PTD-SOD融合蛋白在防醉解酒产品中的应用

摘要

本发明涉及一种连接蛋白转导结构域和SOD的PTD-SOD融合蛋白在防醉解酒产品中的应用。它包括蛋白转导结构域PTD和SOD，可以提高细胞内SOD的活力。它可用作防醉解酒食品或者药物的有效成分，配以辅料，用常规工艺制作成口服的片剂、胶囊剂等。饮酒者在饮酒之前45分钟预服用或酒后10分钟立即服用本发明之药物后，可有效提高肝脏抗氧化能力，辅助肝脏对酒精及其代谢产物的消除，并加快消除速率，使血液循环体系中的酒精浓度降低，减少脑部酒精富集量及对神经细胞的影响，进而缩短酒后不适感的时间，从而降低过量酒精对人体的伤害，有良好的防醉解酒效果。

说明书

技术领域：

本发明涉及融合蛋白领域，尤其涉及蛋白转导结构域(Protein TransductionDomain，PTD)连接超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)的融合蛋白PTD-SOD在防醉解酒产品中的应用。

背景技术：

在商务应酬、朋友聚会中，酒已成为人们生活中不可缺少的一部分。酒精对人体的损害作用是多方面的，如肝脏、神经、生殖毒性等。在美国，因酒精摄入过量而致的肝脏疾患已成为男性的第四大主要死亡原因。近十多年来，随着全球酒精消费量的快速上升，伴随而来的各种与酒精相关的疾病也随之增加；进而，还引起了一系列的社会问题。随着人们的保健意识提高，人们逐渐意识到饮酒过量对人体的伤害，特别是对多种神经系统及肝脏的伤害，这让饮酒者及饮酒者家人产生强烈的担忧。

酒精能够通过多种途径对机体造成损伤，自由基的过量产生导致的一系列氧化应激损伤是途径之一。由于这一途径过量产生的自由基主要存在于细胞内，能从内到外对细胞造成多重损伤，所以越来越受到关注。细胞内多种氧化酶可以产生自由基，如黄嘌呤氧化酶。正常生理条件下，黄嘌呤氧化酶起到脱氢的作用。然而，在一定的条件下，如组织血流的中断，黄嘌呤脱氢酶转化为产生自由基的氧化酶形式。研究表明，乙醇代谢过程中产生的乙醛可作为黄嘌呤氧化酶的底物激活黄嘌呤氧化酶，使超氧阴离子和自由基生成增加，引起脂质过氧化，使细胞质膜磷脂溶解，破坏膜的结构和通透性，使Ca²⁺内流增加，排出受阻，Ca²⁺在细胞内、线粒体和核内储留，激活酶类，损坏细胞的结构和功能，甚至最终引起细胞死亡。肝脏是酒精代谢的主要器官，进入体内的酒精90％以上在肝脏代谢。脑部也是酒精及其代谢物富集之处，酒精及其代谢物能对神经细胞产生麻痹和毒害作用，从而引起大脑不清醒等机体不适状态。如果能使肝、脑等组织细胞内酒精引起的过多自由基得到有效清除，减少细胞受到的损伤，则可能有利于机体加快对酒精及其代谢物的代谢速率，使血液循环体系中的酒精浓度降低，脑部酒精富集量和神经细胞受到的影响减少；从而，有望达到一定的实时防醉和减少酒精及其代谢产物毒害的效果。

发明内容：

本发明目的是提供一种PTD-SOD融合蛋白在防醉解酒产品中的应用，它将连接了蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)的SOD融合蛋白---PTD-SOD作为主要成分用于防醉解酒产品中，其制备的防醉解酒新产品可缩短酒后不适感时间，减少酒精的毒害，起到良好的防醉解酒效果。

为了实现上述发明目的，本发明的技术内容是这样构成的：一种PTD-SOD融合蛋白在防醉解酒产品中的应用，其特征在于：所述的PTD-SOD为蛋白转导结构域(Protein TransductionDomain，PTD)连接超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)的融合蛋白PTD-SOD，并将PTD-SOD应用于防醉解酒产品中。

以PTD-SOD融合蛋白为主要成分(配以木糖醇或甘露醇等常规辅料)制成防醉解酒产品，该防醉解酒产品服用的剂量范围是100～150000SOD活力单位/Kg体重*日(一般指成人，儿童可根据年龄和体重酌减)。

PTD、SOD二者以肽键连接，连接发生在任何不明显影响SOD活性的部位。

上述防醉解酒产品的使用方式为舌下含服或吞服。

上述以PTD-SOD为主要成分的防醉解酒产品可在饮酒之前45分钟之内预服用或酒后10分钟-30分钟之内服用。

上述以PTD-SOD为主要成分的防醉解酒产品最好在饮酒之前45分钟预服用或酒后10分钟立即服用。

PTD是一种新近发现的能在蛋白转导过程中高效穿过细胞膜的蛋白质结构域，它能将与其共价连接的蛋白质和DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，甚至可以通过血脑屏障，转导效率很高而且对细胞没有损伤。PTD系统被认为是一种很有前途的运载工具，在基础医学研究和临床治疗方面都有着非常广泛的应用前景。细胞水平上，前期已有实验结果表明PTD-SOD能有效进入人肝细胞内部；动物水平上，近期实验表明，通过口服方式，PTD-SOD也能有效进入动物肝肾等组织器官(结果参见实验一)。本发明通过PTD与SOD的融合，解决SOD跨膜进入细胞内部的问题。该手段采用细胞内的自然机制，有效避免外源物质对靶细胞的损害，并且该方法能将SOD分子大量递送进入细胞，阻断氧自由基的连锁反应，有助于保护细胞免于氧化损伤，改善醉酒状态。

较之现有技术而言，本发明具有以下优点：PTD-SOD融合蛋白可以提高细胞内SOD的活力，它可用作防醉解酒食品或者药物的有效成分，配以辅料，用常规工艺制作成口服的片剂、胶囊剂等。上述以PTD-SOD为主料的防醉解酒产品，饮酒者在饮酒之前45分钟之内预服用或酒后10分钟-30分钟之内服用，可有效提高肝脏抗氧化能力，辅助肝脏对酒精及其代谢产物的消除，并加快消除速率，使血液循环体系中的酒精浓度降低，减少脑部酒精富集量及对神经细胞的影响，进而可缩短酒后不适感时间，减少酒精的毒害，起到防醉解酒的效果。

附图说明

图1是实施例1中小鼠醉酒比率变化比较示意图。

图2是实施例1中小鼠睡眠时间变化比较示意图。

图3是实施例2中小鼠每天醉酒比率的变化比较示意图。

图4是实验二中小鼠每天醒醉比率的变化比较示意图。

具体实施方式：

以PTD-SOD冻干粉为主料，与适当的辅料均匀混合制成片剂或胶囊剂，舌下含服或吞服使用。其服用的剂量范围是100～150000SOD U/Kg体重(每日)。所述的PTD-SOD为蛋白转导结构域(Protein Transduction Domain，PTD)连接超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)的融合蛋白PTD-SOD。

实施例1：单次服用药物对醉酒状况的改善。KM小鼠(约20g/只)经适应性喂养一周后随机分组，每组12只；其中1组作为对照组，给药组分别在饮酒之前45分钟或酒后10分钟口服给予药物50U/g体重，对照组给予等量生理盐水，通过翻正反射行为学实验(小鼠是否醉酒以翻正反射是否消失为指标，保持背部向下姿势30s以上者认为醉酒)，记录各组醉酒动物数、睡眠时间。结果表明，酒前和酒后给药组与未给药对照组相比醉酒比率分别降低了13.6％和30.3％(参见图1)；醉酒状态时间分别从平均184.5分钟缩短到平均82.3分钟(缩短55.4％)和102.5分钟(缩短44.3％)，参见图2。

实施例2：连续服用药物对醉酒状况的改善。KM小鼠(约20g/只)经适应性喂养一周后随机分组，每组12只，给药组每天分别喂服药物50U/g体重、100U/g体重、200U/g体重，醉酒模型组给予生理盐水，45min后，各组动物给予56％白酒，剂量为15ml/kg，持续5天。实验结果显示，给药组的醉酒比率呈逐天下降趋势，第五天均在50％以下(200U/g体重剂量组降到20％左右)，而模型组醉酒比率均在70％以上(参见图3)。给药组小鼠对酒的耐受能力得到提升，不易进入醉酒状态。

实验一

本实验说明本发明的融合蛋白PTD-SOD能进入动物脏器组织的细胞内部(参照表1)，有效地提高实验动物主要脏器中SOD活力。

1.实验方法：

取KM小鼠(约20g/只)小鼠40只进行随机分为两组，PTD-SOD组和空白对照组。对实验小鼠进行PTD-SOD口服给药(200U/g体重*天)，空白对照组给予同体积的生理盐水，持续4天，末次给药后每间隔1h肝、肾、心脏组织，测定组织中SOD酶活性。(注：每个时间点3只鼠，每只鼠平行取2个组织样本)

2.实验结果：

结果显示，PTD-SOD经过口服即可在全身各脏器组织得到有效分布，各脏器间SOD活力与空白组比均有较大增幅，且随时间各脏器存在不同变化特点(参照表1)，这充分证明了该融合蛋白在生物体内跨膜递送的可行性。

表1.PTD-SOD对小鼠主要脏器中SOD活性的影响

实验二

1.实验方法

选取KM小鼠(约20g/只)雄性小鼠60只，随机分为A、B、C、D、E 5组，每组12只，各组小鼠以标准饲料喂养，自由饮水，适应性喂养1周后进入试验。每天实验前各组动物禁食8h，A组(模型组)给予生理盐水，B(低剂量组)、C(中剂量组)和D(高剂量组)组动物分别按设定剂量(50U/g体重、100U/g体重、200U/g体重)灌服PTD-SOD，45min后，以上各组动物给予56％白酒，剂量为15ml/kg。E(空白组)组均给予等量生理盐水。每天记录各组动物醉酒数，酒后2小时内醒酒动物数，计算各组醉酒比率(酒后醉酒动物数/动物总数)及醒醉比率(酒后2小时内醒酒动物数/酒后醉酒动物总数)。持续五天后，禁食12小时，小鼠眼眶取血，3000r/min离心取血清，待测ALT；而后处死动物，称取200mg肝组织，制成10％肝匀浆，待测丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(G-Px)水平。各指标均按试剂盒说明书进行检测。

实验数据用均数标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析进行统计学处理，进行配对或组间t检验。

2.实验结果

2.1PTD-SOD对小鼠醉酒状况的影响

结果显示(参见图3和图4)，每天灌酒后两小时内，各组中进入醉酒状态的小鼠都有部分苏醒。模型组每天在2h内苏醒的小鼠数量在减少，各天醒醉比率均在40％以下，第五天接近20％，第三天醒醉比率略有上升，同样说明动物一定自我适应能力。而3个剂量组每天醉酒小鼠苏醒的数量均明显高于模型组，并呈上升趋势。200U/g和100U/g体重剂量组从第二天开始，灌酒后2h时内，醉酒小鼠均能全部苏醒，醒醉比率达到100％；50U/g体重剂量组也在第四天达到了100％。

2.2PTD-SOD对小鼠肝组织和血清中部分生化指标的影响

实验结果(表2)显示，模型组动物肝脏丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(G-Px)、ALT与空白组比较，MDA和ALT分别上升了63.7％和66.4％，CAT和G-Px分别下降了36.8％和4.4％(P＜0.05)。与模型组比较，PTD-SOD 50单位剂量组就已可以降低小鼠肝组织中MDA含量(P＜0.05)，而100和200单位剂量组的效果明显(P＜0.01)。200单位剂量组还能有效提高肝组织中抗氧化酶CAT、G-Px含量，分别提高43.1％和18.6％(P＜0.05)；并能降低血清中ALT含量的35.4％(P＜0.05)。

表2.PTD-SOD对小鼠肝组织G-Px、MDA、CAT以及血清ALT的影响

与模型组比较，p＜0.05*，p＜0.01**；与空白组比较，p＜0.05#，p＜0.01##

实验结论：上述以PTD-SOD为主要成分的防醉解酒产品，不仅能有效防止小鼠醉酒，使醉酒小鼠在较短时间内苏醒，大大改善小鼠醉酒的状态；还能有效提高肝脏的抗氧化能力，从而加速进入体内的酒精及其代谢产物的分解速度，达到实时防醉和减少酒精及其代谢物毒害的功效。

上述实施例和实验中，根据人(以60kg体重计)与小鼠按体表面积折算的等效剂量比值换算，小鼠的等效剂量**U/kg＝人体剂量**U/kg×9.1。因此，上述实验中小鼠每日剂量：50U/g体重、100U/g体重、200U/g体重，换算为人体剂量分别大致为5494U/kg体重、10989U/kg体重、21978U/kg体重。

上述的防醉解酒产品服用的剂量范围100～150000SOD活力单位/Kg体重*日，指的是该产品在人体上每天能使用的安全有效剂量范围，高于最高剂量范围可能会对人体产生一些副作用，低于最低剂量范围其防醉解酒效果会适当减弱，优选的有效服用范围可在5500～22000SOD活力单位/Kg体重*日内。

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