利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁

摘要

本发明提供了一种利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁的方法，其特征在于它是利用经过脱毒处理的甘蔗茎尖组织诱导芽培养数代后为材料，转接到间歇浸没式生物反应器中进行增殖培养和生根培养。间歇浸没式生物反应器中培养温度在29℃，光照1500Lx，16小时光照，间歇培养条件为每3小时培养3分钟，生根为每6小时培养3分钟，一代可以增殖达40倍，生根完成后经过适当炼苗处理，开始移植，其成活率85％左右。该套系统自动化程度高，增殖速度远高于传统组培方法，节省劳动成本、增加经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗(新台糖22、新台糖16、Badila)组织培养快繁获得健康甘蔗种苗的方法。

背景技术

甘蔗(Saccharum officenarum L.)属单子叶植物纲(Liliopsida)，颖花目(Gluimflorae)，禾本科(Gramineae)甘蔗属(Saccharum)。甘蔗是禾本科蜀亚族群甘蔗亚族中10属之一。它与蔗茅属、芒属、硬穗属和河八王五属组成亲缘较近的与甘蔗育种关系较大的甘蔗属复合体。其主要有热带种、印度种、中国种、细茎野生种、大茎野生种五种，前三种为栽培品种，后两种为野生种。

甘蔗的植株由根、茎、叶、花和果实(种子)构成，花和种子在甘蔗品种改良上有意义，在甘蔗生产中绝大多数甘蔗品种通常不易开花，同时甘蔗生产中也不要甘蔗开花。蔗茎是制糖原料，由若干个节和节间组成。蔗茎的节和节间的多少因品种和植期不同而异。

甘蔗原产于热带、亚热带地区，并在这些地区广泛种植。世界甘蔗种植面积最大的国家是巴西，其次是印度，我国排名第3位。甘蔗为喜温、喜光作物，对土壤的适应性比较广泛，以粘壤土、红壤土、砂壤土较好。土壤pH值在4.5～8.0，甘蔗都能生长，但以土壤pH值6.5～7.5为适宜。

甘蔗在我国农业经济中占有重要地位，其产量和产值仅次于粮食、油料和棉花，居第4位。蔗还是一种高产的生物能源作物，甘蔗是高光效碳四作物，生物产量高，含糖11％～17％，不但可供制糖，还可直接生产酒精，与汽油混合配制成一种混合的汽油燃料。特别是像巴西等盛产甘蔗而石油短缺的国家采用发酵酒精作为新能源之一，是一种取之不尽的生物能源，应用于汽车燃料不会产生污染，被称为绿色汽油。可以预见，随着科学技术的不断发展，作为重要能源意义作物之一的甘蔗具有很大的发展潜力。

甘蔗是我国主要的糖料作物，面积占我国常年糖料面积的85％以上(李奇伟编.现代甘蔗改良技术.广州：华南理工大学出版社，2001)，产糖量占食糖总产量的90％以上，甘蔗产业已成为主产区经济发展的重要支柱和农民增收的主要来源。我国与印度、新几内亚是世界三大甘蔗起源中心。我国已有3000多年的甘蔗生产记录(李杨瑞.正在崛起的中国甘蔗糖业[J].广西农业科学，2005，36(1)：79-81)。位于南亚热带季风气候区的广西壮族自治区，光照充足，雨水丰沛，适宜甘蔗生长。2008年广西食糖产量941万吨，占全国甘蔗糖产量的68.6％，食糖总产量的63.4％，是名副其实的“中国糖都”。

传统的甘蔗繁育方法是利用甘蔗茎段上的腋芽进行繁殖，然而和其他所有无性繁殖的作物如马铃薯、甘薯、香蕉、葡萄、草莓一样，多年连续种植后极易出现品种退化。而且由于生产管理技术等人为原因，常常造成蔗区甘蔗病害大面积流行，导致甘蔗产量及品质严重下降。

甘蔗是最早体现细胞全能性的作物之一。1969年，Heing.DJ等人已从甘蔗愈伤组织中再生出植株。甘蔗迅速大量繁殖试管苗，可通过两种方式。一种是诱导嫩叶外植体产生愈伤组织，由愈伤组织分化植株；另一种是培养茎顶生长点附近的芽(顶芽、腋芽)，使之大量分蘖繁殖。繁殖一定数量后，诱导芽长出根，形成完整植株。目前，以幼嫩茎尖组织作为外植体的茎尖离体培养技术结合热处理，获得健康脱毒的甘蔗种苗，并用于生产，可使甘蔗增产20％～40％、蔗糖含量增加0.5％以上(绝对值)(游建华，何为中，曾慧等.谈脱毒健康种苗在广西甘蔗生产的应用及效益展望.甘蔗糖业，2001，(1)：13～17).但该方法仍存在一些不足，具体表现为：

1、增值率低，由于传统的组培技术繁殖系数比较低，一般为2.0～4.0每代，而繁殖大量的组培苗需要较高代数的增殖，一般为10～12代左右，但是随着继代数的增高同时组培苗的变异率也在增加，而组培苗的质量和抗性则降低，但生产中不提高继代数就不能获得足够的经济利益，所以为了追求经济利益，工厂化生产甘蔗组培苗就有一些因为继代过多而造成的劣质苗投放市场。

2、自动化水平低，劳动密集，由于传统甘蔗组培生产过程中需要较高代数的增殖，一般20天左右就要转接一次，需要大量的人工转接继代，从而增加劳动成本，造成生产成本的增加，而且传统的方法需要大量的组培瓶，不仅占用大量的空间摆放，而且在使用操作的过程中的需要大量的手工操作。

3、生产周期长，传统的组培方法由于繁殖系数比较低，所以经过10～12代的培养一般所需要的时间为10个月左右。

4、生产成本高，传统甘蔗组织培养的生产成本的大部分为劳工费用，大约占整个生产成本的65％左右，而劳动成本中的大部分为转接工作的费用，由于需要较高代的培养，所以在转接工作上的劳工费用占到很大的比例，致使生产成本增加。

以上几点是目前甘蔗生产上所遇到的几个最主要的问题，现在已经在生产的过程中凸显，逐渐的在甘蔗组培苗生产健康发展的过程中其到阻碍作用，首先，由于增殖系数不高，导致增殖代数的增加，从而容易导致组培苗的质量得不到保证，容易把一些劣质苗投放到市场；其次，自动化水平低，劳动密集，需要大量的劳动费用花费在组培苗的转接工作中，从而导致生产成本的增加；最后，由于继代数的增加，从而导致生产周期的延长，在组培苗的供应上不能够合理分配，不能灵活的应对市场的需求进行生产。由于增殖系数低，劳动量大，自动化水平低，生产成本比较高的原因，传统的方法很难在适应未来大规模的甘蔗组培苗的生产，应用间隙浸没式生物反应器进行甘蔗组培苗的生产可以传统方法生产的缺陷，为低成本的生产高质量的甘蔗组培苗提供保障。

间隙浸没式生物反应器系一套集植物组织培养和植物此生代谢物质研究为一体的设备，基本原理是利用液体培养基以经过过滤的空气压力为动力对植物组培苗进行间歇式的培养，其主要组成由2个容器通过玻璃管或者硅管连接，气体通过滤膜孔径为0.22μm的针头过滤器除菌；使用了空气压缩机来实现营养液的供给和排干，其中间歇频率的控制由时控开关来控制电磁阀来实现空气的流动时间和方向。其原理是利用液体培养基以经过过滤的空气压力为动力对植物组培苗进行间歇式的培养，于传统方法比较而言，它不仅拥有了液体培养的优势，又避免了由于液体培养过程中周期长而带来的玻璃化畸形和此生代谢物质的伤害带来的生理问题。Esclona 1999年设计了此套系统并命名商品名为BIT系统，(ESCALONA M，LORENZO JC，GONZALEZ B.Pineapple(ananas comosusL.Merr)micropropagation in temporary immersion systems[J].Plant CellReports，1999(18)：743-748.)后来经过古巴甘蔗研究所加以改进命名为TIBs系统。国内是由广西农业科学院率先从国际甘蔗研究中心古巴甘蔗研究所引进加以改进应用于甘蔗组织培养快繁研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗(新台糖22、新台糖16、Badila)组织培养快繁获得健康甘蔗种苗的方法。

利用间隙浸没式生物反应器进行甘蔗组培苗的生产有以下四点优势：

1、增值率高，间隙浸没式生物反应器的基本原理是利用液体培养基以经过过滤的空气压力为动力对植物组培苗进行间歇式的培养，它的最大的特点就是增值率高，甘蔗组培苗一代培养的增值率可以达到30～40倍，远远高出传统的组培方法。

2、自动化水平高、劳动量小，由于利用间隙浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养的过程中是空压机提供气体动力，由时控开关来控制培养的间歇频率，一次接种后，整个培养过程中不需要再进行转接工作，从而可以节省大量的劳动量，降低生产成本。

3、降低培养代数，减少生产成本，利用间隙浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养的材料是用利用传统方法生产的组培苗的第五代、第六代苗，一次接种后不再转接，降低了培养代数，减少了转接工作的费用，节省生产成本。

4、组培苗质量好，适应性强，由于代数的降低为生产高质量的组培苗提供了保证，可以一定程度上减低变异率。间隙浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养由于利用过滤空气为动力，培养的过程中加强了培养瓶中的气体交换，模拟自然环境进行生长，增强组培苗的质量和适应能力。

本发明所采取的技术方案是：

1、材料的选择与接种，利用间隙浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养的材料来源于经过传统组培方法继代培养的第五代或第六代组培苗，至多以选择这两代苗是因为当用传统方法培养到5～6代苗的时候就有足够的材料供应进行间隙浸没式生物反应器进培养，而且不至于因为培养代数太高而产生的变异和抗性差等问题；接种需要分单株进行，且切除甘蔗组培苗基部的老叶部分，基本维持单株苗的完整，如果新叶过长也可适当切除，留新叶1～2cm。接种密度为70ml～100ml培养液/株。

2、增殖培养，将切取好的甘蔗组培苗转接到间歇浸没式生物反应器中进行增殖培养，利用甘蔗茎尖诱导继代苗在间歇浸没式生物反应器进行增殖培养的培养基的配方为：MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.1mg/L+20g/L白砂糖，培养基PH值为6.2，培养条件为温度29℃，光照1500Lx，16小时光照，8小时黑暗，间歇培养的间歇频率为每3小时一次，培养时间为3分钟，培养30天。

3、生根培养，甘蔗继代苗在间歇浸没式生物反应器进行生根培养的培养基的配方为：MS+6-BA0.01mg/L+NA2.0mg/L+活性炭50mg/L+20g/L白砂糖，培养基PH值为6.2，培养条件为温度29℃，光照1500Lx，16小时光照，8小时黑暗每天，间歇培养的间歇频率为每6小时一次，培养时间为3分钟，培养20天。

4、生根苗驯化及移栽，生根结束，在炼苗大棚中摆放3～5天后即可移栽，移栽时用清水洗干净根部，开始移栽是用沙培，盖塑料薄膜5天，揭膜后每星期喷施一次0.2％的甘蔗专用复合肥，40天后移栽至营养钵中，在营养钵中育苗一个月左右即可移栽至大田。

5、间歇浸没式生物反应器间歇频率增殖培养为3小时每次，培养时间为3分钟；生根培养的间歇频率为6小时每次，培养时间为3分钟。

本发明的积极效果：

(1)间歇浸没式生物反应器进行甘蔗快繁利用的是经过脱毒处理培养的5、6代的组培苗，保证了材料的无菌和健康，因此，在培养的过程中污染率很低；使用低代苗也保证了组培苗的质量和健康程度，降低变异率。

(2)由于利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗快繁是间歇性的培养，减轻了酚对组培苗的伤害，同时由于培养瓶中气体的交换使得组培苗的光合和呼吸能力得到加强，从而增强了组培苗的适应能力，保障移栽成活率，本发明成活率达85％左右。

(3)利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗快繁周期短，从接种到生根完成需要50天左右时间，而且增殖速度、增值率很高，可以到达40倍，远远高于传统的组培方法，使得工厂化生产、供应的机动性加强。

(4)使用2.5L的培养瓶，一次接种10～15株继代组培苗，经过增殖和生根培养可以得到500株左右的组培苗，大大提高了甘蔗组培的繁殖系数，而使组培苗的继代数减低在7代之内，降低了继代数，相对于传统的方法有很大的优势。

(5)该套系统自动化程度高，节省劳动成本、增加经济效益。

具体实施方式

1、间歇浸没式生物反应器的建立，在传统间歇浸没式生物反应器的基本原理上，选择适合国内条件的设备进行低成本组装建立。

2、材料：选用广西甘蔗研究所生物室利用甘蔗茎尖脱毒培养的第五代或第六代苗。

3、方法：

3.1、选取粗壮、基部干净的的组培苗作为接种材料，在切取材料的时候尽量把组培苗的老叶剥落，新叶做少许切除，留新叶1～2cm，被酚侵害的发黑或者变黄的叶片也完全去除，但不能破坏组培苗的生长点，和基部的芽点。

3.2、增殖培养：将切取好的甘蔗组培苗接种于配方为MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.1mg/L+20g/L白砂糖、PH值为6.2的液体培养基中，培养条件为温度29℃，光照1500Lx，16小时光照，8小时黑暗，间歇培养的间歇频率为每3小时一次，培养时间为3分钟，培养30天。

3.3、生根培养：待增殖培养结束后，更换生根培养基，甘蔗生根培养基的配方为；MS+6-BA0.01mg/L+NAA2.0mg/L+活性炭50mg/L+20g/L白砂糖，培养基PH值为6.2，培养条件为温度29℃，光照1500Lx，16小时光照，8小时黑暗，间歇培养的间歇频率为每6小时一次，培养时间为3分钟，培养20天。

3.4、炼苗、移栽：生根培养结束，在炼苗大棚中摆放3～5天后即可移栽，移栽时用清水洗干净根部，开始移栽是用沙培，盖塑料薄膜5天，揭膜后每星期喷施一次0.2％的甘蔗专用复合肥，40天后移栽至营养钵中，在营养钵中育苗30天左右即可移栽至大田。