞肺癌(SCLC)的入侵和粘连(参见Tsutsumi et al.，2007，Peptide Science 88：279-289)，证实了CXCL12-CXCR4相互作用与SCLC转移的相关性。CXCR4/CXCL12相互作用还与先兆-B(pre-B)急性成淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)的发展相关。CXCR4拮抗剂还能减弱pre-B ALL细胞的转移(参见Tsutsumiet al.，2007，Peptide Science 88：279-289)。另外，业已证实，类风湿性关节炎是表达CXCR4的CD4+记忆T细胞在发炎的滑膜中积累导致的。CXCL12浓度在类风湿性关节炎患者的滑膜中大幅度提高，从而吸附记忆T细胞。CXCR4拮抗分子能阻止记忆T细胞向所述滑膜转移(参见Tsutsumi et al.，2007，Peptide Science 88：279-289)。

CXCR4拮抗剂不仅能抑制刺激剂CXCL12与CXCR4结合，而且还能抑制HIV糖蛋白gp120与CXCR4的相互作用，从而抑制病毒感染。人类免疫缺陷病毒1和2(HIV-1和HIV-2)使用细胞表面表达的CD4作为主要受体，使用趋化因子受体CCR5或CXCR4作为细胞进入的辅助受体。通过CD4和CXCR4感染细胞的病毒被称为嗜CXCR4(X4)病毒，HIV-1变体使用CD4和CCR5感染细胞称为嗜R5病毒，而可使用这两种辅助受体的病毒被称为双嗜性病毒。嗜X4的HIV-1变体仅出现在大约50％的AIDS患者体内，而嗜R5的HIV变体在HIV-1感染的早期阶段和无症状阶段占主导地位。业已证实，通过用AMD3100之类的CXCR4拮抗剂治疗细胞或患者，能在体外以及HIV-1感染的人体内抑制嗜X4的HIV-1感染。值得注意的是，一种CCR5拮抗剂Maraviroc，是第一个临床上批准的用于AIDS治疗的药物，它能抑制嗜R5的HIV-1变体感染(参见Tsibris和Kuritzkes，2007，Annual Review of Medicine 58：445-459)。

因此，趋化因子受体CXCR4是用于治疗HIV/AIDS、癌相关的病理和慢性炎性疾病，如哮喘或肺纤维化等有吸引力的治疗剂。抑制CXCL12介导的细胞响应的CXCR4拮抗剂能够抑制疾病发生和发展的重要途径。

本发明概述

本发明涉及具有以下氨基酸序列的肽：

Z₁-LVRYTKKVPQVSTPTL-Z₂(ALB-408)

及其生物学活性衍生物，特别是酰胺化，乙酰化，硫酸化，磷酸化和/或糖基化衍生物，以及通过多重合成获得的具有ALB408-423的生物学活性的肽；

其中，Z表示0-10个氨基酸残基的数字。

本发明还涉及本发明的如下所述的肽，特别是本发明的ALB408-423肽，其中，所述序列上的一个或若干个氨基酸残基被交换，缺失或添加；或在本发明的肽，特别是ALB408-423的单一氨基酸上引入了化学修饰，它具有与本发明的肽，特别是ALB408-423相似或相同的生物学或药理学活性。特别考虑的是，可以通过保守方式交换所述序列的氨基酸而方便地获得的肽。就是说，用疏水性氨基酸交换疏水性氨基酸，或用芳族氨基酸交换其他芳族氨基酸或用碱性氨基酸交换其他碱性氨基酸等。这一点是技术人员所熟知的。

另外，本发明肽的逆反(retro-inverso)肽也属于本发明的范围，还包括能稳定所述肽与肽酶结合的其他衍生物。

所谓“衍生物”表示所有长度的片段，包括在N和C末端截短的片段，含有包括D-氨基酸残基和修饰的氨基酸残基在内的氨基酸残基取代的ALB408-423，以及包含二硫键和在N和C末端延长的肽。

本发明的另一个主题是编码本发明的肽，特别是编码ALB408-423和/或其衍生物的多核苷酸。本发明的多核苷酸的特征在于是由DNA，RNA，基因组DNA或PNA组成。编码本发明肽的多核苷酸可用于在原核或真核细胞中的重组肽表达，诱变研究，克隆在感兴趣的载体中，特别是可用于基因转移目的。

本发明的另一个主题是含有本发明多核苷酸的载体。编码本发明肽的编码多核苷酸序列的载体可用于在原核细胞或真核细胞中进行重组肽表达，诱变研究，特别是用于将ALB408-423基因转移到真核细胞中。

本发明的另一个主题是含有本发明载体的遗传工程的宿主细胞。可以将能表达遗传工程的ALB408-423或相关衍生物的转基因细胞用于基因治疗法，以便ALB408-423和相关的衍生物在需要CXCR4拮抗剂的个体，特别是癌症和AIDS患者体内进行表达和分泌。

本发明的另一个主题是针对本发明多肽的抗体。所述抗体可用于通过ELISA，RIA或免疫荧光法检测身体样品，如血液，血清，血浆中的ALB408-423及相关肽，以便用于诊断目的。

本发明的肽可在需要以本发明的肽，特别是ALB408-423进行治疗的患者的治疗法中施用。

本发明的另一个主题是对需要ALB408-423抑制作用的患者的治疗方法，包括通过施用治疗剂量的本发明的肽拮抗剂/抑制剂。ALB408-423及其衍生物是CXCR4拮抗剂，可以治疗若干疾病，如HIV感染/AIDS，癌细胞转移，白血病细胞发展，肺纤维化和类风湿性关节炎，以及其他癌症和炎性疾病。

本发明的另一个主题是由本发明的多肽组成的盖仑(galenic)制剂。

根据本发明，还提供了用于治疗患者的方法，其中，所述多肽的治疗作用效果是通过服用编码本发明肽的DNA并在所述患者体内进行体内表达实现的。

本发明的肽可以通过下述方法提供，该方法包括通过阳离子交换萃取法从血液滤液中萃取，然后洗脱吸附的物质，对含有所述肽的萃取物进行复原的阳离子交换层析，以及进行反相层析分馏。

另外，本发明肽的生产方法可以通过Merrifield合成法进行固相合成，或通过本领域技术人员本身公知的方法进行液相合成，其中使用经保护的氨基酸，并纯化。

用于生产本发明的肽的另一种方法采用本领域技术人员公知的异源表达法，使用常见的生物技术载体。

本发明的另一个主题是一种诊断剂，其含有本发明的多克隆或单克隆抗体或含有编码本发明的肽，特别是ALB408-423的核酸或mRNA。

本发明的诊断剂包括所述肽，或本发明的多核苷酸，用在检测系统中，用于分析该物质在诸如组织，血浆，尿液和脑脊髓液的样品中的含量。

具体地讲，所述诊断剂和检测本发明的肽的检测系统被用于分析该物质在组织，血浆，尿液和脑脊髓液中的含量，采用质谱法，如MALDI-MS或ESI-MS，并配合通过RP-HPLC，蛋白沉淀和/或固相萃取进行的样品制备。

本发明的另一个目的是一种诊断剂，它包括本发明的肽作为病毒类疾病，细菌和真菌感染，炎性和肿瘤进程的标识物，以及作为炎性进程，紊乱炎性反应，肿瘤疾病，生长失调，免疫系统疾病的标识物，以及作为骨病的标识物。

本发明还提供含有本发明肽作为活性成分的盖仑(galenic)型的药品，用于口服，静脉内，肌内，皮内，皮下，鞘内给药，以及作为气溶胶用于经肺给药。

本发明的肽，多核苷酸，抗体/拮抗剂，和galenic配方可用于治疗病毒性疾病，特别是HIV-1，HIV-2，细胞巨化病毒，单纯疱疹病毒(1型和2型)，水痘带状病毒，甲肝和乙肝病毒，流感病毒，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒，风疹病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒，劳氏肉瘤病毒，爱波斯坦-巴尔病毒，以及用于治疗细菌和真菌感染，炎性过程，紊乱的炎性反应，肿瘤疾病，生长疾病，神经元疾病，凝血和造血作用疾病，血管病，免疫系统疾病，和用于伤口和骨骼愈合。

下面将以ALB408-423作为具体例子对本发明作更具体说明。可以理解为，在以下说明中，本发明的所有肽均可以取代ALB408-423。

本发明的详细说明

图1A-F表示从人类血液滤液中分离ALB408-423的细节。

图2表示含有能抑制HIV-1 NL4-3感染的含级份31的ALB408-423。

图3表示化学合成能特异性抑制嗜X4的HIV-1感染的ALB408-423。

图4表示ALB408-423能抑制嗜X4的慢病毒感染。

图5表示ALB衍生物的抗病毒活性。

图6表示ALB衍生物的抗病毒活性。

图7表示ALB衍生物的抗病毒活性。

图8表示ALB衍生物的抗病毒活性。

图9表示ALB衍生物的细胞毒性分析。

图10表示ALB408-423和截短的ALB衍生物能特异性抑制嗜X4的HIV-1感染。

图11表示ALB408-423和衍生物能抑制外周血单核细胞(PBMC)的嗜X4的HIV-1感染。

图12表示ALB408-423能抑制CXCL12与CXCR4的结合。

图13表示ALB408-423不是CXCR4，CCR5或CXCR1刺激剂。

图14表示ALB408-423能特异性抑制CXCL 12-引起的Ca²⁺在CXCR4表达细胞中的运动。

图15表示ALB408-423抑制CXCL12介导的CXCR4内在化。

图16表示ALB408-423以剂量依赖性方式抑制CXCL-12介导的Jurkat T细胞转移。

图17表示ALB衍生物的CXCR4拮抗活性。

令人吃惊的是，ALB408-423可以采用层析法和生物学分析从人血液过滤液中分离。本发明的肽的生物化学表征是通过质谱分析进行的，包括氨基酸的全序列分析。

所述肽具有下面的Seq ID No 8氨基酸序列：

LVRYTKKVPQVSTPTL

本发明肽ALB408-423的分子量为：

1830.2Da

本发明肽ALB408-423的等电点(pI)是10.3。

令人吃惊的是，本发明的肽是包括已知的人类血浆蛋白血清白蛋白(保藏号No.NP000468)的16个氨基酸的片段，所述血清白蛋白其加工过的形式由585个氨基酸组成。人类白蛋白是可溶性的单体血清蛋白，分子量为大约65,000，它占总的血浆蛋白的一半以上(浓度：3.5-5g/dl)。所披露的人类白蛋白其主要功能是作为所有类型的疏水和亲水物质的载体分子，例如类固醇和肽激素，脂肪酸，维生素，药物和阳离子。由于它具有很高的血清浓度，它对稳定血液pH，细胞外液体体积和维持胶体渗透压起着实质作用。白蛋白具有通过大量二硫键稳定化的球状结构，并且通常不被糖基化，不过，由于乙酰化，酶促糖基化和非酶促糖基化导致的变化经常在分子老化或病理生理学变化中发生。它是肝脏以前原白蛋白形式合成的，具有609个氨基酸；包括18个氨基酸的N-末端信号肽在进入内质网时进行细胞内裂解；另外6个氨基酸在包括585个氨基酸的成熟白蛋白由肝细胞分泌之前在高尔基体中被去掉。白蛋白的清除是通过肾脏，胃肠道，以及肝脏的组织细胞中进行的。

本发明的ALB408-423肽序列的起始氨基酸是408号氨基酸，因此包括循环形式的白蛋白的408-423号氨基酸，它明显是通过相应的蛋白酶对白蛋白前体进行天然加工产生的。

令人吃惊的是，本发明的肽是CXC趋化因子受体4(CXCR4)的拮抗剂，并且导致HIV-1感染和在人体细胞中复制的抑制作用，以及抑制CXCL12/CXCR4诱导的细胞反应，如细胞迁移，Ca²⁺移动或CXCR4内在化。

本发明的肽可以通过从人血液滤液(HF)中层析纯化获得。HF是在对肾病患者的血液进行超滤期间大量获得的(例1)。HF包括在人类血液中循环的分子量低于30kDa的所有肽和蛋白。HF中的肽和蛋白采用阳离子交换层析萃取。层析柱上结合的肽和蛋白使用各种pH值的缓冲液系统洗脱，并且对洗脱液进行反相层析(例1)。为了鉴定抑制HIV-1感染的级份，将肽的各级份溶解在PBS中，并且添加到HIV允许的指示细胞中。然后用嗜CXCR4的HIV-1感染细胞，并且在感染之后(dpi)三天测定感染率(例1)。一个级份表现出潜在的抗HIV活性，并且对它进行更多轮次的层析纯化和HIV抑制试验，以便鉴定出生物学活性肽(例1)。在经过四轮纯化之后，对活性级份31进行的质谱分析发现了分子量为1830Da的单肽(例2)。序列分析得出了LVRYTKKVPQVSTPTL的鉴定结果，序列比对发现与包括氨基酸残基408-423(ALB408-423)的数量丰富的血清蛋白“人类血清白蛋白；(ALB)”具有100％同源性(例2)。活性的验证得到了证实，因为化学合成的肽(例3)以剂量依赖方式抑制嗜X4的HIV-1感染(例4)。ALB408-423能特异性抑制嗜X4的HIV-1变体，但是在指示细胞中对嗜R5的HIV-1(例4和5)感染没有作用。ALB408-423还能抑制嗜X4的HIV-2感染(例5)。从结构活性相关性研究(SAR)中获得的用于鉴定有重要抗病毒活性的残基的数据归纳在例6中，并且表明了ALB408-423的N末端完整性对于它的抗病毒活性来说很重要。相反，在C末端截短高达6个氨基酸残基不会消除抗病毒活性。所述SAR研究还可以鉴定出ALB408-423衍生物，如ALB408-419或ALB L408I-419，与野生型ALB408-423相比，它们表现出更高的抗病毒活性(例6)。所述ALB衍生物无一是细胞毒性的(例7)。ALB408-423，ALB408-419和ALB L408I-419以剂量依赖方式抑制多种嗜X4的，但不是嗜R5的HIV-1变体在指示细胞(例8)或原代血单核细胞(例9)中的感染。上述所有数据表明了ALB408-423或其衍生物与HIV辅助受体CXCR4的特异性相互作用。

采用基于荧光的技术，可以证实ALB408-423直接与CXCR4结合并且相互作用，由此阻止CXCL12(天然CXCR4刺激剂)的结合(例10-12)。单独的ALB408-423或其衍生物不能通过CXCR4或其他趋化因子受体，如CCR5和CXCR1诱导Ca²⁺转移，这表明根据其定义ALB408-423是CXCR4拮抗剂(例10-12和14)。在存在ALB408-423的情况下，能够抑制CXCL12介导的细胞转移(例13)和CXCR4受体内在化，这进一步提供了ALB408-423是CXCR4拮抗剂的证据(例12)。综上所述，通过采用HIV-1感染抑制试验筛选HF衍生的肽文库鉴定出ALB408-423，一种人类血清白蛋白的片段。所述化学合成的肽及其衍生物通过与CXCR4受体直接相互作用，以剂量依赖方式抑制嗜X4的HIV-1和HIV-2感染。ALB408-423及其衍生物起着拮抗剂的作用，因为它们不能介导细胞反应并且抑制CXCL12(天然存在的CXCR4刺激剂)的活性。以上数据表明ALB408-423是第一种人类CXCR4拮抗剂。ALB408-423及其衍生物可用于治疗受嗜X4的HIV-1感染的个体，避免癌转移，并且干扰慢性炎性疾病，其中，这些病与CXCR4/CXCL12信号传导相关，并且通过CXCR4抑制CXCL12介导的信号传导。

本发明的肽和类似物，所述肽的片段和衍生物，它的cDNA，它的基因和可能中和ALB408-423活性的抗体可以被用作药品。它的生物学活性相应于病毒抑制，癌细胞转移抑制和CXCR4拮抗物质的活性。ALB408-423能特异性结合CXCR4，从而抑制嗜CXCR4的HIV-1变体感染并且避免其与天然CXCR4刺激剂CXCL12的结合。本发明的肽可以通过常见的肽给药方式以非肠胃，静脉内，肌内，鼻内，局部，皮下或口腔途径施用。所施用的肽的数量为每天每单位剂量1μg-1g。本发明肽的活性可以通过施用合适的抑制剂/拮抗剂来加以抑制。

本发明的诊断剂包括抗本发明肽的多克隆或单克隆抗体，可选择性地采用荧光标记或放射性标记形式，以便以本身已知的ELISA或RIA法使用。本发明的诊断剂包括DNA，RNA和/或PNA，可选择性地采用修饰的/或标记的形式，以便用于本领域技术人员公知的检测系统，如PCR或指纹识别。另外，本发明的诊断剂构成质谱分析方法(MALDI或ESI-MS)，该方法在经过了相应的样品制备和富集(通过沉淀分离大蛋白，通过层析或RP介质、固相萃取富集ALB408-423)以后，能从其单电荷或多电荷离子(亲代离子或MS-MS分裂之后的产物离子)明确地定量和定性地检测所述物质。

现在通过下面的实施例对本发明进行说明。

例1：

从人血液滤液中分离抗病毒活性ALB408-423

人血液滤液根据具体情况用水稀释和酸化。pH值优选为1.5-3.5，特别是2.5-3.0。然后，让所述血液过滤液通过阳离子交换剂，例如，用磺酸基团改性的载体材料(Fraktogel SP-650(M)，Merck，Darmstadt，Germany)。与所述阳离子交换剂结合的肽使用较高浓度的盐溶液洗脱。洗脱液的离子浓度大体相当于0.5-1M醋酸铵溶液的离子浓度。

收集到的洗脱液进行再一次阳离子交换层析.该层析优选用提高pH值的缓冲液进行分级洗脱。

含有本发明肽的级份采用制备反相层析进一步纯化，然后进行半制备反相层析，例如，在C18-改性的载体材料上进行。优选使用分析反相色谱，例如，在C18-改性的载体材料上，监测其纯化程度。

第一步：血液滤液批量萃取

用HCl将800-1000升的血液过滤液调整到pH值为2.7，并且用水稀释到电导率为5.5mS/cm，并将其填充到强阳离子交换剂上，流速为3l/min。

层析条件：

柱：     Vantage VA 250(Amicon，Witten，Germany)

柱材料： Fractogel TSK SP 650(M)，25cmx20cm

流速：   3l/min

检测：   280nm，pH，电导率

缓冲液A：血液过滤液pH 2.7，电导率5.5mS/cm

缓冲液B：0.5M乙酸铵

设备：Autopilot Chromatographic System(PerSeptive Biosystems，Wiesbaden，Germany)

在用一夜时间填充总共1,000升体积液体之后，用几个柱体积的5mM HCl漂洗。结合有肽的级份是以0.5M乙酸铵批量洗脱液形式洗脱的。以大约5升的洗脱液，借助斜坡式pH值(6.8-7.2)和斜坡式电导率(56mS/cm)达到所述肽的完全洗脱。

第二步：第一次制备分离(批号01/2003)

将批量萃取的乙酸铵洗脱液合并成10000升的血液滤液肽。在将pH调整到2.7之后，将所述肽萃取物填充到制备阳离子交换剂上，添加电导率为5.5mS/cm的完全脱盐的水。

层析条件：

柱：    Vantage 250VA

柱材料：Fractogel TSK SP 650(M)，25cmx20cm

流速：  在填充期间高达3l/min

        在洗脱期间为0.5-1l/min

检测：  280nm，pH，电导率

样品：  血液过滤液pH 2.7，电导率5.5mS/cm

设备：Autopilot Chromatographic System(PerSeptive Biosystems，Wiesbaden，Germany)

在填充之后，原始萃取物用时240分钟，用0.01M HCl漂洗所述柱，直到电导率低于1mS/cm为止。洗脱是使用下面给出的缓冲液分若干步骤完成的。

 缓冲液  pH值  缓冲物质  电导率  (mS/cm) 洗涤缓冲液  2.0  0.01MHCl  1 洗脱缓冲液1  3.6  0.1M柠檬酸一水合物  2.9

 缓冲液  pH值  缓冲物质  电导率  (mS/cm) 洗脱缓冲液2  4.5  0.1M乙酸  +0.1M乙酸钠  4.0 洗脱缓冲液3  5.0  0.1M苹果酸  6.2 洗脱缓冲液4  5.6  0.1M丁二酸  6.1 洗脱缓冲液5  6.6  0.1M NaH₂PO₄  4.9 洗脱缓冲液6  7.4  0.1M NaH₂PO₄  6.7 洗脱缓冲液7  9.0  0.1M碳酸铵  6.7

洗脱液1-7被命名为pH汇集库I-VII。它们是各自分别收集的，并且最终用完全脱盐的水漂洗。进行洗脱，直到达到新的基线，对于I-VII的每一个pH汇集库来说，洗脱体积达到10-25升。

第三步：第二次制备分离：

各个pH汇集库是通过反相层析分离的，以便分级并同时脱盐。

层析条件：

柱：     FineLine 100(Pharmacia，Freiburg，Germany)

柱材料： Source RPC，15μm

         10x12.5cm(FineLine 100)

流速：   150ml/min(FineLine 100)

检测：   280nm，电导率，pH

缓冲液A：10mM HCl

缓冲液B：用10mM HCl配制的80％乙腈

梯度：5×柱体积中的0-60％缓冲液B

在填充各个pH汇集库之后，用缓冲液A洗脱所述柱。在洗脱期间，收集200ml各级份。将所述级份冻干，并且在-20℃下保存。通过HIV抑制试验检测所形成的所述各级份的等分试样。来自pH汇集库II的级份6-8含有本发明的肽。

图1A-F：从人血液过滤液中分离ALB408-423。通过pH分步洗脱分级的所述血液过滤液再通过RP-HPLC分级，并且通过HIV抑制试验测定所获得的级份。对照：T20对照物。

A.分离的第三步。pH库2的RP分级后在级份6-8中表现出抑制活性。

B-E.第四-七步。纯化所述抑制活性物，直到获得纯的物质。

F.对纯化的ALB408-423进行质谱(MALDI-MS)和序列分析。

通过将4000P4-R5MAGI细胞接种在100μl的DMEM(10％FCS，100U/ml青霉素G，和100μg/ml硫酸链霉素)中进行HIV抑制试验(P.Charneau et al.，J.Mol.Biol.241：651，1994)。用LTR-lacZ框稳定转染P4-R5细胞，并且在被HIV-1成功感染之后将以Tat-依赖方式表达β-半乳糖苷酶，这种酶可以化学发光试验进行检测。次日，添加所述各级份的等分试样。为此，将冻干的级份重新悬浮在80μl的DMEM中，并且通过移液管分别将各25μl试液转移到P4-R5细胞中，在37℃下培养1小时，然后用HIV-1NL4_3感染(1ng的p24抗原)。病毒原株是以磷酸钙法通过前病毒DNA瞬时感染293T细胞获得的(CalPhos^TM Mammalian Transfection Kit，Clontech)。病毒原株是在转染之后48小时收获的，过滤并且用于感染。感染三天之后，采用GalScreen试验(Tropix)检测感染的P4-R5细胞中的β-半乳糖苷酶活性，按照生产商推荐的方法检测。简单地讲，除去上清液，添加40μl的PBS/GalScreen+底物的1∶1稀释液，然后在室温下培养30分钟。然后将30μl的裂解产物转移到96孔lumiplates中。然后，检测发光，以在照度计(Berthold，Orion)上的每秒钟的相对光照单位表示。从所有测量值中扣除未感染的对照细胞的平均β-半乳糖苷酶背景活性值。计算每一种感染样品相对不含肽的对照物(100％)的％感染值。将在没有ALB408-423的条件下测量的酶活性设定为100％，所有其他值都是以此为基础计算的。最终的纯化(第七步)在完全相同的条件下在TZM-b1细胞中检查(X.Wei et al.，Antimicrob.Agents Chemother.46：1896，2002)。

第四步：半制备反相C18层析：

通过半制备反相柱分离来自pH汇集库II的总共200mg(相当于1087升的血液滤液等同量)的级份6-8，所述级份在所述测定中具有生物活性(图1A)。级份33+34含有本发明的物质(图1B)。

层析条件：

柱：      4.7cmx30cm钢柱

填充材料：Bakerbond RP-C18，15-30μm，)

缓冲液A： 100％水，10mM HCl

缓冲液B： 80％乙腈，20％水，10mM HCl

梯度：    0-30％B，体积2000ml

流速：    40ml/min(压力：40bar)

检测：    214nm和280nm

层析设备：BioCad 250，Perseptive Biosystems

级份：    从梯度开始各50ml(min 10.75)

第五步：半制备反相C18层析：

通过类似的半制备反相柱，使用不同的流动相分离来自前面层析步骤的、经测定具有生物活性的级份33+34。随后的HIV感染试验表明，级份5+6含有本发明的物质(图1C)。

层析条件：

柱：      4.7cmx30cm钢柱

填充材料：Bakerbond RP-C18，15-30μm，)

缓冲液A： 30％甲醇，70％水，10mM HCl

缓冲液B： 100％甲醇，10mM HCl

梯度：    0-15％B，体积40ml

          15-60％B，体积1900ml

流速：    40ml/min(压力：30bar)

检测：    214nm和280nm

层析设备：BioCad 250，Perseptive Biosystems

级份：    从梯度开始各50ml(min 9.75)

第六步：分析反相C4层析：

通过分析用反相柱分离来自前面层析的生物活性级份5+6。通过生物测定(HIV抑制试验)检测等分试样。级份51-57包含本发明的物质(图1D)。

层析条件：

柱：      2cmx25cm钢柱

填充材料：RP-C4，5μm，，Biotek Silica，Germany)

缓冲液A： 水，0.1％TFA

缓冲液B： 80％乙腈，20％水，0.1％TFA

梯度：    0-5％B，时间2min，5-35％B，时间60min，35-100％B，时间3min

流速：    7ml/min

检测：    214nm和280nm

层析设备：Kontron

级份：    1min，各自从min 1开始

第七步：分析反相C18层析：

通过分析用反相柱分离来自前面的层析的生物活性级份51-57。通过生物测定检测等分试样。级份31含有纯的本发明物质(图1E)。

层析条件：

柱：      1cmx25cm钢柱

填充材料：RP-C18，5μm，，Vydac(Hesperia，USA)

缓冲液A： 水，0.1％TFA

缓冲液B： 80％乙腈，20％水，0.1％TFA

梯度：    0-15％B，时间5min，15-45％B，时间60min，45-100％B，时间1min

流速：    2ml/min

检测：    214nm和280nm

层析设备：Kontron

级份：    1min，各自从min 1开始

本发明的纯物质包含在级份31中，然后通过生物测定法以剂量依赖方式检测，以肽化学性为其特征(例2)。

例2：

质量测定

从血液过滤液中分离的肽(来自例1中第七步的级份31)和化学合成的肽(例3)的质量测定是使用MALDI质谱仪(Voyager DE-Pro)进行的。测定的所述肽的分子质量相当于以下质量数据(MW)：

ALB408-423，从人血液过滤液中分离(图1F)：1830.9Da

ALB408-423，化学合成的肽：1830.6Da

序列测定

通过由PROTEOMEFACTORY AG公司，Dorotheenstr.94，10117柏林(德国)提供的MS-MS偶联分析装置(ESI-TRAP)分析纯化的天然肽，通过Mascot搜索引擎对已建立的ESI MS-MS质量数据库进行比对，得到了具有最高可能性的以下序列：

LVRYTKKVPQVSTPTL(图1F)。

数据库比对

与SwissProt数据库进行的进一步数据库比对表明，所述肽序列与人类蛋白血清白蛋白(保藏号NP000468)的408-423号氨基酸具有100％的相同性，并且该序列包括以下氨基酸：LVRYTKKVPQVSTPTL。

纯化的级份31在HIV-1抑制生物测定中具有活性

将来自例1的第七步的1.6mg的级份31溶解在160μl的DMEM中。然后将来自含有ALB408-423的级份31的10μl系列稀释液添加到60μl的TZM-bl细胞(60μl)中，并且用1ng的p24抗原HIV-1NL4_3以100μl的总体积进行感染。三天之后，通过GalScreen试验测定感染率(参见例1)。级份31以剂量依赖方式抑制嗜X4的HIV-1NL4_3的感染。抑制所述感染至最大值的一半(IC₅₀)的剂量为21.45μg/ml(图2)。

图2：含有级份31的ALB408-423能抑制HIV-1NL4-3感染。TZM-b1细胞与级份31的系列稀释液一起培养，然后用嗜X4的HIV-1NL4-3感染。三天之后，通过GalScreen试验测定感染率。示出来自一式三份感染试验样品相对只用PBS处理的对照物(100％)的测定平均值±标准误差。

例3：

ALB408-423的化学合成

ALB408-423的化学合成是通过常规固相合成在肽合成仪9050(AppliedBiosystems)上采用已知的Fmoc化学法进行的。通过反相层析纯化所获得的肽，并且通过分析RP-HPLC和在例2中所披露的MALDI-MS质量测定，确定它的相同性和纯度。

例4：

合成的ALB408-423能特异性抑制嗜X4的HIV-1变体的感染

5000TZM-b1细胞接种在100μl的DMEM(10％FCS，100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素)中。将ALB408-423溶解在PBS(10mg/ml)中。一天之后，将ALB408-423在PBS中的20μl的系列稀释液添加到细胞中，并且随后用0.5ng的p24抗原HIV-1感染细胞，总体积为200μl。采用在辅助受体嗜性方面不同的HIV-1分子克隆，其按公开的方法制备(Papkalla et al.，J.Virol.76：8455-9，2002)。

图3：化学合成的ALB408-423能特异性能抑制嗜X4的HIV-1感染。含有所标明的肽稀释液的TZM-bl细胞用辅助受体嗜性不同的HIV-1变体感染。三天之后，通过Gal Screen试验测定感染率。A)嗜X4的HIV-1变体NL4-3，P51-Sc，P59-S/27和P34-S或双重嗜性的92ht593.1有剂量依赖性的抑制作用。B)存在500μg/mlALB408-423的条件下的感染率表明，所述肽能特异性抑制嗜X4，但不嗜R5的HIV-1感染。所示出的数据是来自一式三份感染试验样品相对于只含有PBS的细胞(100％感染)的测定平均值±标准误差。

三天之后，通过GalScreen试验(Tropix)检测感染(例1)。通过分析嗜X4的HIV-1变体(图3A)发现，FALB408-423以剂量依赖方式抑制所述感染(平均IC₅₀为24.2μg/ml)。双重嗜性的(使用CXCR4和CCR5)变体92ht593.1的抑制效果较小。相反，嗜CCR5的HIV-1变体即使在存在很大剂量的ALB408-423(500μg/ml)的条件下也不能抑制(图3B)。由于对嗜X4的HIV-1变体导致的感染的特异性抑制作用，可以假设ALB408-423与趋化因子受体CXCR4相互作用。

从血液过滤液中纯化的ALB408-423(例2)和化学合成的ALB408-423(例4)都在靶细胞中表现出HIV-1复制的剂量依赖性抑制作用，提供了ALB408-423是天然的人类HIV-1抑制分子的证据。

例5：

合成的ALB408-423以剂量依赖方式抑制嗜CXCR4的慢病毒(lentivirus)感染。

通过瞬时转染293T细胞，制备嗜X4的HIV-1NL4-3和HIV-2ROD10或嗜CCR5的HIV-1 NL4-3 92th014，HIV-1-7312和SIVmac239，并且用于感染含有所标明浓度的ALB408-423的TZM-b1细胞。两天之后，按所披露的方法测定和计算感染率(例4)。结果表明，ALB408-423以剂量依赖方式抑制嗜X4的HIV-1和HIV-2感染(IC₅₀～10-20μM)，而所述肽对嗜R5的慢病毒感染没有作用，表明了它对嗜CXCR4的HIV-1和HIV-2的特异性抑制作用(图4)。

图4.ALB408-423能抑制嗜X4的慢病毒感染。用感染率标准化的HIV-1，HIV-2和SIV母株感染含有ALB408-423的TZM-b1细胞。三天之后，通过Gal Screen试验测定感染率。所示出的是来自三次测量的平均值±标准误差。不含肽的细胞的感染率＝100％。

表1.各种ALB片段针对嗜X4的HIV-1NL4-3感染的抗病毒活性。含有合成肽系列稀释液的TZM-b1细胞用HIV-1NL4-3感染，并且按照例1和2所披露的方法感染两天之后测定和计算感染率。IC₅₀值是使用GraphPad Prism软件包测定的。缩略语：Da，分子量；IC₅₀μM，半最大(50％)抑制浓度，通过进行三次实验获得；SEM，平均值的标准误差；exp，所进行实验的数量；

表1

                                Da      IC50±SEM     exp  Seq ID No

ALB415-423    VPQVSTPTL         941     ＞100         3    1

ALB414-423    KVPQVSTPTL        1068    ＞100         3    2

ALB413-423    KKVPQVSTPTL       1196    ＞100         3    3

ALB412-423    TKKVPQVSTPTL      1298    ＞100         3    4

ALB411-423    YTKKVPQVSTPTL     1461    ＞100         3    5

ALB410-423    RYTKKVPQVSTPTL    1618    ＞100         3    6

ALB409-423    VRYTKKVPQVSTPTL   1717    ＞100         3    7

ALB408-423    LVRYTKKVPQVSTPTL  1832    7.6±1.2      7    8

ALB408-422    LVRYTKKVPQVSTPT   1720    11.8±3.1     4    9

ALB408-421    LVRYTKKVPQVSTP    1619    11.3±3.3     4    10

ALB408-420    LVRYTKKVPQVST     1522    11.2±2.9     4    11

ALB408-419    LVRYTKKVPQVS      1422    4.4±1.08     1    2

ALB408-418    LVRYTKKVPQV       1334    18.3±6.8     4    13

ALB408-417    LVRYTKKVPQ        1232    19.9±4.1     2    14

ALB408-416                      n.d.    n.d.               15

ALB408-415    LVRYTKKV          1006    17.4±6.5     2    16

ALB408-414    LVRYTKK           907     ＞50          2    17

ALB408-413    LVRYTK            779     ＞50          2    18

ALB407-414    LLVRYTKK          1025    ＞100         2    19

ALB407-419    LLVRYTKKVPQVS     1536    11.1±1.0     2    20

ALB408I-419   IVRYTKKVPQVS      1421    1.55±1.2     4    21

ALB408F-419   FVRYTKKVPQVS      1454    93.2±2.1     2    22

ALB408A-419   AVRYTKKVPQVS      1378    ＞100         2    23

ALB408G-419   GVRYTKKVPQVS      1366    ＞100         2    24

ALB408-415变体

ALB-wt        LVRYTKKV          1006     17.4±6.5    2    25

ALB-V415A     LVRYTKKA          978      33.0         1    26

ALB-K414A     LVRYTKAV          949      31.0         1    27

ALB-K413A     LVRYTAKV          949      56.0         1    28

ALB-T412A     LVRYAKKV          976      11.2±0.1    2    29

ALB-Y411A     LVRATKKV          914      91           1    30

ALB-R410A     LVAYTKKV          921      ＞1000       1    31

ALB-V409A     LARYTKKV          978      32.9         1    32

例6：

用ALB408-423衍生物进行结构活性相关性(SAR)研究。

化学合成包含N或C末端缺失或氨基酸取代(表1)的各种ALB408-423衍生物，并且将冷冻干燥的肽溶解在PBS中。按上述方法使用嗜X4的HIV-1 NL4-3(例4)在TZM-b1细胞中分析抗病毒活性。ALB408-423的N末端缺失(409-423，410-423，411-423，412-423，413-423，414-423，415-423)会严重破坏或消除抗病毒活性，表明所述N末端亮氨酸(L408)对于ALB408-423介导的嗜X4的对HIV-1的抑制作用是重要的(图5和图6)。

图5.ALB衍生物的抗病毒活性。用嗜X4的HIV-1NL4-3感染含有ALB衍生物系列稀释液的TZM-b1细胞。两天之后，通过GalScreen试验测定感染率。所示出的是来自一式三份感染试验样品相对不含肽的样品(感染率＝100％)的测定平均值。

图6.ALB衍生物的抗病毒活性。用嗜X4的HIV-1NL4-3感染含有ALB衍生物若干稀释液的TZM-b1细胞。两天之后，通过GalScreen试验测定感染率。所示出的是来自一式三份感染试验样品相对不含肽的样品(感染率＝100％)的测定平均值。

在C末端有最多至8个氨基酸残基截短的ALB408-423衍生物(408-422，408-421，408-420，408-419，408-418，408-417，408-416，408-415，408-414，408-413)，它们大都保留了抑制嗜X4的HIV-1感染的活性(图5和6，表1)。不过，在C末端的其他缺失(408-414和408-413)导致了肽活性的失活(IC₅₀值＞50μM)(图6)。有趣的是，C末端缺失变体ALB408-419比野生型ALB408-423更有效地抑制嗜X4的HIV-1感染(分别为4.4±1.0和7.6±1.2；平均IC₅₀值(μM)±sem)(表1；图5，6，7，和8)。

图7.ALB衍生物的抗病毒活性。用嗜X4的HIV-1NL4-3感染含有ALB衍生物若干稀释液的TZM-b1细胞。两天之后，通过GalScreen试验测定感染率。所示出的是来自一式三份感染试验样品相对不含肽的样品(感染率＝100％)的平均值。

图8.ALB衍生物的抗病毒活性。用嗜X4的HIV-1NL4-3感染含有ALB衍生物若干稀释液的TZM-b1细胞。两天之后，通过GalScreen试验测定感染率。所示出的是来自一式三份感染试验样品相对不含肽的样品(感染率＝100％)的平均值。

因为仅包括8个氨基酸残基的ALB408-415衍生物表现出有效的抗病毒活性(17.4±6.5)，通过合成并且检测包括特殊氨基酸取代的ALB408-415衍生物(表1)进行丙氨酸扫描。在图7和表1中所示出的数据表明，大部分取代破坏了ALB408-415的抗病毒活性。具体地讲，精氨酸410(ALB-R410A，IC₅₀＞1000μM versus ALB408-415；17.4±6.5versus)在HIV-1抑制中发挥重要作用(图7，表1)。苏氨酸412取代丙氨酸(ALB-T412A)得到适当增强了抗病毒活性的肽(11.2±0.1)(图7和表1)。

为了进一步说明N末端亮氨酸(L408)对于ALB408-419的抗病毒活性的作用，该残基被苯基丙氨酸(F)，丙氨酸(A)，甘氨酸(G)或异亮氨酸(I)取代。HIV-1抑制试验发现，N末端的以上大部分取代导致了无活性的肽(ALB408F-419，ALB408A-419和ALB408G-419)(图8)。不过，与异亮氨酸的同源交换(ALBL408I-419)导致了肽具有适当增强了的抗病毒活性(1.55±1.2)(图8)。位于ALB408-419N末端的(407-419)其他亮氨酸能减弱其抗病毒活性(图8)。

综上所述，SAR分析可以确定截短的ALB衍生物具有增强了的抗病毒活性，并且表明，与C末端相反，N末端部分对于ALB408-423介导的嗜X4的HIV-1感染的抑制作用来说是关键的。

例7：

ALB衍生物无一是细胞毒性的

为了评估ALB变体的可能的细胞毒性作用，将5×10³TZM-b1细胞与浓度逐渐提高的上述肽一起培养，产生最有效的抗病毒活性(表1和图9)的时间为3天。用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega，#G7571)按照生产商推荐的方法测定细胞活力。这种基于发光的试验能根据细胞内ATP的数量测定活细胞的数量。在添加试剂10分钟之后，使用照度计记录数据。将来自仅与PBS一起培养的细胞的发光活性设定为100％。在图9中示出的结果清楚地表明，检测出的ALB衍生物在高达300μM的浓度下无一表现出细胞毒性作用。

图9.AL B衍生物的细胞毒性分析。将ALB衍生物的系列稀释液添加到TZM-bl细胞中。两天之后，采用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability测量细胞ATP含量。所得到的值来自三次测量的结果。％活力是相对只含有PBS(无肽)的细胞的ATP值(100％)计算的。

例8：

ALB408-423和大部分潜在衍生物的抗病毒活性

为了研究大部分活性ALB肽对各种HIV-1克隆的作用，通过用前病毒质粒转染293T细胞制备了在辅助受体使用方面不同的病毒(Papkalla et al.，J.Virol.76：8455-9，2002)。病毒原株首先在TZM-b1细胞上滴定。然后用传染性标准化数量的嗜X4，双重嗜性(X4/R5)或嗜R5的HIV-1感染含有100μM肽的TZM-b1细胞。按前述方法测定感染率(例4)，表明野生型ALB408-423，C末端截短的ALB408-419和ALB L408I-419变体以及ALB-T412A几乎能完全抑制所有分析的嗜X4的HIV-1克隆(NL4-3，P51-Sc，P34-s)的感染(图10)。所述肽对嗜R5的HIV-1感染没有作用，并且仅能适度抑制双重嗜性HIV-1克隆92ht593.1对TZM-b1细胞的感染。以上数据表明，具有增强了的抗病毒活性(与ALB408-423相比)的ALB变体(表1)同样是嗜X4的HIV-1变体的广谱抑制剂。

图10.ALB408-423和截短的ALB衍生物能特异性抑制嗜X4的HIV-1感染。用标准化感染力的嗜X4，双重嗜性或嗜R5的HIV-1克隆感染含有PBS或100μM所标明的肽的TZM-b1细胞。在感染2天之后通过GalScreen试验测定感染率。所示出的是来自三次测量的平均值(PBS处理的对照物的％)±标准误差。

例9：

ALB408-423，ALB408-419和ALB L408I-419能抑制嗜X4的HIV-1感染以及在PBMC中的复制。

为了分析ALB408-423及其衍生物在相关原代细胞中的作用，通过Ficoll密度离心从来自DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen的血沉棕黄层中分离外周血单核细胞。1×10⁶PBMC/ml用1μg/ml植物血球凝集素(PHA，Oxoid，#3085280)和10ng/ml白介素2(IL-2，Strathmann，#9511192)刺激三天时间。然后离心使细胞沉淀，并且重新悬浮在含有IL-2的培养基中。将1.5×10⁵PBMC(250μl)接种在96孔培养皿上，添加肽，并且用嗜X4的HIV-1NL4-3的50pg/ml p24抗原感染细胞。在感染之后第1，3，和6天收集含有子代病毒的上清液。通过p24抗原ELISA(SAIC-Frederick，Inc[AIDS & Cancer virus program])测量病毒的产生。在来自第6天的含有100μM ALB408-423和ALB L408I-419的样品中检测不到p24抗原，在含有100μM ALB408-419的上清液中只能检测到微量水平的p24(图11)。在存在20μM肽的条件下，病毒复制受到严重妨碍。以上数据表明，ALB408-423及其两种测试的衍生物能在天然HIV靶细胞中抑制嗜X4的HIV-1的感染和复制。

图11.ALB408-423和衍生物能抑制嗜X4的HIV-1感染外周血单核细胞(PBMC)。细胞与标明浓度的ALB408-423或截短的变体一起培养，并且用嗜X4的HIV-1感染。6天之后获得的上清液通过p24ELISA进行分析。所示出的是来自一式三份感染样品平均p24抗原值(ng/ml)±标准误差。

例10：

ALB 408-423肽能抑制CXCL12与CXCR4的结合。

为了测试ALB 408-423抑制趋化因子CXCL12与它的受体CXCR4相结合的能力，按照前面公开的方法对所有活细胞进行荧光结合试验(Valenzuela-Fernandez，et al.；2001，JBC 276：26550-26558)。将CXCR4受体稳定转染到人胚胎肾(HEK)细胞中，作为融合蛋白与EGFP荧光蛋白一起和所述受体的细胞外氨基末端部分融合(EGFP-CXCR4)。按公开的方法合成人类趋化因子CXCL12和CXCL12-TexasRed(Amara et al.，1999，JBC 274：23916-23925；Valenzuela-Fernandez，et al.，2001，JBC 276：26550-26558)。按以下方法进行配体-受体相互作用的实时荧光监测。表达EGFP-hCXCR4的HEK293细胞收获在补充了5mM EDTA，pH 7.4的磷酸缓冲的盐溶液中，离心并且重新悬浮在HEPES-牛血清白蛋白缓冲液(10mM HEPES，137.5mM NaCl，1.25mM MgCl2，1.25mM CaCl2，6mM KCl，10mM葡萄糖，0.4mMNaH₂PO₄，1％牛血清白蛋白(w/v)，pH 7.4)中，补充了蛋白酶抑制剂(40μg/mL贝他定(bestatin)和杆菌肽，20μg/mL磷酰二肽，50μg/mL chymostatin，和1μg/mL亮抑酶肽)。对悬浮在HEPES-BSA缓冲液中的细胞(浓度通常为10⁶细胞/mL)进行实验。在21℃下采用光谱荧光计(fluorolog 2，Spex)对在510nm(激发波长为470nm)发射的荧光按时间进行记录，并且每隔0.3秒进行采样。通过在30秒时添加100nM的CXCL12-TR到1mL细胞悬浮液中开始荧光结合测量。为了进行竞争实验，将表达EGFP-CXCR4的细胞在没有或有各种浓度的竞争剂的条件下预培养10分钟。然后，添加CXCL12-TR(100nM)并且记录荧光，直到达到平衡(300秒)。采用Kaleidagraph 3.08软件(Synergy Software，Reading，PA，USA)分析数据。与荧光CXCL12的关系被测定是表现出EGFP荧光发射减弱，它是由于能量转移到CXCL12的Texas-red(TR)基团而造成的。

CXCL12结合饱和是在超过300nM的浓度下达到的，CXCR4受体与荧光CXCL12的解离常数等于55±15nM(Valenzuela-Fernandez et al.，(2001)，JBC 276，26550-26558)，Hachet-Haas et al；(2008)，JBC]。未标记的分子与荧光CXCL12竞争，由于占据受体位点而阻止了EGFP发射减弱。可以对检测到的荧光强度变化进行定量测定(Palanche et al.，(2001)，JBC 276：34853-34861；Vollmer et al.，1999，JBC 274：37915-37922；Ilien et al.，2003，Neurochem 85：768-778)，以便推算出竞争剂的结合常数。

我们的分析表明，ALB408-423以剂量依赖方式抑制CXCL12-Tr与它的受体CXCR4的相互作用(图12)。ALB408-423表现出的解离常数(EC50)等于8±3μM，相当于KI值等于3±1μM。解离常数EC50值类似于在HIV-1抑制试验中获得的IC₅₀值。

图12.ALB408-423能抑制CXCL12与CXCR4结合。用能表达EGFP-hCXCR4的293细胞进行配体-受体相互作用的实时荧光监测。在没有或有各种浓度的ALB408-423的条件下预培养细胞10分钟。然后添加CXCL12-TR(100nM)，并且记录荧光直到达到平衡(300sec)。用Kaleidagraph 3.08软件(Synergy Software，Reading，PA，USA)进行数据分析。所示出的数据是相对仅用CXCL12-Tr处理的细胞的荧光强度(100％)进行三次测量获得的平均值±标准误差。

例11：

肽ALB408-423不会通过CXCR4，CCR5和CXCR4诱导Ca²⁺转移，并且抑制CXCL12-诱导的钙细胞响应

用加载钙指示剂的HEK293细胞研究了ALB408-423调控CXCR4，CCR5或CXCR1-介导的细胞响应的能力。按公开的方法进行细胞内Ca²⁺释放测定(Palanche etal.，2001，JBC 276：34853-34861；Vollmer et al.，1999，JBC 274：37915-37922)，用吲哚-1乙酰氧甲基酯作为钙探针。细胞响应是在37℃下在搅拌的1mL样品池中记录的，激发波长设定为355nm，发射波长设定为405nm和475nm，使用光谱荧光计。人类趋化因子CCL5和CXCL8是从Becton Dickinson Biosciences(San Jose，CA)购买的。使用CXCR4，CCR5或CXCR1表达细胞进行的Ca²⁺转移试验证实了用来进行比较的趋化因子刺激剂CXCL12(CXCR4)，CCL5(CCR5)和CXCL8(CXCR1)能诱导Ca²⁺转移(图13)，而ALB408-423本身不能诱导任何钙响应，因此没有表现出CXCR4，CCR5和CXCR1刺激特性(图13)。

图13.ALB408-423不是CXCR4，CCR5或CXCR1刺激剂。能表达所标明的趋化因子受体的HEK293细胞用来进行比较的趋化因子[10nM CXCL12(CXCR4)；20nM CCL5(CCR5)或50nM CXCL8(CXCR1)]或50μMALB408-423处理。使用谱荧光计测量Ca²⁺响应。示出了用ALB408-423处理之后获得的荧光强度，并与测量的相比较的趋化因子的荧光强度(100％)进行比较。

图14.ALB408-423能在CXCR4表达细胞中特异性抑制CXCL12-诱导的Ca²⁺转移。A)ALB408-423对CXCL12介导的细胞内Ca²⁺有剂量依赖性抑制作用。B)ALB408-423对在HEK CCR5细胞中CCL5-诱导的钙响应或在HEK EGFP-CXCR1细胞中CXCL8-诱导的响应没有作用。黑色条框：仅有相比较的趋化因子；灰色条框：有相比较的趋化因子和50μM ALB408-423。所示出的值是相对仅用趋化因子处理的细胞(100％)进行的重复实验的平均钙峰值响应。

为了确定ALB408-423是否具有CXCR4拮抗特性，我们分析了ALB408-423对刺激剂CXCL12与CXCR4受体结合的影响。因此，CXCR4表达细胞与各种浓度的ALB408-423一起培养，然后用CXCL12处理。记录Ca²⁺响应。在图14A中示出的数据表明ALB408-423能以剂量依赖方式抑制CXCL12-诱导的钙响应，表观抑制常数为85μg/ml。为了了解化合物的选择性，我们随后表征了所述肽对各种趋化因子/受体对的钙响应。与来自图14A的数据一致，50μM的肽能在HEK EGFP-CXCR4细胞中抑制70％的CXCL12-诱导的钙响应(图14B)。相反，它对在HEK CCR5细胞中的CCL5-诱导的钙响应或在HEK EGFP-CXCR1细胞中CXCL8-诱导的响应没有作用(图14B)。以上结果支持了所述肽表现出对CXCR4受体具有选择性并且是CXCR4拮抗剂的观点。

例12：

ALB408-423能抑制CXCL12-诱导的CXCR4内在化

在用合适的趋化因子刺激时，多种G-蛋白结合的受体通过被膜小窝而内在化。作为有CXCR4响应的拮抗剂，ALB 408-423还能够改变趋化因子诱导的CXCR4受体内在化。为了分析ALB408-423对CXCL12介导的CXCR4内在化的拮抗特性，分离了EGFP-CXCR4受体表达细胞，并且在24孔平板中在用大鼠I型胶原涂敷的12-mm盖玻片上生长2天。然后在补充了蛋白酶抑制剂的HEPES-BSA缓冲液中培养0-30分钟，所述缓冲液含有100nM CXCL12或50μM的ALB408-423或100nMCXCL12加上50μM的ALB408-423，培养温度为37℃。通过细胞放置在冰上终止内在化，并且马上用冰镇HEPES-BSA缓冲液洗涤它们。然后在用PBS制备的4％多聚甲醛中在4℃下固定15分钟，然后在50mM NH₄Cl中培养15分钟。使用抗退色剂(Calbiochem)将盖玻片安装到显微镜载玻片上，在室温下保持24小时，然后在-20℃下保存。然后用倒置显微镜(Leica)和激光扫描共焦成像系统(LeicaAOBS SP2 MP)分析细胞，使用HCX PL APO lbd.BL 63X 1.40OIL UV物镜(n°506192)。电子变焦设定为3，针孔为1Airy，所得到的像素尺寸为0.154μm。用氩激光器的488nm激光线激发EGFP，检测并通过光电倍增管(PMT)在495到550nm的所谓mCFP通道(PMT1 610High Voltage-HV-，offset 0)中放大。为了获得良好的信噪比，所述图像来自4次连续获取的平均结果。

图15.ALB408-423能抑制CXCL12介导的CXCR4内在化。在表达EGFP-CXCR4的HEK细胞上监测受体内吞作用，并且在添加CXCL12，ALB408-423或这两种化合物之后马上(0分钟，上部图片)或30分钟之后(下部图片)通过共焦显微技术分析。30分钟之后，CXCL12处理的细胞将CXCR4内在化。在存在ALB408-423的情况下，CXCL12介导的受体的内在化被消除。

共焦成像表明，在37℃下用100nM CXCL12处理30分钟，EGFP-CXCR4内在化到细胞外周和多孔结构中(图15)。正如所预期的，ALB408-423不能诱导所述受体内在化，而是抑制CXCL12介导的CXCR4内在化(图15)，因为大部分荧光保留在所述细胞表面上。该结果提供了ALB408-423对CXCR4受体发挥拮抗作用的进一步的证据。

例13：

ALB408-423能抑制CXCL-12介导的Jurkat T细胞转移

CXCL12-CXCR4信号传导在若干疾病中发挥关键作用，如HIV/AIDS，癌症，白血病和关节炎。表达CXCL12的器官、组织或细胞能吸引表达CXCR4的肿瘤细胞，并使肿瘤转移。为了研究ALB408-423是否能够抑制CXCL12介导的肿瘤细胞转移，用表达CXCR4的Jurkat T细胞模型系统进行转移测定(Princen et al.，2004，J.Virol.78：12996-13006)。Jurkat T细胞以0.4×10⁶(200μl)的浓度悬浮在含有10％FBS的培养基中，然后将该细胞悬浮液(200μl)添加到5μm孔过滤装置的上部腔室(Transwell，24孔细胞培养器，Costar)。然后，将有或没有CXCL12(100ng/ml)的600μl培养基添加到下部腔室中，使其吸引来自上部腔室的细胞。为了研究对CXCL12-诱导的Jurkat T细胞转移的抑制作用，将下部腔室中的CXCL12与各种浓度的ALB 408-423混合。将细胞培养平板在细胞培养培养箱中在37℃下培养2小时。在培养之后，取出平板，并且将移至下部腔室的100μl细胞使用计数室直接计数或采用增殖测定法进行分析(CellTiter-Reagent，Promega)，使用生产商推荐的方法。增殖试验测定的细胞内ATP含量直接与细胞数量成正比(数据未发表)。图16所示出的数据表明，ALB408-423以剂量依赖方式抑制CXCL12介导的Jurkat T细胞转移。在高浓度(360μg/ml)下，ALB408-423几乎能完全抑制CXCL12诱导的细胞转移，与缺少任何肽(既无CXCL12，也无ALB408-423)的条件下观察到的抑制率相当。数据表明，CXCR4拮抗剂ALB408-423能抑制由CXCL12介导的肿瘤细胞的吸引。

图16.ALB408-423以剂量依赖方式抑制CXCL-12介导的Jurkat T细胞转移。将Jurkat T细胞添加到具有5μm孔过滤器的transwell装置的上部腔室。然后将PBS，CXCR4刺激剂CXCL12(100nM)或ALB408-423的系列稀释液添加到细胞培养平板的下部腔室中。在37℃下培养2小时之后，使用CellTiter-Luminescent CellViability Assay kit(Promega)测量细胞内ATP含量，检测在下部腔室中转移的细胞数量。所有值表示来自三次实验的转移的细胞数相对仅用CXCL12处理的细胞转移数(100％转移)的平均值±标准误差。

例14：

ALB408-423与CXCR4的结合取决于N-末端氨基酸的完整性。

为了确定ALB408-423中，介导与CXCR4结合并因此抑制嗜X4的HIV-1感染和CXCL12结合的部位，我们分析了若干ALB408-423衍生物(参见表1)对CXCL12诱导的Ca²⁺转移和CXCL12-Tr结合的影响。有关实验细节可以参见实施例x和y。如图17A和B所示，缺少N末端亮氨酸的ALB409-423不能抑制CXCL12介导的Ca²⁺响应或CXCL12-Tr与CXCR4受体的结合。有趣的是，ALB409-423在HIV-1抑制试验中也是无活性的，表明ALB409-423不能结合CXCR4，同样说明了缺少抗病毒活性。相反，所有C末端截短的ALB衍生物仍然能够与CXCR4受体相互作用(图17A)并且抑制CXCL12介导的Ca²⁺响应(图17B)，并表现出接近野生型肽(30μM)的解离常数，408-413是例外，它对所述受体具有较低的亲和力(＞200μM)并且在抑制嗜X4的HIV-1感染方面同样大多是无效的(图6和表1)。综合以上数据可以发现，若干C末端截短的ALB衍生物是CXCR4拮抗剂，它能够结合CXCR4，从而抑制CXCL12结合和信号传导或嗜X4的HIV-1感染。

图17.ALB衍生物的CXCR4拮抗活性。A)ALB片段能抑制CXCL12，但不能抑制CCL5诱导的Ca²⁺转移。表达CXCR4或CCR5的HEK293细胞分别用CXCR4刺激剂CXCL12(10nM)或CCR5刺激剂CCL5(20nM)处理，处理是在没有(无ALB)或有所标明的ALB衍生物(50μM)的条件下进行的。按公开的方法记录钙响应。所示出的数据是重复试验样品相对仅用刺激剂处理之后的峰值钙响应(100％)的平均值±标准误差。B)ALB衍生物能破坏CXCR4与CXCL12的结合。在有或没有ALB肽的条件下，用Texas Red标记过的CXCL12(CXCL12-Tr)处理表达CXCR4的HEK293细胞。配体-受体相互作用的实时荧光监测是按公开的方法进行的。所示出的是，有ALB肽的样品相对仅用CXCL12-Tr处理的细胞(100％结合)其结合CXCL12-Tr的水平。所给出的值来自重复实验的结果。