用于RNA合成的硫代碳保护基团

摘要

本发明的方面包括在2′位点上被硫代碳保护基团保护的2′受保护的核苷单体，例如式(I)。感兴趣的硫代碳保护基团包括硫代羟基碳酸酯、硫代羰基碳酸酯、二硫代碳酸酯，以及硫代氨基甲酸酯。本发明的方面还包括包含本发明保护基团的核酸，以及使用本发明的保护基团合成核酸的方法。

说明书

与相关申请的交叉引用

本申请基于35 U.S.C.§119(e)要求2007年5月10日提交的美国临时申请No.60/928,722的优先权，所述申请的公开内容通过引用并入本文。

背景技术

RNA的化学合成是比DNA的化学合成困难得多的任务，因为在化学合成期间必须保护核糖中的2′-羟基。在核苷酸间连接形成的方面和在合成寡核苷酸后2′-保护基团的去除方面，受保护的2′-羟基与核苷酸间磷酸酯的密切近似都表现出问题。另外，RNA中的核苷酸间键远比DNA中的核苷酸间键更不稳定。

直到最近，合成RNA的典型途径才使用了下述核糖核苷单体，所述核糖核苷单体中的5′-羟基通过对酸敏感的二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团保护，所述保护基团可以在单体与增长的寡核糖核苷酸偶联后在酸性条件下被去除。多种对酸稳定的保护基团已被置于2′-羟基上，以防止酸去保护步骤期间核苷酸间键的异构化和切割。这些对酸稳定的保护基团中最常见的似乎是叔丁基-二甲基甲硅烷基，其已知为TBDMS(Ogilvie et al.，1979)。在非常长的时间中，TBDMS作为2′-保护基团的用途主宰着先前用于RNA化学合成的小市场(Usman et al.，1987；Ogilvie et al.，1988)。

然而，使用TBDMS进行的寡核糖核苷酸合成绝不是令人满意的，并且典型地产生品质较差的RNA产物。因此，TBDMS保护基团从2′-位置上迁移至3′-位置上。另外，在单体(例如5′-O-DMT-2′-O-TBDMS-ribo-3′-O-(β-氰乙基，N-二异丙基)亚磷酰胺)的合成期间，T-甲硅烷基的引入是非位置选择性的，因此其可以被添加至2′或3′位置上。加上在亚磷酰胺生产期间避免甲硅烷基迁移的额外的化学需要，单体的合成是富有挑战性和昂贵的。本领域中还公知的是，这些单体的偶联效率由于2′-TBDMS的位阻而被大幅降低，这不仅影响全场产物的产量和纯度，而且也限制可通过该方法实现的寡核糖核苷酸的长度。

对合成的RNA的需求持续增长，这主要归因于RNA干扰的发现。因此，期望开发出改进的RNA合成流程，尤其是2′-保护基团，以满足日益增长的需要。

发明概述

本发明的方面包括2′受保护的核苷单体，其在2′位点上被硫代碳保护基团保护。感兴趣的硫代碳保护基团包括但不限于硫代羟基碳酸酯(thiocarbonate)、硫代羰基碳酸酯(thionocarbonate)和二硫代碳酸酯(dithiocarbonate)保护基团，以及硫代氨基甲酸酯(thionocarbamate)保护基团。本发明的方面还包括包含本发明保护基团的核酸，以及使用本发明的保护基团合成核酸的方法。

定义

进一步详细描述本发明之前，除非另有说明，如下定义本申请中使用的术语。

“核苷酸”或“核苷酸部件(moiety)”是指核酸(无论是DNA或RNA或其类似物)的亚单元以及这些亚单元的类似物，所述亚单元包含磷酸基、糖基和杂环碱基。其他基团(例如保护基团)可以与核苷酸的任何组分连接。

“核苷”或“核苷部件”是指包含糖基和杂环碱基的核酸亚单元，以及这些亚单元的类似物。其他基团(例如保护基团)可以与核苷的任何组分连接。

“核苷残基”是指作为更大分子(例如在多核苷酸、寡核苷酸或核苷亚磷酰胺中的)一部分的具有糖基和含氮碱基(如在核苷中)的分子。

“核苷酸单体”是指未被结合在更大寡核苷酸链或多核苷酸链中并且对应于单个核苷酸亚单元的分子；当活化基(activating group)或保护基团对于核苷酸单体的预期用途而言必不可少的时候，核苷酸单体也可以具有这些基团。

术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括下述这些部件，这些部件不仅包括已知的嘌呤和嘧啶碱基，例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)，而且也包括已被修饰的其他杂环碱基。这类修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，烷基化的核糖或其他杂环。这类修饰包括例如二氨基嘌呤及其衍生物，肌苷及其衍生物，烷基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，硫醇化的(thiolated)嘌呤或嘧啶等等，或者添加保护基团例如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、9-芴基甲氧羰基、苯氧乙酰基、二甲基甲脒、二丁基甲脒、N，N-二苯基氨基甲酸酯等等。嘌呤或嘧啶碱基也可以是前述的类似物；合适的类似物应当是本领域人员已知的，并且描述于有关的文件和文献中。常见的类似物包括但不限于1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲基硫-N6-异戊基腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫代鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)尿嘧啶、5-(羧甲基氨甲基)-尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-(2-溴代乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、辫苷(queosine)、肌苷(inosine)、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫代嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。

另外，术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅含有常规核糖和脱氧核糖，而且含有其他糖的部件。经修饰的核苷或核苷酸也包含在糖部件上的修饰，例如其中一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团替换，或者被功能化为醚、胺等等。“类似物”是指具有下述结构特征的分子，所述结构特征在文献中被识别为模拟物、衍生物、具有类似的结构或其他类似的术语，并且包括例如包含非天然(自然中通常不存在)核苷酸的多核苷酸、非天然的核苷酸模拟物例如2′-经修饰的核苷、肽核酸、寡聚核苷磷酸酯以及具有添加的取代基例如保护基团或链接基团的任何多核苷酸。

“核苷酸间键”或“核苷酸键”是指两个核苷部件之间的化学链接，例如天然存在的核酸中的磷酸二酯链接，或核酸或核酸类似物合成领域中公知的链接。核苷酸间键可包含磷酸基或亚磷酸基，并且可包含下述链接，其中磷酸基或亚磷酸基的一个或多个氧原子被取代基修饰或者被另一原子置换，例如硫原子，或单烷基氨基或二烷基氨基的氮原子。

“基团”包括被取代或未被取代的两种形式。感兴趣的取代基包括一种或多种低级烷基、氨基、亚胺基、酰氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硫基、烷基硫基、芳基硫基，或芳基或烷基；芳基、烷氧基、硫烷基、羟基、氨基、酰氨基、磺酰基、硫代、巯基、亚胺基、卤代、氰基、硝基、亚硝基、叠氮基、羧基、硫化物基、砜基、硫氧基(sulfoxy)、磷酰基、甲硅烷基、甲硅烷氧基和硼酰基(boronyl)，或任选地在一个或多个可用的碳原子上被非烃基取代基取代，例如氰基、硝基、卤素、羟基、磺酸基、硫酸酯基、磷酸基、磷酸酯基、膦酸酯基等等。选择任何取代基，从而不会显著不利地影响反应产率(例如较之没有具体的取代基或取代基组合时获得的反应产率不会降低多于20％(或10％，或5％，或1％))。另外，选择取代基，使得其与存在的其他基团在化学上相容，并且避免本领域技术人员已知的副反应。例如，不应用锂基团取代醇，因为醇的羟基和锂基团是不相容的，并且会与彼此反应。对于本公开中的任何基团而言，每个取代基可包含多达40、35、30、25、20、18、16、14、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个碳原子。总体而言，对任何基团而言，所有取代基中的碳原子总数在某些实施方式中为80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、18、16、14、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3或更少。

术语“杂环”(″heterocycle″、″heterocyclic″或″heterocyclo″)和“杂环基(″heterocyclic group″)”表示在至少一个含碳环中具有至少一个杂原子的、完全饱和或部分或完全不饱和的环基，包括芳香族的(“杂芳基”)或非芳香族的(例如3到13元单环、7到17元二环、或10到20元三环的环状体系)。含有杂原子的杂环基的每个环可具有1、2、3或4个选自氮原子、氧原子和/或硫原子的杂原子，其中所述氮和硫杂原子可任选地被氧化，并且所述氮杂原子可任选地被季铵化。杂环基可以在环或环体系的任何杂原子或碳原子上被连接。多环杂环的环可以稠合、桥接和/或通过一个或多个螺节点接合。含氮碱基是杂环的例子。其他例子包括哌啶基、吗啉基和吡咯烷基。

术语“被取代的杂环”(″substituted heterocycle″、″substitutedheterocyclic″和″substituted heterocyclo″)和“被取代的杂环基”(″substituted heterocyclic group″)表示被一个或多个基团取代的杂环和杂环基，所述基团优选地选自烷基、被取代的烷基、烯基、氧代、芳基、被取代的芳基、杂环、被取代的杂环、碳环(任选地被取代的)、卤素、羟基、烷氧基(任选地被取代的)、芳氧基(任选地被取代的)、烷酰基(任选地被取代的)、芳酰基(任选地被取代的)、烷基酯(任选地被取代的)、芳基酯(任选地被取代的)、氰基、硝基、酰氨基、氨基、被取代的氨基、内酰胺、脲、氨基甲酸酯、磺酰基等等，其中任选的一对或多对取代基和与之结合的原子一起结合形成3到7元环。

术语“吸电子基团”是指下述部件，其具有吸引相邻原子上价电子的趋势(即对相邻原子而言，该取代基是电负性的)。吸电子能力水平的定量由Hammettσ常数给出。该公知常数描述于许多参考文献中，例如March，Advanced Organic Chemistry 251-59，McGraw Hill Book Company，New York，(1977)。吸电子基团包括硝基、酰基、甲酰基、磺酰基、三氟甲基、氰基、氯基等等。

术语“给电子基团”是指下述部件，其具有排斥相邻原子上价电子的趋势(即相对于相邻原子而言，该取代基是电负性较弱)。给电子基团包括氨基、甲氧基、烷基(包括C1-6烷基，其可具有线性或支化结构)、C4-9环烷基等等。

本文使用的短语“保护基团”是指下述物类，其防止分子的一部分进行特定的化学反应，但是在所述反应完成后可以从所述分子上去除。“保护基团”以其作为下述基团的常规化学含义使用，所述基团可逆地使官能团在期望反应的特定条件下无活性，如例如Greene，et al.，″ProtectiveGroups in Organic Synthesis，″John Wiley and Sons，Second Edition，1991中所教导。在期望的反应后，保护基团可以被去除，从而使受保护的官能团去保护。所有的保护基团应当是在下述条件下可以去除的(并因此是不稳定的)，所述条件不大量降解所合成的分子。与保护基团相反，“加帽基团(capping group)”永久性地与分子的链段键合，以预防该链段的任何进一步化学转化。应当注意，被保护基团保护的官能团可以是或不是被称作保护基团的基团的一部分。

“羟基保护基团”或“O-保护基团”是指其中受保护的基团是羟基的保护基团。“反应位点羟基(reactive-site hydroxyl)”是3′-5′多核苷酸合成期间的末端5′-羟基，或5′-3′多核苷酸合成期间的3′-羟基。“游离的反应位点羟基”是在多核苷酸合成期间能够进行反应形成(即与亚磷酰胺官能团形成)核苷酸间键的反应位点羟基。

“硫代碳保护基团”是指通过羰基或硫羟基羰基部件链接的保护基团，其额外地含有与一个或多个下述基(radical)链接的氧、硫或氮，所述基独立地选自氢、烃基和被取代的烃基，前题是当所述硫代碳保护基团与所述基通过氮链接时，所述基可额外地选自芳基、被取代的芳基、杂环或被取代的杂环。

术语“同时去保护”是指一种过程，其目的在于在相同的并且基本同时或同时进行的过程中去除不同的保护基团。然而，在本文中使用时，该术语不意味着不同保护基团的去保护精确地在相同时间发生或者以相同的速率或相同的动力学发生。

“磷酸(phospho)”基团包括磷酸二酯、磷酸三酯和H-磷酸酯基团。在磷酸基团或亚磷酸基团的情况下，除被取代的5-元呋喃环以外的化学部件可以与链接在呋喃环和P原子之间的磷酸基团或亚磷酸基团的O连接。

术语“亚磷酰胺基团”是指包含结构-P-(OR¹³)(NR¹⁴R¹⁵)的基团，其中R¹³、R¹⁴和R¹⁵独立地为烃基、被取代的烃基、杂环、被取代的杂环、芳基或被取代的芳基。在一些实施方式中，R¹³、R¹⁴和R¹⁵可选自低级烷基、低级芳基和被取代的低级烷基和低级芳基(优选地被含有多达18、16、14、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个碳原子的结构取代)。在一些实施方式中，R¹³是2-氰乙基或甲基，并且R¹⁴和R¹⁵之一或二者为异丙基。R¹⁴和R¹⁵可任选地环状相连。

除非另有说明，本文中使用的术语“烷基”是指具有1到24个(典型地1-12个)碳原子的饱和的直链、支化或环状烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基，和2，3-二甲基丁基。术语“低级烷基”表示1到6个碳原子的烷基，并且包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、和2，3-二甲基丁基。术语“环烷基”是指环状烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。

另外，术语“烷基”包括“经修饰的烷基”，其表示下述烷基，所述烷基具有1到24个碳原子，并且还具有额外的基团例如一个或多个选自醚-、硫-、氨基-、磷-、氧代-、醚-和酰氨基-的链接基，和/或被一个或多个额外的基团取代，所述额外的基团包括低级烷基、芳基、烷氧基、硫烷基、羟基、氨基、磺酰基、硫代、巯基、亚氨基、卤素、氰基、硝基、亚硝基、叠氮基、羧基、硫化物基、砜、硫氧基、磷酰基、甲硅烷基、甲硅烷氧基，和硼酰基。类似地，术语“低级烷基”包括“经修饰的低级烷基”，其表示下述基团，所述基团具有1到8个碳原子，并且还具有额外的基团例如一个或多个选自醚-、硫代-、氨基-、磷-、酮-、酯-和酰氨基-的连接，和/或被一个或多个下述基团取代，所述基团包括低级烷基、芳基、烷氧基、硫烷基、羟基、氨基、磺酰基、硫代、巯基、亚氨基、卤素、氰基、硝基、亚硝基、叠氮基、羧基、硫化物基、砜、硫氧基、磷酰基、甲硅烷基、甲硅烷氧基，和硼酰基。在本文中使用时，术语“烷氧基”表示取代基-O-R，其中R是上文定义的烷基。术语“低级烷氧基”表示下述基团，其中R是低级烷基。在本文中使用时，术语“硫烷基”是指取代基-S-R，其中R是上文定义的烷基。

除非另有说明，在本文中使用时，术语“烯基”表示2到14个、典型的为2到12个碳原子的，支化的、不支化的或环状(例如C5和C6的情况)的，含有至少一个双键的烃基，例如亚乙基、乙烯基、烯丙基、辛烯基、癸烯基等。术语“低级烯基”表示2到8个碳原子的烯基，并且特定地包括乙烯基和烯丙基。术语“环烯基(cycloalkenyl)”表示环状的烯基。

除非另有说明，在本文中使用时，术语“炔基”表示2到24个、典型的为2到12个碳原子的，含有至少一个三键的，支化或不支化的烃基，例如乙炔基(acetylenyl)、次乙基(ethynyl)、正丙炔基、异丙炔基、正丁炔基、异丁炔基、叔丁炔基、辛炔基、癸炔基等等。术语“低级炔基”表示2到8个碳原子的炔基，并且包括例如乙炔基和丙炔基，术语“环炔基”表示环状炔基。

术语“烃基”表示烷基、烯基或炔基。术语“被取代的烃基”表示下述烃基，其在烃主链的一个或多个碳上具有代替氢的取代基。这类取代基可包括例如羟基、卤素、羰基(例如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫代酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、膦酸酯、次磷酸酯、氨基、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、硫氢基、烷基硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰氨基(sulfonamido)、磺酰基、杂环、芳烷基，或芳香族或杂芳族基团。本领域技术人员应当理解，适当时烃链上的取代基团可以是其自身是被取代的。例如，被取代的烷基的取代基可包括被取代或未被取代形式的氨基、叠氮基、亚胺基、酰氨基、磷酰基(包括膦酸酯和次磷酸酯)、磺酰基(包括硫酸酯、磺酰氨基、氨磺酰基和磺酸酯)，和甲硅烷基，以及醚、烷基硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸酯和酯)，-CN等等。环烷基可被烷基、烯基、烷氧基、烷基硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CN等等进一步取代。

术语“烷氧基”表示与氧链接的烷基，并可由式R-O-表示，其中R代表烷基。一个例子是甲氧基CH₃O-。

术语“芳基”表示5-、6-和7-元单环芳族基团，其包含从0到4个杂原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等等。这些在环结构中具有杂原子的芳基也可以被称作“芳杂环”或“杂芳族化合物”。术语“芳基”也包括具有两个或更多环的多环环结构，其中两个或更多的碳由两个毗邻的环共有(所述环为“稠环”)，其中这些环中至少一个是芳香族的(例如其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环)。“低级芳基”含有至多18个碳，例如至多14、12、10、8或6个碳。

芳环可以在一个或多个环位置上被上文针对被取代的烃基所描述的那些取代基取代，所述取代基例如为卤素、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、硫氢基、亚胺基、酰氨基、膦酸酯、次磷酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷基硫基、磺酰基、磺酰氨基、酮、醛、酯、杂环、芳香族或杂芳族基团、-CF₃、-CN等等。

术语“卤素”(″halogen″和″halo″)是指氟、氯、溴、碘。

本文中使用的“链接基”表示与两个其他部件键合的第一部件，其中所述其他部件通过所述第一部件链接。典型的链接基包括醚(-O-)、氧代(-C(O)-)、氨基(-NH-)、酰氨基(-N-C(O)-)、硫(-S-)、磷(-P-)、酯(-O-C(O)-)。

“经功能化的”是指将材料修饰为具有与材料键合的特定部件的过程，例如将分子或底物修饰为具有特定的部件；经过所述修饰的材料(例如分子或支持物)被称作经功能化的材料(例如经功能化的分子或经功能化的支持物)。

用于描述化学结构、基团或部件时，术语“被取代的”表示所述结构、基团或部件包含一个或多个取代基。在本文中使用时，在用第二基团“取代”第一基团的情况下，第二基团与第一基团连接，从而第一基团的部件(通常为氢)被置换为第二基团。

“取代基”是指在化学结构中代替其他基团的基团。典型的取代基包括非氢原子(例如卤素)、官能团(例如但不限于氨基、硫氢基、羰基、羟基、烷氧基、羧基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、磷酸酯等等)、烃基和被一个或多个杂原子取代的烃基。示范性的取代基包括烷基、低级烷基、芳基、芳烷基、低级烷氧基、硫烷基、羟基、硫代、巯基、氨基、亚胺基、卤素、氰基、硝基、亚硝基、叠氮基、羧基、硫化物基、砜、硫氧基、磷酰基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、硼酰基和经修饰的低级烷基。

在本说明书通篇中多处使用连字号(hyp)或破折号(dashes)来表示连接(键合)，例如在正文中两个指定的基团与破折号紧密相邻的情况下，表示所述两个指定的基团区域彼此连接。相似地，正文中每个指定的基团之间有破折号的一系列指定的基团表明所指定的基团以所示顺序彼此连接。并且，正文中与破折号相邻的单个指定基团表明指定的基团典型地与一些其它的、未指定的基团连接。在一些实施方式中，破折号指出的连接可以是例如相邻指定基团之间的共价键。在说明书通篇中多处，正文中可以描述带有或不带有相邻破折号的基团(例如酰氨基或酰氨基-，还例如烷基或烷基-，进一步还有Lnk(链接基)、Lnk-或-Lnk-)，其中这样的上下文指明该基团旨在(或具有潜力)与另一基团键合；在这样的情况下，基团的身份由基团名称表示(无论正文中是否存在相邻的破折号)。注意，当上下文指明时，单个基团可以与多于一个其它基团连接(例如意在表示是链接时，例如链接基团)。

虚线(例如-------)在说明书和权利要求书的通篇中以与指定的基团紧邻的方式使用，表示与一些其他的、未指定的基团的连接。

“任选的”或“任选地”表示下文所述的情形可能发生或不发生，因此该描述包括所述情形发生的情况和所述情形不发生的情况。例如，短语“任选地被取代”表示非氢取代基可存在或不存在，并且说明书包括其中存在非氢取代基的结构和其中不存在非氢取代基的结构。在本文中多处，部件可以被描述为存在零次或多次：这等同于部件是任选的，并且包括其中存在所述部件的实施方式和其中不存在所述部件的实施方式。如果任选的部件不存在(在结构中存在零次)，则被描述为通过所述任选的部件链接的相邻基团彼此直接链接。类似地，部件可以被描述为(1)链接两个相邻基团的基团，或(2)链接两个相邻基团的键：这等同于部件是任选的，并且包括其中存在所述部件的实施方式和其中不存在所述部件的实施方式。如果任选的部件不存在(在结构中存在零次)，则被描述为通过所述任选的部件链接的相邻基团彼此直接链接。

“键合”在本文中可被用于表明直接或间接的连接。在化学结构的语境中，“键合”(或“键合的”)可表示化学键的存在，所述化学键直接接合两个部件或间接接合两个部件(例如通过链接基团或分子的任何其它插入部分)。化学键可以是共价键、离子键、配位络合、氢键、范德华力相互作用，或疏水堆积(hydrophobic stacking)，或者可以具有多种类型的化学键的特征。在某些情况下，“键合”包括其中直接连接的实施方式，也包括其中间接连接的实施方式。在本发明“部件是游离的”语境中使用时，“游离的”表明部件能够与所述部件是其一部分的溶液的其它组分反应或者接触，。

术语“评估”包括任何形式的测量，并且包括测定特征是否存在。术语“测定”、“测量”、“评价”、“评估”和“测定(assaying)”可互换使用，并可包括定量和/或定性测定。评估可以是相对或绝对的。“评估……的存在”包括测定存在的事物的量，和/或测定其是否存在。

“经分离的”或“经纯化的”通常表示物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、肽、染色体等)的分离，使得所述物质占其所在的样品的显著部分(溶剂除外)，即大于典型地以其天然或未分离的状态存在的物质。典型地，样品的显著部分占样品(溶剂除外)的至少约1％，至少约5％，至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约50％，优选地至少约80％，或更优选地至少约90％。例如，经分离的RNA的样品典型地会包含至少约5％总RNA，其中百分比在该语境中如下计算：样品中总RNA的质量(例如以微克表示)除以(总RNA+样品中其它组分(溶剂除外))的总和质量(例如以微克表示)。纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术是本领域公知的，并且包括例如凝胶电泳、离子交换色谱、亲和性色谱、流动分选和根据密度沉降。在典型的实施方式中，核苷酸组合物中的一种或多种是经分离的形式；更典型地，在本发明的方法中使用之前，所有三种均以经分离的形式获得。

术语“预先确定的”表示在使用前其身份已知的要素(element)。例如，“预先确定的序列”是在使用或合成具有所述序列的多核苷酸之前，其身份已知的序列。要素可通过其名称、序列、分子量、功能或任何其它属性或标识符而已知。

在本文中使用时，“上游”是指沿多核苷酸(例如RNA分子)的5′方向。“下游”是指沿多核苷酸的3′方向。“3′-”和“5′-”具有本领域已知的常规含义。

发明详述

本发明的方面包括2′受保护的核苷单体，其在2′位点上被硫代碳保护基保护。感兴趣的硫代碳保护基包括硫代碳酸酯和二硫代碳酸酯基，以及硫代氨基甲酸酯保护基。本发明的方面还包括包含本发明保护基的核酸，以及使用本发明的保护基合成核酸的方法。

在更详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体实施方式，所述具体实施方式当然可以变化。还应当理解本文使用的命名法仅用于描述具体实施方式的目的，并不旨在限制，因为本发明的范围仅由附带的权利要求限制。

提供数值范围时，应理解为该范围上限和下限之间的每个中间值(除非上下文另有清楚说明，到下限单位的十分之一为止)以及所述范围内任何其它陈述值或中间值均包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小的范围内，并且也包括在本发明内，受制于所述范围内任何明确排除的界限。当所述范围包括界限之一或二者时，排除这些包括在内的界限之一或二者的范围也包括在本发明内。

本文中展示了某些范围，其中数值之前存在术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后跟随的精确数值提供文字支持，以及为接近或大约为该术语后数值的数值提供文字支持。在测定数值是否接近或大约为明确指出的数值时，接近或大约的未指出数值可以是下述数值，所述数值在其存在的语境中提供明确指出的数值的基本等同值。

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料，但是接下来描述了代表性的示范性方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入，就好像每个个体出版物或专利被明确和个别地指出通过引用并入一样，并且其通过引用并入本文，用以公开和描述与所述出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对提交日之前的公开，并不应当被理解为承认本发明没有资格以在先发明的方式早于所述出版物。另外，提供的出版物的日期可能与实际公开日期不同，所述实际公开日期可能需要被独立地证实。

注意，在本文和附带的权利要求中使用时，单数形式(″a″，″an″和″the″)包括复数形式，除非上下文另行明确指出。还应注意，权利要求可被撰写为排除任何任选的特征。因此，本声明旨在用作对于与权利要求特征的记载相结合的排他性术语如“唯一”、“仅”等等的使用或“否定保证”限定的使用的前例基础。

应当注意，如在绘制一些化学结构时的常规情况，为了清楚的目的将一些氢基团(hydrido group)从所绘制的结构中省略，但是例如对于完全满足绘制的结构中碳的价键而言必需时，应当理解为所述氢基团存在。

阅读该公开内容后本领域技术人员会明白，本文描述和例证的每个个体实施方式具有分立的组分和特征，所述组分和特征可以容易地与其它若干实施方式之任何的特征分离或合并，而不偏离本发明的范围或思想。任何复述的方法可以按照复述的事件的顺序完成，或者以逻辑上可能的任何其它顺序完成。

用硫代碳保护基团保护的单体

如上文所述，本发明的方面包括2′-硫代碳保护基和单体，所述单体包含保护单体2′氧的硫代碳保护基。硫代碳保护基表示包含与碳原子键合的硫原子的保护基，其中所述硫原子可以通过单键或双键与所述碳原子键合。保护基可包含或不包含其它杂原子，例如氧、氮等。在某些实施方式中，保护基是硫代碳酸酯或二硫代碳酸酯保护基。在其它实施方式中，存在氮原子，例如在本发明的硫代氨基甲酸酯保护基中存在氮原子，这在下文更详细综述。这些保护基(除硫代氨基甲酸酯外)不包括作为基的苯基。同样，本发明的硫代碳保护基不包括苯基硫代羰基碳酸酯、苯基硫代羟基碳酸酯和苯基二硫代碳酸酯，其从本发明中被排除。

本发明的实施方式包括具有2′硫代碳酸酯保护基(其中“硫代碳酸酯”包括二硫代碳酸酯)的核苷单体，例如式(I)所述：

其中，

B^P是受保护或未受保护的杂环；

R¹和R²各自独立地选自氢、保护基团和亚磷酰胺基；

X和Y独立地为硫或氧，其中X和Y中的至少之一为硫；且

R³独立地选自烃基和被取代的烃基。

在其中R₃是仲(-CH-R′R″)烃基或被取代的仲(-CH-R′R″)烃基的某些实施方式中，R′和R″各自独立地选自氢、烃基、被取代的烃基、芳基和被取代的芳基，其中在某些实施方式中，当Y为氧时，R₃不是叔烃基，即R₃不是

式I所述化合物包括但不限于硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯和硫代羰基碳酸酯。这些化合物的实施方式包括下式Ic和Id和Ie所表示的那些：

其中：

R₃独立地选自烃基和被取代的烃基，条件是当R₃是仲(-CH-R′R″)烃基或被取代的仲(-CH-R′R″)烃基时，R′和R″各自独立地选自氢、烃基、被取代的烃基、芳基和被取代的芳基，其中仅涉及结构Ie所示化合物时，额外的前提条件是R₃不是下述结构所述的叔烃基，

也就是说R₃′、R₃″、R₃′″中的至少之一是H。

合适的R₃基团的额外例子可见于2006年3月23日提交的题为″Monomer Compositions for the Synthesis of RNA，Methods of Synthesis，andMethods of Deprotection，″的未决的美国申请No.11/388,112，其公开内容通过引用并入本文。

本发明的另一实施方式中，式I中的R₃是甲基、乙基、异丙基或苄基。这类实施方式的例子包括以下结构的化合物：

在某些实施方式中，本发明的单体包含2′硫代氨基甲酸酯保护基，例如示于式II中所示结构的化合物中的：

其中：

B^P是受保护或未受保护的杂环；

R¹或R²各自独立地选自氢、保护基团和亚磷酰胺基；

N为NH₂或仲胺(-NH-Z)、仲羟基胺(-NH-O-Z)、叔胺(-N-ZZ″)，其中Z和Z″独立地选自烃基、被取代的烃基、芳基、被取代的芳基，并且其中Z或Z″可以与N环状相连，或为叔羟基胺(-N-Z-OZ″)，其中Z和Z″独立地选自烃基、被取代的烃基、芳基、被取代的芳基，并且其中Z或Z″可以与N环状相连；和

本发明的氨基甲酸酯保护基包括伯、仲、叔和季硫代氨基甲酸酯。这些化合物的实施方式包括下式IIc和IId和IIe和IIf和IIg和IIh所表示的那些：

其中：

R₃选自烃基、被取代的烃基、芳基、被取代的芳基，其中仅针对IIc的前提条件是R₃不是2-(N-酰氨基)取代的苯基；

R₄和R₅独立地选自烃基、被取代的烃基、芳基、被取代的芳基，条件是R₄和R₅能够与N环状相连。

感兴趣的特定化合物包括以下结构所描述的化合物：

关于上面的化学式，B^P基团是受保护或未受保护的杂环。杂环可选自天然存在的嘌呤和嘧啶碱基，例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)，或经修饰的嘌呤和嘧啶碱基，和常见的类似物，例如本文所述的类似物。本文上下文中考虑的某些嘌呤或嘧啶类似物包括2002年12月18日提交的题为″Method of Producing Nucleic Acid Moleculeswith Reduced Secondary Structure″的美国专利申请No.10/324,409中所述的类似物；还有1999年7月20日提交的题为″Method of Producing NucleicAcid Molecules with Reduced Secondary Structure″的美国专利申请No.09/358,141(目前已放弃)中所述的类似物。

在一些实施方式中，杂环选自1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲基硫-N6-异戊基腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫代鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-(甲基氨甲基)尿嘧啶、5-(羧甲基氨甲基)-尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、辫苷、肌苷、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫代嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。

在一些实施方式中，如多核苷酸合成领域中所普遍已知的，杂环可具有保护基团。在某些实施方式中，杂环保护基团与杂环连接，所述杂环保护基团选自乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、9-芴基甲氧羰基、苯氧乙酰基、二甲基甲脒、二丁基甲脒或N，N-二苯基氨基甲酸酯。

受2′硫代碳保护基团保护的单体的合成

本发明的含有硫代碳保护基的核苷单体可使用任何便利的方案生产。在某些实施方式中，使用下述方案生产本发明的受保护的核苷单体，在所述方案中，将具有式(III)中所示结构的核苷单体与具有结构Q-LG的化合物在足以产生式(IV)结构的2′受保护的核苷单体的条件下接触，

在所述式(III)中：

B^P是受保护或未受保护的含氮碱；且

R¹和R²各自独立地为H、亚磷酰胺基、羟基保护基，或R¹和R²链接形成二齿保护基(bidentate protecting group)，例如1，3-四异丙基二硅氧烷(TIPS)基，

在所述结构Q-LG中：

Q是硫代碳保护基，例如如上文所述；和

LG是离去基团，例如卤素基团，

在所述式(IV)中：

LG可以是任何便利的离去基团。离去或活化基团包括但不限于：咪唑、氯、对-硝基苯氧基、五氟苯氧基、O-琥珀酰亚胺基(O-succinimidyl)、三氯甲基、溴和碘。

在某些实施方式中，如下文所举例说明的，本发明单体的合成使用试剂例如Markewicz TIPS试剂，以将保护基定位于所合成的组合物的2′-OH位点，即提供区域选择性。在以下的流程图中，R¹是硫代碳保护基。通过5′和3′-羟基的暂时保护，例如通过使用Markewicz二硅氧烷保护基，进行2′-羟基保护基的特异引入。下面流程图中所示1，3-四异丙基二硅氧烷(TIPS)是暂时二齿保护基，其被用于同时封闭5′和3′羟基，允许区域选择性地保护2′-羟基。也可以使用其它暂时二齿保护基。随后使用氟化物离子的溶液去除1，3-四异丙基二硅氧烷基团。

流程图1。

因此，本发明的方面包括通过如下制造本发明化合物的方法：

使式V的化合物与式C1-C(S)-R₃的氯硫代甲酸酯反应产生5′，3′-TIPS-2′-O-(R₃-硫代)羰基中间产物，

其中所述式V为：

B^P是受保护或未受保护的含氮碱；

其中式C1-C(S)-R₃中，R₃独立地选自烃基、被取代的烃基，条件是R₃不是叔烃基且当R₃是仲(-CH-R′R″)烃基或被取代的仲(-CH-R′R″)烃基时，R′和R″独立地选自氢、烃基、被取代的烃基、芳基和被取代的芳基；

b)用15当量到40当量的HF/吡啶去除5′，3′-四异丙基二硅氧烷保护基，产生2′-O-(R₃-硫代)羰基核糖核苷中间产物；

c)使步骤b)的中间产物与DMTrCl和5当量到10当量的三甲基吡啶或二甲基吡啶反应，并任选地添加DMAP或NMI，产生5′-O-DMT-2′-O-硫羰基-核糖核苷衍生物；

d)使来自步骤c)的中间产物与选自CNEO-P(Cl)-N(iPr)₂或(二异丙基)氨基甲氧基氯膦的磷酸化试剂反应，产生5′-O-DMT-2′-O-R₃-硫羰基-3′-O-甲基(或-氰乙基)亚磷酰胺。上述反应条件是示例性的，类似的条件和方案包括在本发明的范围内。

已经显示，使用本文所述的受保护的2′-羟基化合物和开发用于使TIPS基团去保护的条件，可以以前所未有的效率进行该区域特异性暂时保护。已开发了特异性的组合物和方法来选择性地使TIPS保护去保护，同时保留2′-保护基。例如，HF/吡啶的使用允许选择性地将TIPS去保护，同时保留硫代碳保护基。

在选择性去除TIPS保护基之后或期间，重要的是考虑可能的游离3′-羟基形成环状碳酸酯的进一步反应。2′位置上的硫代羟基碳酸酯在用HF/吡啶/CH₃CN去除TIPS期间不经历环化。另一方面，当使用HF/TEA代替HF/吡啶/CH₃CN时，硫代羟基碳酸酯或碳酸酯在一定程度上环化(见下文流程图2)。

流程图2。

尽管该环化是不期望的，但是其产生死端(dead-end)环状碳酸酯产物，所述产物可容易地与期望的产物分离。该环状物类的形成因此是一种优选的副反应，并且有益于确保最终单体产物和最后RNA寡核苷酸的完整性。该发现与对于2′-羟基使用硅烷或其它保护性基团不同，所述硅烷或其它保护性基团可从2′-羟基异构化到3′-羟基，并且产生具有可疑的5′到3′链接完整性的RNA产物。在这些使用HF的去保护反应中，也可以使用HF的复合物例如HF-TEMED或HF-TMA。也可以使用其它溶剂例如二噁烷、THF或二氯甲烷，但是在某些条件下这些溶剂可由于环状碳酸酯的形成而导致硫代羟基碳酸酯基团的部分损失。环状碳酸酯也可以容易地与想要的产物分离。

可以使用任何便利的途径保护这些新RNA单体的核碱基。一种感兴趣的途径在本领域中称为Jones过程；最初由Ti et.al.J.Am.Chem.Soc：104，1316-1319(1982)描述。Jones过程使用三甲基硅烷基氯化物对未保护的核苷暂时硅烷基化，以允许酰卤、活化的羰基或羰基酸酐与核碱基的环外胺区域特异性地反应。在该反应中，向核苷在吡啶和二氯甲烷的溶液中添加大量过量的三甲基硅烷基氯化物。这导致糖残基的所有羟基与杂碱基上的环外胺基一起被三甲基硅烷基化，并且可能与杂碱基上的亚胺基一起被三甲基硅烷基化。当被硅烷基化时，环外胺基保留其对酰卤、活化的羰基或羰基酸酐的反应性，而糖残基的羟基被保护免于与相同的试剂反应。这导致环外胺的区域特异性保护。在典型的过程中，通过在碳酸氢钠的存在下的水性后处理，从羟基部件上去除三甲基硅烷基。这一过程可以被修改为通过添加极性溶剂中的甲苯磺酸来支持非水性的后处理。对使用Markewicz保护基TIPS合成的RNA单体而言，在某些实施方式中，在进行Jones反应之前首先使未受保护的核苷与TIPS基团反应是有利的。在TIPS保护的核苷在有机溶剂中显著更加可溶的条件下，和作为5′和3′羟基被预先保护的结果，可能使用更小量过量的三甲基硅烷基氯化物。后处理后，来自这些反应的产物为N-受保护的3′，5′-四异丙基二硅氧烷核苷。该化合物随后可直接与2′-保护基反应。

用R₃-硫代羟基碳酸酯、R₃-二硫代碳酸酯或R₃-硫代羰基碳酸酯保护基保护含氮碱基还允许RNA的一步法的最终去保护，其中碱基和2′-羟基被同时去保护，这在下文中更详细地综述。

在本发明的一些其他实施方式中，可以通过相应的2′-O-硫代羟基碳酸酯之外的阻断基团保护含氮碱基。此处可再次进行RNA的一步法最终去保护，将碱基和2′-羟基同时去保护。这些种类的核苷单体可以从下述核苷开始合成，所述核苷中含氮碱基已被例如乙酰基(Ac)、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基(iBu)、苯甲酰基(Bz)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、苯氧乙酰基(Pac)、4-叔丁基苯氧乙酰基(Tac)、异丙基苯氧乙酰基(iPrPac)、苯氧基羰基、三氟甲氧基羰基、二氟甲氧基羰基、氟甲氧基羰基、三氟乙氧基羰基、4-甲基苯氧基羰基、4-乙基苯氧基羰基、4-异丙基苯氧基羰基、4-叔丁基苯氧基羰基、2-甲基苯氧基羰基、2-乙基苯氧基羰基、2-异丙基苯氧基羰基、2-叔丁基苯氧基羰基、4-甲氧基苯氧基羰基、4-乙氧基苯氧基羰基、4-异丙基氧苯氧基羰基、4-丁氧基苯氧基羰基、2-甲氧基苯氧基羰基、2-乙氧基苯氧基羰基、2-异丙基氧苯氧基羰基、2-丁氧基苯氧基羰基、苄基硫羰基、2-氯苄基硫羰基、4-氯苄基硫羰基、2，4-二氯苄基硫羰基、2-氟苄基硫羰基、3-氟苄基硫羰基、4-氟苄基硫羰基、2-三氟甲基苄基硫羰基、3-三氟甲基苄基硫羰基、4-三氟甲基苄基硫羰基、4-硝基苄基硫羰基、甲基硫羰基、乙基硫羰基、异丙基硫羰基、二甲基甲脒、二丁基甲脒、N，N-二苯基氨基甲酸酯等等保护。

在某些实施方式中，使用相同的试剂例如酰卤、活化的羰基或羰基酸酐，使核碱基上的环外胺基与2′-羟基同时被保护。在该反应流程中，可将未受保护的核苷溶于无水吡啶中，并首先与1摩尔当量的1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷反应。试剂特异性地反应，形成3′-5′环状受保护的核苷，保留外环胺的和2′-羟基部件，可用于在下一步骤中可以与酰卤、活化的羰基或羰基酸酐反应。见下文流程图3。

流程图3.

在本发明的一些其它实施方式中，通过除硫代碳酸酯之外的其它阻断基团来保护含氮碱基。这些种类的核苷单体可以从下述核苷开始合成，所述核苷中的含氮碱基已被例如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、9-芴基甲氧羰基、苯氧乙酰基、二甲基甲脒或N，N-二苯基氨基甲酸酯保护。然后可将核苷与TIPSCl₂和二硫代氯甲酸酯或硫代羰基氯甲酸酯反应，并如上文流程图1中所述进行反应。

带有R₃-硫代羟基碳酸酯、R₃-二硫代碳酸酯或R₃-硫代羰基碳酸酯保护基的单体可以使用活化的R₃-硫代羟基碳酸酯、R₃-二硫代碳酸酯或R₃-硫代羰基碳酸酯合成。合适的流程的实施方式在下文流程图4-6中展示：

流程图4.5′-O-DMT-2′-O-烃基硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺尿苷的合成

NMI(N-甲基咪唑)

HF/吡啶是由HF/吡啶：70/30：w/w制成的复合物

根据R，三苯甲基化反应可以是缓慢的，并且可以小量(0.1当量)添加NMI或DMAP以加速反应。

流程图5.5′-O-DMT-2′-O-烃基硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺-N⁴-苯氧基羰基胞苷单体

TMSCl＝三甲基硅烷基氯化物

PhC(O)OCl＝氯甲酸苯基酯

pTSO₃H＝对-甲苯磺酸

R-C(O)SCl＝硫代氯甲酸酯(乙基硫代氯甲酸酯)

DMAP-4，4′-二甲氨基吡啶

HF/吡啶是由HF/吡啶：70/30：w/w制成的复合物

三甲基吡啶是2，4，6-三甲基吡啶

NMI-N-甲基咪唑

流程图6.5′-O-DMT-2′-O-烃基硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺-N⁶-苯氧基羰基腺苷和5′-O-DMT-2′-O-烃基硫代羟基碳酸酯-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺-N⁴-苯氧基羰基鸟苷的合成

A)环外胺的保护

B)2′-羟基的选择性保护和3′亚磷酸酯化

为了合成2′-O-叔丁基硫代羟基碳酸酯(BSC)尿苷，例如如果不能获得其它试剂如叔丁基氯硫代甲酸酯时，可以使用5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)2′-O-(对-硝基苯基)碳酸酯保护的尿苷作为前体。然后使用2-甲基-2-丙硫化钠(sodium 2-methyl-2-propanethionate)来代替对硝基苯基碳酸酯，如下文流程图7中所示：

因此，作为不能获得相应的氯硫代甲酸酯时合成2′-硫代羟基碳酸酯的一般途径，可能使用相应的硫醇衍生物并使其与光气反应获得相应的氯硫代甲酸酯，或者也可能使硫醇与2′O-(对-硝基苯基)碳酸酯保护的核苷反应。

因此，作为合成2′-硫代氨基甲酸酯的一般途径，可以使二硅氧烷保护的式(V)的核苷与乙腈中的1，1′-硫羰基二咪唑在存在催化量的4-(二甲基)氨基吡啶时反应。这些反应导致受保护的核苷定量转化为式VI的咪唑硫代氨基甲酸酯和晶体产物。

式VI的化合物与乙腈中1.1当量的氨、伯胺或仲胺在催化量4-(二甲基)氨基吡啶时的反应导致定量转化为想要的2′-硫代氨基甲酸酯。在苯胺或其它弱亲核物质的情况下，可使用1当量的4-(二甲基)氨基吡啶实现完全转化为相应的硫代氨基甲酸酯。在空间上受约束的弱亲核物质(例如二氰乙基胺)的情况下，反应可采用在乙腈中与1当量4-(二甲基)氨基吡啶回流整夜，并且得到的产物可以以70％的产率被分离。这些产物可以被如下转化为活性RNA合成单体：首先用15当量到40当量的HF/吡啶去除5′，3′-四异丙基二硅氧烷保护基，产生2′-O-硫代氨基甲酸酯-核糖核苷中间产物。然后使该中间产物与DMTrCl和5当量到10当量三甲基吡啶NMI反应，产生5′-O-DMT-2′-O-硫代氨基甲酸酯-核糖核苷衍生物；然后可以使产物与选自CNEO-P(Cl)-N(iPr)₂或(二异丙基)氨基甲氧基氯膦的磷酸化试剂反应，产生5′-O-DMT-2′-O-硫代氨基甲酸酯-核糖核苷-3′-O-甲基(或-氰乙基)亚磷酰胺。

使用硫代碳保护基的核酸合成

本发明的核苷单体可用于有效地合成核酸，例如核糖核酸。所述合成可以在任一方向上进行：从3′到5′或从5′到3′。例如，在3′到5′的方向上，带有5′-OH和3′-保护基的第一核苷单体与具有3′-亚磷酰胺和5′-保护基的第二核苷单体偶联。第一核苷单体任选地与固体支持物结合。或者，合成可以在溶液中进行。在偶联步骤中，5′-OH和3′-亚磷酰胺缩合形成亚磷酸三酯键并产生二核苷酸，偶联步骤后将二核苷酸加帽/氧化，并去除5′-保护基(去保护)。所述二核苷酸可随后用于同具有3′-亚磷酰胺和5′-保护基的另一核苷单体偶联。重复这些步骤，直至核酸达到想要的长度和/或序列，并可如上文所述去除2′-保护基。在本发明的一些实施方式中，核苷单体含有被与2′-OH相同的保护基保护的碱基，因此这些保护基均可同时被去除。

由于去除这些保护基的容易性和效率，2′-羟基上和任选地位于碱基上的硫代碳保护允许合成以前不可能化学合成的长RNA序列。通过本文公开的方法的实施方式合成的核酸可以长达20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150个核苷酸或更长。另外，根据本发明合成的核酸可以与另一核酸组合，形成更长的核酸。例如，70个碱基的核酸可以通过化学连接与另一70个碱基的核酸偶联。又例如，可以用RNA连接酶连接两个核酸。在这种情况下，应当在连接前去除2′-保护基。

本发明的合成方法可以在固体支持物上完成，所述固体支持物具有可以键合化学实体的表面。在一些实施方式中，合成的多种寡核苷酸直接或间接地与相同的固体支持物连接，并且可形成阵列的一部分。“阵列”是已知单体序列的分离分子的集合，所述每条序列以空间上确定和物理地址可设定的方式排列，从而每条序列的定位是已知的。阵列中能够含有的分子数或“特征(feature)”数会很大程度上由基板的表面积、特征的大小和特征之间的间隔决定，其中阵列表面可括或不包括无特征区域代表的局部背景区。阵列的密度可达每cm²具有数十万或更多的特征，例如2,500到200,000个特征/cm²。特征可与基板共价键合或不共价键合。可互换使用的“阵列”或“化学阵列”包括可设定地址的区域的任何一维、二维或基本二维(以及三维)排列，所述区域上有与该区域关联的一个或多个特定化学部件(例如配体，例如生物聚合物，例如多核苷酸或寡核苷酸序列(核酸)、多肽(例如蛋白质)、碳水化合物、脂质等等)。下述情况下阵列是“地址可设定的”：阵列具有不同部件(例如不同多核苷酸序列)的多个区域，使得阵列上具体预定位点(即“地址”)上的区域(即阵列的“特征”或“点”)将检测具体的靶标或靶标种类(尽管特征可偶然检测到该特征的非靶标)。阵列特征一般(但不必须)被插入性间隔分开。在阵列的情况下，“靶标”应表示要通过探针(“靶标探针”)检测的移动相(典型地为流体)中的部件，所述探针在多个区域与基板结合。然而，“靶标”或者“探针”可以是要被二者中的另一个评价的一个(因此，二者之任一可以是要通过与另一个结合来评价的分析物例如多核苷酸的未知混合物)。

在一些其它的实施方式中，合成的寡核苷酸直接或间接与珠子连接。合适的固体支持物可具有多种形式和组成，并来自于天然存在的材料、已经合成修饰的天然存在的材料，或合成材料。合适的支持材料的例子包括但不限于二氧化硅，特氟隆(teflons)，玻璃，多糖例如琼脂糖(例如来自Pharmacia的)和葡聚糖(例如也来自Pharmacia的和)，聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，甲基丙烯酸羟乙基酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，等等。要在基板表面上合成的寡核苷酸的初始单体一般与链接部件键合，所述链接部件又与存在于二氧化硅基板上的表面亲水基团例如表面羟基部件结合。在一些实施方式中，使用通用链接子。在一些其它实施方式中，初始单体直接与例如表面羟基部件反应。或者，可以首先根据本发明合成寡核苷酸，在合成后通过本领域已知的任何方法将其与固体基板连接。因此，本发明可用于制备寡核苷酸阵列，其中寡核苷酸在阵列上合成，或者在合成后与阵列基板结合。

考虑到本发明的效率和容易性，可以小规模或大规模进行寡核苷酸合成。因此，在一轮完整的本方法中(一个容器中)制造的寡核苷酸量可少于微克，或者以微克、数十微克、数百微克、克、数十克、数百克或甚至千克计。

在本发明的某些实施方式中，在核糖核酸的合成中，例如在核糖核酸的固相或溶液相合成中，使用本发明的经双重保护的单体。根据本发明的合成可以在任一方向上进行：例如从3′到5′或从5′到3′。例如，在3′到5′方向上，将具有5′-OH和3′保护基的第一核苷单体与具有3′亚磷酰胺基和5′保护基的第二核苷单体偶联。例如使用固相合成方案进行合成时，第一核苷单体任选地与固体支持物结合。或者该合成可以在溶液中进行。

偶联步骤中5′-OH和3′-亚磷酰胺部件缩合形成亚磷酸三酯键并产生二核苷酸，偶联步骤后将二核苷酸加帽/氧化，并去除5′-保护基(去保护)。所述二核苷酸可随后用于与具有3′-亚磷酰胺和5′-保护基的另一核苷单体偶联。重复这些步骤，直至寡核苷酸达到想要的长度和/或序列。

因此，本发明的方面包括合成核酸的方法，所述方法包括步骤：提供具有未受保护的羟基的核苷残基，和具有2′硫代碳保护基的核苷单体；将核苷残基与2′硫代碳保护的核苷单体在下述条件下接触，所述条件足以使2′硫代碳保护的核苷单体与核苷共价键合，产生核酸。上述章节描述了合成方案的单个单体加成步骤，其中如所期望地用额外的单体重复上述过程，产生具有期望长度和序列的聚合物。如上文所述，在每个单体加成步骤之间，所述过程可包括使核酸暴露于氧化剂和去保护剂。

除了在核苷单体和寡核苷酸合成中的用途外，可有利地在其它分子中使用硫代碳保护基，所述分子中期望保护1，2或1，3-二醇部件同时最小化环状碳酸酯形成。例如，硫代碳保护基也可以用于区域选择性去保护下述醇而不去除保护基，所述醇具有除TIPS之外的硅氧烷保护基，例如TBDMS、三甲基硅烷基、三乙基硅烷基和三异丙基硅烷基。被保护的醇可以是除核苷单体或寡核苷酸之外的分子。

RNA去保护

可使用多种不同的去保护方案。去保护/氧化反应基本上可以在被报道用于合成多核苷酸的条件下进行，如例如Dellinger et al.的美国专利No.6,222,030；Dellinger et al.的美国专利No.7,135,565；Seio et al.(2001)Tetrahedron Lett.42(49)：8657-8660中所述的。考虑到本文的公开内容，本领域技术人员应当理解，用于去保护/氧化步骤的条件可根据使用的保护基的性质而变化。为了与本文所述的2′-O上的保护基相容，应当选择用于同时去保护和氧化步骤的条件(即释放3′-或5′-羟基保护基所需的条件)，使得在用于3′-或5′-羟基保护基的去保护的条件下，新生的多核苷酸的每个2′-O位点上的保护基保持稳定地与新生的多核苷酸结合。在一些实施方式中，用于去保护/氧化反应的条件包括中性到适度碱性范围内的pH。在其它实施方式中，去保护/氧化反应的pH至少约6.0，包括至少约6.5的pH，还包括至少约7.0的pH，进一步还包括至少约7.5的pH。在额外的实施方式中，pH小于约12，包括小于约11的pH，还包括小于约10.5的pH，进一步还包括小于约10的pH。

某些实施方式使用组合的去保护/氧化试剂，可以选择所述试剂来提供尤其有利的合成条件和特性，如本文所述。在一些实施方式中，组合的去保护/氧化步骤用于在中性或适度碱性的水性条件下将延伸的多核苷酸链与α效应亲核体接触，以去除反应性位点羟基保护基(例如对3′到5′方向上的合成而言为5′端，或对5′到3′方向上的合成而言为3′端)，其中保护基在亲核攻击下是不稳定的。α效应亲核体还氧化新形成的亚磷酸三酯键，得到磷酸三酯键。

去保护/氧化试剂可以是与多核苷酸的合成相容并且具有本文所述特性的任何化合物或化合物的混合物。在一些实施方式中，去保护/氧化试剂包含一定浓度的氧化剂，所述浓度高到足以快速氧化新形成的亚磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方式中，该浓度至少为0.1％体积/体积，包括至少0.5％体积/体积，还包括至少约1.0％体积/体积，进一步还包括至少约3.0％体积/体积。在这些实施方式中，氧化剂的浓度应当低到足以避免对核碱基或受保护的核碱基的可感知(例如每个合成循环少于1％)量的氧化破坏。在某些实施方式中，该浓度少于10％体积/体积，包括少于9％体积/体积，还包括少于7％体积/体积。

在一些实施方式中，在去保护/氧化反应期间的反应混合物中，去保护/氧化试剂在中性到适度碱性pH下提供了过氧阴离子(peroxyanion)的来源。过氧阴离子的浓度应当与过氧化氢物类的平衡酸解离常数相关。过氧阴离子的浓度在总过氧化氢浓度(即所有过氧化氢物类例如质子化和未质子化形式的总和)的0.01％到99％的范围内，包括占总过氧化氢浓度的0.05％到90％的范围，还包括占总过氧化氢浓度的0.1％到50％的范围，进一步还包括占总过氧化氢浓度的1.0％到30％的范围。

在某些实施方式中，具有α效应的亲核去保护剂是过氧化物或过氧化物的混合物。在一些实施方式中，进行去保护/氧化反应的pH通常在从亲核去保护试剂的pKa(即用于形成相应过氧阴离子的pKa)之下约三个pH单位到亲核去保护试剂的pKa之上约三个pH单位的范围内。在其它实施方式中，去保护/氧化反应的pH在从亲核去保护试剂的pKa之下约一个pH单位到约pH 11的范围内。在其它实施方式中，pH会是允许足够高浓度过氧阴离子形成的范围，例如从约过氧化物的pKa到约11的pH。过氧化物可以是无机的或有机的。合适的无机过氧化物包括式M+OOH-的过氧化物，其中M+是任何反离子，包括例如H+、Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+等等。在一些实施方式中，使用过氧化锂或过氧化氢及其经碱稳定的形式。合适的有机过氧化物包括式ROOH的过氧化物，其中R选自烷基、芳基、被取代的烷基、被取代的芳基和经修饰的烷基。更具体地，有机过氧化物具有式(VI)、式(VII)或式(VIII)的结构：

其中R¹³到R¹⁹独立地选自由氢、烃基、被取代的烃基、芳基和被取代的芳基组成的组。在一些实施方式中，α效应亲核体是叔丁基过氧化氢或间氯过氧苯甲酸。例如，已发现间氯过氧苯甲酸(mCPBA)过氧阴离子适用于去除反应性位点羟基上的保护基。

如上文所述，合成循环的步骤可包括偶联步骤和同时去保护/氧化步骤。在根据本发明合成多核苷酸的方法的一个实施方式中，合成循环的这些步骤可以被重复多次，以产生具有期望的序列的多核苷酸。

在一些实施方式中，在一系列偶联和去保护/氧化步骤导致具有期望的序列和长度的寡核苷酸后，使得到的寡核苷酸经历合成后去保护步骤，其中杂环和/或2′-氧上受保护的位点被去保护。例如，与得到的核苷酸的核苷酸亚单元的杂环和/或2′-位点键合的保护基可以被去除，提供去保护的寡核苷酸。

根据本发明的一些实施方式提供了用于合成后RNA去保护的方法和组合物，尤其是用于去除2′-苯并二硫杂环戊烷(2′-benzodithiolane，BDT)基团的组合物，例如pH 3.8下的HBF₄/TEMED，如下文流程图8中所示，其中Ac代表硫代碳保护基。

如上文所述，可使用多种方案从合成的聚合物上去除硫代碳保护基。在某些实施方式中，使用含氟化物离子的溶液(例如四烷基氟化铵如四甲铵、四乙铵或四丁铵)直接去除保护基。可将这些盐以合适的浓度(例如1摩尔的浓度)溶于非质子极性溶剂例如四氢呋喃、二噁烷或乙腈中。在从2′-羟基上对硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯保护基去保护时，不含酸性质子的溶液例如TBAF(四丁基氟化铵)显著比氢氟酸盐例如HF/TEMED或HF/TEA(三乙胺)表现更好。最近报道了用TBAF对氨基甲酸酯的去保护(Jacquemard et al.，Tetrahedron 60：10039-47(2004))。先前已经证明，通过将水含量保持低于5％显著地改善了不含氢氟酸的氟化物离子盐例如TBAF在去硅烷基化反应中的效率(Hogrefe et al，Nucleic Acids Research 21：479-41(1993))。还显示通过降低溶液的水含量，也显著增强了硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯的去保护效率。这些溶液可含有从2％到10％的水(v∶v)，例如从2％到6％的水，并包括从2％到4％的水。然而，通过向TBAF溶液中添加分子筛来降低这些溶液中的水含量也可以导致TBAF通过室温下称作Hoffmann消除的化学反应而分解(Cox et.al.J.Org.Chem.：493216-19(1984))。得到的降解产物产生酸性盐四丁基铵-氢二氟化物(HF₂TBA或二氟化物)。不含二氟化物的TBAF溶液显示比含有二氟化物的溶液更加快速和有效地对硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯保护基进行去保护。可能使用¹⁹F氟NMR(Sun and DiMagno，J.AM.Chem.Soc.：127，2050-51(2005))测定二氟化物含量，并通过将TBAF溶液在强碱(例如但不限于氢氧化钠或碳酸钾)中储存或者通过添加叔胺(例如但不限于三乙胺或二异丙基乙胺或四烷基铵氢氧化物，例如四丁基铵氢氧化物(TBAOH)等等)将其消除。用于对2′-羟基上的硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯或硫代羰基碳酸酯保护基进行去保护的TBAF溶液在某些实施方式中含有少于30％，例如少于5％和在某些实施方式中少于2％的二氟化物。

在某些实施方式中，TBAOH自身起到能够对2′-硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯保护基去保护的试剂的作用。事实上，已发现甚至在溶液中存在大于10％水含量时，用过量四烷基铵氢氧化物处理的TBAF溶液在这些新的2′-保护基的去保护中也高度有活性。然而，如果以与二氟化物等同的摩尔数向含二氟化物的TBAF溶液中添加TBAOH，则为了在硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯的去保护中具有高度活性，得到的去保护溶液水含量应当较低。这些TBAF/TBAOH溶液可含有2％到10％的水，例如从2％到6％的水，并包括从2％到4％的水。如果向TBAF溶液中添加超过二氟化物含量的TBAOH，则得到的溶液在硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯或硫代氨基甲酸酯保护基的去保护中是高度活性的，与水含量无关。因此总结到：

如果[TBAOH]～[HF₂TBA]，则TBAF/TBAOH中的[H₂O]＜5％

如果[TBAOH]＞[HF₂TBA]，则TBAF/TBAOH中的[H₂O]＜30％

然而，对RNA上2′-羟基的去保护中能够使用的水和四烷基铵氢氧化物的过量二者存在限制。如果极性非质子溶剂去保护溶液的水含量在存在过量四烷基铵氢氧化物时变得过高，则得到的RNA产物可以通过本领域公知的一般碱机制而被降解。在某些实施方式中，这些溶液的水含量为30％或更少，例如为10％或更少，并且包括5％或更少。类似地，如果极性非质子溶剂溶液中四烷基铵氢氧化物的浓度变得过高，则RNA产物也可以被降解。应当以30％或更少，例如25％或更少并且包括20％或更少的浓度，将四烷基铵氢氧化物溶解。也可以在极性非质子溶剂中稀释单独的(即不含TBAF的)TBAOH，使硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯、硫代羰基碳酸酯或硫代氨基甲酸酯保护基从2′-羟基去保护。然而，与含有相同稀释浓度TBAOH的TBAF溶液相比，去保护速率较低。将RNA暴露于稀释的TBAOH溶液在若干天后和2′-硫代羟基碳酸酯保护基完全去保护后导致部分RNA降解。含有过量TBAOH的1摩尔TBAF溶液(即相同稀释的TBAOH浓度下[TBAOH]＞[HF₂TBA])在数小时内给予RNA的完全去保护。另外，将RNA暴露于该TBAOH/TBAF溶液中若干天未产生任何能够观察到的期望RNA产物的降解。因此，TBAF溶液似乎具有加速去保护反应和保护RNA主链免于降解的两种作用。我们还鉴定了代替TBAF以1摩尔溶于极性非质子溶剂中并添加TBAOH的其它四烷基铵盐既能够加速硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯、硫代羰基碳酸酯或硫代氨基甲酸酯保护基的去保护又能够保护RNA主链免于降解，所述四烷基铵盐例如四丁溴化铵和四丁铵乙酸盐，所述极性非质子溶剂例如但不限于二噁烷、THF和乙腈。这些四烷基铵盐应当以0.1摩尔或更大的浓度，例如0.25摩尔或更大的浓度并且包括0.5摩尔或更大的浓度溶于极性非质子溶剂溶液中。

本发明的实施方式包括用于下述溶液的组合物，所述溶液用于使包含2′-O-硫代羰基碳酸酯基、-二硫代碳酸酯基、-硫代羟基碳酸酯基或2′-O-硫代氨基甲酸酯保护基的RNA去保护。这类组合物包括：含有受控量强碱和受控量水的TBAF，条件是当[TBAOH]～[HF₂TBA]时，TBAF/TBAOH溶液可耐受2％到10％的水，例如从2％到6％的水，并且包括2％到4％的水，当[TBAOH]＞[HF₂TBA]时，TBAF/TBAOH溶液可含有30％或更少的水，例如10％或更少的水，并且包括5％或更少的水，所述强碱例如但不限于TBAOH、NaOH、碳酸钾、四烷基铵氢氧化物和无机氢氧化物，例如但不限于LiOH、CsOH。

其它组合物包括以1摩尔浓度溶于极性非质子溶剂中的四烷基铵盐，例如四丁基按溴化物(TBAB)和四丁基铵乙酸盐(TBAA)，所述极性非质子溶剂例如但不限于二噁烷、THF和乙腈。向这些溶液中添加可溶于极性非质子溶剂中的强碱加速硫代羟基碳酸酯、二硫代碳酸酯、硫代羰基碳酸酯或硫代氨基甲酸酯保护基的去保护同时保持RNA主链免于降解，所述强碱例如但不限于TBAOH、四烷基铵氢氧化物和无机氢氧化物，例如但不限于LiOH、CsOH。

本发明的又一实施方式包括本文所述的组合物：RNA去保护溶液，其包含10％到30％(v/v)的溶于MeOH或H₂O中的1M强碱(选自四烷基铵氢氧化物和无机氢氧化物)溶液，所述强碱溶液被添加到溶于极性非质子溶剂(选自THF、二噁烷和乙腈)中的1M四丁基铵盐(选自TBAF、TBAB和TBAA)溶液中，所述RNA去保护溶液中的最终水含量少于20％(v/v)，更优选地少于10％，最优选地少于5％。

在其它实施方式中，可以在不导致RNA链破坏的条件下，使用胺使硫代羰基碳酸酯和硫代氨基甲酸酯去保护。

如所公知的，在碱性条件下，RNA通过涉及2-羟基的转酯基反应经历切割和降解[Journal of Organic Chemistry，1991.56(18)：p.5396-5401；Journal of the American Chemical Society，1999.121(23)：p.5364-5372；Chemical Reviews，1998.98(3)：p.961-990.]。水性溶液中RNA 2′-羟基的pKa可根据盐浓度和碱基序列而变化，但是典型地在13左右[Journal ofthe American Chemical Society，2001.123(12)：p.2893-2894.；J Org Chem，2003.68(5)：p.1906-10.]。(质子化的)氨的pKa约为9.2，这意味着典型地用于从合成制备的寡核苷酸上去除保护基的水性氢氧化铵溶液具有大于12的pH。在这些高pH下，大量2′-羟基被去保护，并且公知的碱催化的转酯基反应导致主链切割。

在典型的水性条件下，更强的碱例如甲胺(pKa 10.6)或三乙胺(pKa 10.6)会促进RNA主链切割，甚至比氨更容易。寡核苷酸合成典型地在碱基上使用下述保护基，所述保护基用胺碱例如氨或甲胺的水性溶液去除。在RNA的情况下，期望在该过程中2′-羟基保护是完整的，从而避免碱催化的主链切割。

然而，先前针对胺碱和2′-羟基描述的pKa是用于水性条件的。已知存在有机溶剂时弱酸和碱的电离常数可显著改变[J Biochem Biophys Methods，1999.38(2)：p.123-37.]。有机分子在双极性非质子溶剂中、尤其是在二甲基亚砜中的酸度已被广泛研究。在水中pKa为4.7的乙酸在DMSO中是pKa为12.3的更弱酸。在水中pKa约为15的甲醇在DMSO中pKa为～28。通常，对于离子化为带电阴离子物类的中性化合物(例如离子化为烷氧基阴离子的羟基)而言，减少溶剂的介电性通常导致下式酸平衡常数的降低(pKa的提高)：

因此，苯酚在水(介电常数＝78)中pKa约为10，而在DMSO(介电常数＝47)中pKa约为16，在乙腈(介电常数＝36)中pKa约为27[J.Phys.Chem.，1965.69(9)：p.3193-3196；J.Am.Chem.Soc，1968.90(1)：p.23-28；Journal of Organic Chemistry，2006.71(7)：p.2829-2838]，这是16个数量级的改变。因此在乙腈中苯酚是非常弱的酸(相应的阴离子是非常强的碱)。应当明白，溶剂的介电常数不是影响化合物pKa的唯一变量。溶剂碱性、极性、氢键和其它特异和非特异性相互作用能够影响溶剂的溶解能力，并且对溶解的溶质的pKa具有显著影响。

对于解离成中性化合物的带电化合物而言，例如对质子化的胺的解离而言，减少溶剂的介电性通常仅导致相对小量的pKa改变。

因此，(质子化的)三乙胺在水中的pKa约为11，而在DMSO中pKa约为9，在乙腈中pKa约为18。在乙腈中，三乙胺是比水中稍微更强的碱(从水中到乙腈中的δpKa为～7)，而在DMSO中其实际为更弱的碱。

结果，可以在有机溶剂中使用胺对RNA进行2′-去保护。用于降解RNA的碱催化的机制取决于碱将羟基去保护至下述程度的能力，所述程度足以使环化和切割反应可以以显著的速率发生。在对2′-羟基去质子化的胺碱水溶液的情况下，存在约4个pKa单位的差异，所述差异足够接近，从而浓缩的胺碱溶液能够显著地使羟基去质子化。然而，使用有机溶剂时，2′-羟基的pKa提高得比胺碱显著更多。在溶剂例如乙腈中，常规胺例如氨或甲胺不是足以对2′-羟基去保护的强碱。事实上，在乙腈中胺碱甚至不足以强到对苯酚去质子化。尽管氨在乙腈中是更强的碱(从水到乙腈时共轭酸的pKa从9.2提高到16.5，δpKa约为7)[J.Am.Chem.Soc，1968.90(1)：p.23-28.]，苯酚变成相对更弱的酸，其pKa从约10提高到27(δpKa为～17)。苯酚和氨的酸碱对在水中具有少于1个pKa单位的pKa差异，在乙腈中具有约10个pKa单位的pKa差异。脂肪族羟基例如RNA的2′-羟基在乙腈中的真实pKa被提高至难以测量的点(计算给出约35的pKa)。在乙腈和许多其它有机溶剂中，胺碱与脂肪族醇之间溶剂介导的平衡以超过10个数量级有利于两种中性物类，并且RNA的降解不会以可感知的速率发生。

因此，将RNA暴露于胺碱的有机溶剂溶液是对RNA的环外胺保护基以及2-羟基保护基二者进行去保护的一种实践方法。在一些有机溶剂中胺碱的亲核性甚至被增强，并且因此去保护速率甚至被增强。环外胺和2′-羟基的去保护可以同时或相继进行。只要溶液不含有足以显著改变胺与羟基的有利的pKa差异，并且适当选择保护基，则RNA的降解相对于去保护速率而言会非常低。

在其它实施方式中，期望避免试剂液体溶液的递送。胺碱例如氨或甲胺在室温和压强下是气体，并且许多胺碱在这些条件下具有显著的蒸汽压。它们可以作为气体或作为气体混合物的组分被递送，所述气体混合物中其它组分是惰性气体例如氮或氩。

在气相中，胺的碱度和醇的酸度也是对RNA的稳定性有利的。(甲胺的质子亲合力约为214kcal/摩尔，而醇(例如乙醇)的气相酸度约为370kcal/摩尔)。然而应当明白，在气相递送的情况下，任何实际的化学反应和平衡很可能受固相表面以及吸附的溶剂(包括水)的不定量和残余量的影响。我们已显示胺的气相递送是液相递送的有效替代方式，并且有时是优选的替代方式。或者，胺碱可以作为溶于有机溶剂(例如乙腈或二噁烷)的胺溶液的气相顶空组分被递送。在这种情况下，有机溶剂蒸汽也会被递送，并且在某些条件下会在固体支持物上凝结。另一种替代方式是添加纯胺，但是保持液体不直接与树脂本体接触。这可以例如如下实现：将液体添加至器皿中，其中通过使树脂位于分离的容器中而不与液体接触，或者将小量纯胺添加至相对更大量的树脂中，从而仅部分地湿润树脂。胺(例如氨和甲胺)仅在压强下为液体，并且会自发蒸发进入气相，直至(在闭合体系中)达到平衡。胺(例如丙胺和丁胺)是在室温下具有显著蒸汽压的液体，并且会蒸发至更少的程度。另一种替代性的递送方法是在有机溶剂中添加胺，但是保持液体溶液不直接与树脂本体接触。这会与纯胺递送表现相似，但是如通过溶剂的蒸汽压所决定的，得到的气相也会含有有机溶剂蒸汽。在纯胺递送的情况下，这可以在闭合的体系中完成，并且胺和溶剂会与气相达成平衡，或者可使用惰性气体流或溶剂蒸汽在开放体系中建立动态平衡。

在另一实施方式中，存在在合适的有机溶剂中或者在气相中递送胺碱溶液的显著优点，所述优点是：尽管将RNA与固体支持物表面共价连接的链接子可以被碱例如氨切割，但是RNA自身不会脱离树脂。在许多有机溶剂(例如异丙醇和乙腈)中，RNA不是可感知地可溶，和/或会保持被固体支持物吸附或与之结合。这与用胺的水溶液或DMSO溶液处理固体支持物相反，所述处理引起链接子的切割并随后将RNA溶解进水或DMSO溶液中。

在一个实施方式中，可以用胺将硫代羰基碳酸酯和硫代氨基甲酸酯从2′-羟基上切割而不导致想要的RNA的破坏。

在一个实施方式中，受硫代氨基甲酸酯保护的2′-羟基的去保护既取决于切割条件又取决于硫代氨基甲酸酯的结构。通常存在切割硫代氨基甲酸酯的大量可能的机制，在下文以用作合适胺碱的氨为例示出。所示的第一种机制针对含有仲氮的硫代氨基甲酸酯，这示出了通过形成异硫氰酸酯而进行的碱催化的反应[Canadian Journal of Chemistry-Revue Canadienne DeChimie，2005.83(9)：p.1483-1491]。

第二种机制示出了下述反应，所述反应涉及氨对羰基的攻击，随后形成硫代羰基尿素和醇[Bulletin of the Korean Chemical Society，2006.27(1)：p.143-146]。

当R＝乙基时酸性氢的pKa被评估为约为13.6[Canadian Journal ofChemistry-Revue Canadienne De Chimie，2005.83(9)：p.1483-1491]。使用相对弱的碱例如氨时，能够降低氮pKa的R基团会有利于生成阴离子中间产物的反应，所述R基团通过共振或吸电子诱导效应稳定氮上的负电荷。然而，稳定氮上负电荷的R基团也会减缓阴离子中间产物分解成为异硫氰酸酯。下述R基团以及用于攻击亲核体的低位阻会有利于随后形成硫氢基尿素和醇的竞争机制，所述R基团的负电荷足以将羰基活化为亲核攻击。在叔氮化合物的情况下，不可能有竞争异硫氰酸酯机制，并且化合物被亲核攻击时仅可氨解。

上述机制的一种可能的初始产物[Bulletin of the Korean ChemicalSociety，2006.27(1)：p.143-146]是下文示出的四面体中间产物。

这样的中间产物提示，一个或多个质子转移步骤在2′-羟基的排出和产物形成发生之前发生。合适的给质子物类的存在和反应性或者溶剂的介导可能对反应发生而言是重要的。

下文示出的一种替代性的共振的4-中心过渡态也可以是可能的，并且显示与乙腈中芳基N-乙基硫代氨基甲酸酯的氨解一起作用[Journal ofOrganic Chemistry，2005.70(14)：p.5624-5629]。

对于共振机制，使过渡态稳定化的保护基和攻击性亲核体的结构修饰是至关重要的。

在又一个实施方式中，可以使用胺将硫代羟基碳酸酯转化为氨基甲酸酯。通过使用伯胺或仲胺替换硫醇，可以将2′-O-硫代羟基碳酸酯转化为稳定的经修饰的2′-核苷酸或寡核苷酸。

核酸产物

本发明的方面还包括本发明方法的核酸产物。本发明方法的核酸产物(例如RNA)大小可以变化，在某些实施方式中长度范围从2到200或更多个单体单位，例如长度为2到100或更多个单体单位，包括长度为2到50或更多个单体单位。在某些实施方式中，产物核酸的大小范围为长度从2到25个单体单位，例如长度为15到25个单体单位，例如长度为17到23个单体单位，包括长度为19、20、21或22个单体单位。

在某些实施方式中，本发明的核酸产物具有式(VI)的结构：

其中：

B^P是如上文所定义的受保护或未受保护的含氮碱基；

Q是硫代碳保护基，例如如上文所述；

R¹²选自由氢、烃基、被取代的烃基、芳基和被取代的芳基组成的组；且

m是大于1的整数。

在额外的实施方式中，核酸具有下文式IXa到IXc的结构：

在另外的实施方式中，核酸具有下文式X的结构：

其中上述结构中的变量如上文定义。

应用

根据本发明的方法生产的产物核酸可用于多种应用，包括研究、诊断和治疗应用。例如，产物核酸可用于研究应用，例如作为探针、引物等。关于诊断应用而言，产物核酸也可用作探针、引物，或诊断方案中使用的其它药剂。关于治疗应用而言，产物核酸可用作基因治疗应用、干扰RNA(即iRNA或RNAi)应用等等中的任何DNA、RNA或其它核酸治疗剂，例如反义核酸。

根据合成的核酸所针对的应用，核酸在其合成后可以或不可以用一些方式修饰。同样，在某些实施方式中，产物核酸在合成后不被进一步修饰。还在其它实施方式中，核酸在其合成后以一些方式被修饰。

可以根据期望对产物核酸进行多种不同的修饰。例如，当产物核酸是干扰核糖核酸(iRNA)时，多种合成后修饰可以是期望的。iRNA试剂可以被进一步修饰从而与配体结合，所述配体被选择为促进稳定性、药剂(例如胆固醇)的分布或细胞摄入。主要为了iRNA实施方式方面的便利，描述以下合成后修饰。然而，这类修饰容易适应DNA实施方式，并且以下的描述同样包括这类实施方式。

可以根据期望，在从支持物上切割核酸之前或之后进行以下修饰。

未经修饰的RNA是指一种分子，其中核酸的组分(即糖、碱基以及磷酸部件)是与天然存在的(例如人体中天然存在的)相同或基本相同的。本领域将罕见或不常见的，但是天然存在的RNA称作经修饰的RNA，见例如Limbach et al.，(1994)Nucleic Acids Res.22：2183-2196。在本文中使用时，通常被称作经修饰的RNA的这类罕见或不常见的RNA(显然因为这些典型地是转录后修饰的结果)属于术语未经修饰的RNA的范围内。在本文中使用时，经修饰的RNA是指下述分子，其中核酸的一个或多个组分(即糖、碱基和磷酸部件)与天然中存在的不同，例如与人体中存在的不同。尽管它们被称作经修饰的“RNA”，但是它们因为修饰而当然包括不是RNA的分子。核苷代用品是下述分子，其中核糖磷酸主链被替换为非核糖磷酸构造，所述构造允许碱基以正确的空间关系存在，从而杂交与使用核糖磷酸主链(例如带电荷的核糖磷酸主链模拟物)观察到的杂交基本相似。本文中讨论了上述每种的例子。

本文所述的修饰可以被掺入本文所述的任何双链RNA和RNA样分子中，例如iRNA试剂中。可以期望修饰iRNA试剂的反义链和正义链之一或二者。因为核酸是亚单元或单体的聚合物，所以下文所述的许多修饰发生于核酸内重复的位置上，例如对碱基或磷酸部件或磷酸的非链接性O的修饰。在一些情况下，修饰会发生在核酸中所有受试位置上，但是在许多情况下，事实上在大部分情况下则不会。举例而言，修饰可仅发生在3′或5′末端位置上，可仅发生于末端区域，例如在末端核苷酸位置上，或者链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可发生于双链区域、单链区域或二者中。例如，非链接性O位置上的硫代磷酸酯修饰可仅发生于一个或两个末端上，可仅发生于末端区域中，例如末端核苷酸上的位置上或者链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中，或者可发生于双链和单链区域中，尤其是末端上。类似地，修饰可发生于正义链、反义链或二者上。在一些情况下，正义链和反义链会具有相同的修饰或相同种类的修饰，但是在其它情况下正义链和反义链会具有不同的修饰，例如在一些情况下可能期望仅修饰一条链，例如正义链。

向iRNA中引入修饰的两种主要目的是它们对生物学环境中降解的稳定化，和对药理特性(例如药物动力学特性)的改善，这在下文进一步讨论。对糖、碱基或iRNA试剂主链的其它合适的修饰描述于2004年1月16日提交的PCT申请No.PCT/US2004/01193中。iRNA试剂可包含非天然存在的碱基，例如2004年4月16日提交的PCT申请No.PCT/US2004/011822中所述的碱基。iRNA试剂可包含非天然存在的糖，例如非碳水化合物环状载体分子。用于iRNA试剂中的非天然存在的糖的示范性特征描述于2003年4月16日提交的PCT申请No.PCT/US2004/11829中。

iRNA试剂可包含适用于提高核酸酶抗性的核苷酸间键(例如手性硫代磷酸酯键)。另外，或者替代性地，iRNA试剂可包含用于提高核酸酶抗性的核糖模拟物。用于提高核酸酶抗性的示范性的核苷酸间键和核糖模拟物描述于2004年3月8日提交的PCT申请No.PCT/US2004/07070中。

iRNA试剂可包含用于寡核苷酸合成的与配体缀合的单体亚单元和单体。示范性的单体描述于2004年8月10日提交的美国申请No.10/916,185中。iRNA试剂具有ZXY结构，例如2004年3月8日提交的PCT申请No.PCT/US2004/07070中描述的ZXY结构。iRNA试剂可与两性部件络合。适用于iRNA试剂的示范性两性部件描述于2004年3月8日提交的PCT申请PCT/US2004/07070中。

在另一实施方式中，iRNA试剂可以与具有模块络合物的递送剂络合。络合物可包含与以下中的一个或多个(例如两个或更多，包括所有三个)链接的运载剂：(a)缩合剂(例如能够例如通过离子或静电相互作用来吸引(例如键合)核酸的试剂)；(b)融合剂(例如能够融合和/或通过细胞膜转运的试剂)；和(c)靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如与特定细胞类型结合的凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。与递送剂络合的iRNA试剂描述于2004年3月8日提交的PCT申请No.PCT/US2004/07070中。

iRNA试剂可具有不规范的配对，例如在iRNA双链体的正义和反义序列之间的配对。不规范的iRNA试剂的示范性特征描述于2004年3月8日提交的PCT申请No.PCT/US2004/07070中。

iRNA试剂可具有增强的对核酸酶的抗性。为了增强核酸酶抗性和/或与靶标的亲合力，iRNA试剂(例如iRNA试剂的正义和/或反义链)可包含例如2′-经修饰的核糖单位和/或硫代磷酸酯键。例如，2′-羟基(OH)可以被修饰或被大量不同的“氧”或“脱氧”取代基替换。

“氧”-2′-羟基修饰的例子包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙烯二醇(PEG)，O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OR；“封闭的”核酸(LNA)，其中2′-羟基例如通过亚甲基桥与相同核糖的4′碳连接；O-AMINE和氨基烷氧基、O(CH₂)_nAMINE(例如AMINE＝NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、多聚氨基)。值得注意的是仅含有甲氧基乙基(MOE)(OCH₂CH₂OCH₃，PEG衍生物)的寡核苷酸显示可与经充分的硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸相比的核酸酶稳定性。

“脱氧”修饰包括氢(即脱氧核糖，尤其与部分ds RNA的悬突相关)；卤素(例如氟)；氨基(例如NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH₂CH₂NH)_nCH₂CH₂-AMINE(AMINE＝NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、或二杂芳基氨基)；-NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)，氰基；巯基；烷基-硫-烷基；硫代烷氧基；和烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可任选地被例如氨基官能团取代。

提高抗性的一种方式是鉴定切割位点并修饰这类位点从而抑制切割，如2004年5月4日提交的美国申请No.60/559,917中所述。例如，二核苷酸5′-UA-3′、5′-UG-3′、5′-CA-3′、5′-UU-3′或5′-CC-3′可起到切割位点的作用。因此，可通过修饰5′核苷酸实现增强的核酸酶抗性，得到例如至少一个5′-尿苷-腺嘌呤-3′(5′-UA-3′)二核苷酸，其中所述尿苷为2′-经修饰的核苷酸；至少一个5′-尿苷-鸟嘌呤-3′(5′-UG-3′)二核苷酸，其中所述5′-尿苷是2′-经修饰的核苷酸；至少一个5′-胞苷-腺嘌呤-3′(5′-CA-3′)二核苷酸，其中所述5′-胞苷是2′经修饰的核苷酸；至少一个5′-尿苷-尿苷-3′(5′-UU-3′)二核苷酸，其中所述5′-尿苷是2′-经修饰的核苷酸；或至少一个5′-胞苷-胞苷-3′(5′-CC-3′)二核苷酸，其中所述5′-胞苷是2′-经修饰的核苷酸。iRNA试剂可包含至少2个、至少3个、至少4个或至少5个这类二核苷酸。在某些实施方式中，iRNA试剂的所有嘧啶都带有2′-修饰，并且因此iRNA试剂具有增强的对内切核酸酶的抗性。

为了最大化核酸酶抗性，可以与一个或多个磷酸链接子修饰(例如硫代磷酸酯)组合使用2′修饰。所谓的“嵌合”寡核苷酸是含有两种或更多不同修饰的寡核苷酸。

寡核苷酸主链中包含呋喃糖也能减少内切核酸切割(endonucleolyticcleavage)。可以通过包含3′阳离子基团，或者通过用3′-3′键转化3′-端的核苷来进一步修饰iRNA试剂。在另一种替代方式中，可以用氨基烷基例如3′C5-氨基烷基dT封闭3′端。其它3′缀合物可抑制3′-5′外切核酸切割(exonucleolytic cleavage)。尽管不受理论束缚，但是3′缀合物(例如萘普生或布洛芬)可通过立体阻断外切核酸酶与寡核苷酸的3′端结合而抑制核酸外切切割。甚至小的烷基链、芳基或杂环缀合物或经修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)也能够阻断3′-5′-外切核酸酶。

类似地，5′缀合物能够抑制5′-3′外切核酸切割。尽管不受理论束缚，但是5′缀合物，例如萘普生或布洛芬，可以通过立体阻断外切核酸酶与寡核苷酸的5′-端结合而抑制核酸外切切割。甚至小的烷基链、芳基或杂环缀合物或经修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)也能够阻断3′-5′-外切核酸酶。

当双链体iRNA试剂在至少一个末端包含单链核苷酸悬突时，iRNA试剂可具有提高的对核酸酶的抗性。在一些实施方式中，核苷酸悬突包含1到4个未配对的核苷酸，在其它实施方式中，包含2到3个未配对的核苷酸。在一个实施方式中，与末端核苷酸对直接相邻的单链悬突的未配对的核苷酸含有嘌呤碱基，并且末端核苷酸对是G-C对，或最后四个互补核苷酸对中至少两个是G-C对。在其它实施方式中，核苷酸悬突可具有1或2个未配对的核苷酸，并且在示范性的实施方式中，核苷酸悬突是5′-GC-3′。在某些实施方式中，核苷酸悬突位于反义链的3′-端。在一个实施方式中，iRNA试剂在反义链的3′-端包含基序5′-CGC-3′，从而形成2-核苷酸悬突5′-GC-3′。

因此，iRNA试剂可包含修饰，从而抑制受试者体内存在的例如核酸酶(例如内切核酸酶或外切核酸酶)造成的降解。这些单体在本文中称作NRM，或核酸酶抗性促进单体，其相应的修饰称作NRM修饰。在许多情况下，这些修饰同样会调控iRNA的其它特性，例如与蛋白质相互作用的能力，或者第一和第二序列彼此形成双链体或者与另一序列(例如靶分子)形成双链体的能力，所述蛋白质例如为转运蛋白，例如血清白蛋白或RISC家族成员。

可以向iRNA试剂中或iRNA试剂的序列中引入一种或多种不同的NRM修饰。NRM修饰可以在序列中或iRNA试剂中使用多于一次。

NRM修饰包括仅可置于末端的一些修饰，和能够位于任何位置的其它修饰。能够抑制杂交的一些NRM修饰仅可用于末端区域，而不能位于靶向受试序列或基因的切割位点中或者序列的切割区域中，尤其是不能位于反义链上。它们可以在正义链中任何位置使用，条件是保持ds iRNA试剂的两条链之间充分杂交。在一些实施方式中，期望将NRM置于切割位点中或者正义链的切割区域中，因为其能够最小化脱靶沉默(off-targetsilencing)。

在某些实施方式中，NRM修饰应当有差异地分布，这取决于它们是包含在正义链还是反义链上。如果包含在反义链上，则不应在进行RISC介导的切割的区域中插入干扰或者抑制内切核酸酶切割的修饰，所述区域例如为切割位点或者切割区域(如Elbashir et al.，2001，Genes and Dev.15：188中所述，其通过引用并入本文)。靶标的切割发生于20或21个核苷酸反义链的中间，或者与反义链互补的靶mRNA上第一核苷酸上游约10或11个核苷酸处。在本文中使用时，切割位点是指靶mRNA上或者与之杂交的iRNA试剂链上，切割位点任一侧的核苷酸。切割区域表示任一方向上切割位点的1、2或3个核苷酸以内的核苷酸。

这些修饰可被引入下述序列的末端区域，例如末端位置上或者末端的2、3、4或5个位置上，所述序列靶向或者不靶向受试者中的序列。

可以例如通过引入配体(例如系链配体(tethered ligand))来影响和改造iRNA试剂的特性，包括其药理学特性。可以将多种实体例如配体与iRNA试剂系链，例如与配体-缀合的单体亚单元的运载体系链。下文在配体-缀合的单体亚单元的语境中描述了例子，但是所述例子仅是优选的，实体可以偶联在iRNA试剂的其它位点上。

感兴趣的配体是通过介入的系链直接或间接与运载体(例如共价)偶联的配体。在某些实施方式中，配体通过介入的系链与运载体结合。当配体-缀合的单体被结合进伸长链中时，配体或系链的配体可存在于配体-缀合的单体上。在一些实施方式中，可以在向伸长链中掺入“前体”配体-缀合的单体亚单元之后，将配体掺入“前体”配体-缀合的单体亚单元中。例如，具有例如氨基-末端系链(例如TAP-(CH₂)nNH₂)的单体可以被掺入生长的正义或反义链中。在随后的操作中，即将前体单体亚单元掺入链中以后，可以随后通过将配体的亲电子基团与前体配体-缀合的单体亚单元系链的末端亲核基团偶联，将具有亲电子基团(例如五氟苯基酯或醛基)的配体与前体配体-缀合的单体结合。

在某些实施方式中，配体改变iRNA试剂的分布、靶向或寿命，所述iRNA试剂是其中掺入所述配体的iRNA试剂。在优选的实施方式中，配体提供了与不含这类配体的物种相比针对选定的靶标增强的亲和力，所述靶标例如分子，细胞或细胞类型，区室，例如细胞或器官区室，机体的组织、器官或区域。

感兴趣的配体能够改善转运、杂交和特异性特性，并且也可以改善以下的核酸酶抗性：得到的天然或经修饰的寡聚核糖核苷酸，或包含本文所述单体任何组合的多聚体分子，和/或天然或经修饰的核糖核苷酸。配体通常可包含例如用于增强摄取的治疗性修饰剂；例如用于监测分布的诊断性化合物或报告子基团；交联剂；赋予核酸酶抗性的部件；和天然或不常见的核碱基。一般性例子包括亲脂分子，脂质，凝集素，类固醇(例如熊果醇、hecigenin、薯蓣皂苷元(diosgenin))，萜类(例如三萜类，例如菝葜皂苷元(sarsasapogenin)，木栓酮(Friedelin)、表木栓烷醇(epifriedelanol)衍生的石胆酸)，维生素，碳水化合物(例如葡聚糖，普鲁兰糖(pullulan)，甲壳质，壳聚糖，菊糖，环糊精或透明质酸)，蛋白质，蛋白质结合剂，整联蛋白靶向分子，多聚阳离子，肽，多胺，和肽模拟物。

配体可以是天然存在的或重组的或合成的分子，例如合成的聚合物，例如合成的多聚氨基酸。多聚氨基酸的例子包括以下多聚氨基酸：多聚赖氨酸(PLL)，多聚L-天冬氨酸，多聚L-谷氨酸，苯乙烯-马来酸酐共聚物，多聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物，二乙烯醚-马来酸酐共聚物，N-(2-羟丙基)异丁烯酰胺共聚物(HMPA)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚氨酯，聚(2-乙基丙烯酸)，N-异丙基丙烯酰胺聚合物，或聚磷杂吖嗪(polyphosphazine)。多胺的例子包括：聚氮丙啶(polyethylenimine)，多聚赖氨酸(PLL)，精胺，亚精胺，多胺，假肽-多胺，拟肽多胺，树状聚体多胺，精氨酸，脒，鱼精蛋白，阳离子部件，例如阳离子脂质，阳离子卟啉，多胺的季盐，或α螺旋肽。

配体也可包含靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如促甲状腺激素、促黑激素、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、糖基化的多聚氨基酸、转铁蛋白、二磷酸酯(bisphosphonate)、多聚谷氨酸酯、多聚天冬氨酸酯，或RGD肽或RGD肽模拟物。

配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，脂蛋白，例如低密度脂蛋白(LDL)，或白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或肽，例如对共配体具有特异亲和力的分子，或者抗体，例如与特定细胞类型(例如癌细胞、内皮细胞或骨细胞)结合的抗体。配体也包括激素和激素受体。它们也可以包含非特异性肽的物类，例如辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖或多价果糖。配体可以例如为脂多糖，p38MAP激酶的活化剂或者NF-κB的活化剂。

配体可以是能够提高iRNA吸收进入细胞的物质，例如药物，所述提高例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝来实现。药物可以例如是泰克松(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素(cytochalasin)、诺考达唑、Japlakinolide、红海海绵素A、鬼笔毒环肽、Swinholide A、Indanocine或Myoservin。

在一个方面中，配体是脂质或基于脂质的分子。这样的脂质或基于脂质的分子结合血清蛋白质，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许缀合物分布至靶组织，例如肝组织，包括肝的实质细胞。能够结合HSA的其它分子也可以被用作配体。例如，可以使用Neproxin或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体能够(a)提高对缀合物降解的抗性，(b)提高进入靶细胞或细胞膜的靶向或转运，和/或(c)能够被用于调节与血清蛋白质例如HSA的结合。

基于脂质的配体可以被用于调控，例如控制缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体会更不可能被靶向肾，因此更不可能从体内清除。更不强烈结合HSA的脂质或基于脂质的配体可被用于将缀合物靶向肾。还感兴趣的是WO/2005/023994中描述的脂质修饰；其公开内容通过引用并入本文。

在另一方面中，配体是被靶细胞(例如增殖细胞)吸收的部件，例如维生素或营养物。它们尤其适用于治疗特征为不想要的细胞增殖，例如恶性或非恶性类型的、例如癌细胞的细胞增殖的病症。示范性的维生素包括维生素A、E和K。其它示范性维生素包括B族维生素，例如叶酸，B12，核黄素，生物素，吡哆醛或者癌细胞吸收的其它维生素或营养物。

在另一方面中，配体是细胞渗透剂、螺旋细胞渗透剂。在一些实施方式中，试剂是两性的。一种示范性的试剂是肽，例如tat或触角足(antennapedia)。如果所述试剂是肽，则其可以被修饰，包括肽基模拟物、反转异构体(invertomers)、非肽或假肽键，和D-氨基酸的使用。螺旋试剂可以是α-螺旋剂，其可具有亲脂相和疏脂相。

在某些实施方式中，iRNA试剂是5′磷酸化的，或者在5′初始末端包含磷酰基类似物。反义链的5′-磷酸修饰包括可与RISC介导的基因沉默相容的修饰。合适的修饰包括：5′-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5′)；5′-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-鸟苷帽(7-甲基化或未甲基化)(7m-G-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-腺苷帽(Appp)，和任何经修饰或未经修饰的帽结构。其它合适的5′-磷酸修饰会是技术人员已知的。

可以修饰正义链，从而使正义链失活并防止形成活性RISC，从而可能降低脱靶效应。这可以通过防止正义链5′-磷酸化的修饰完成，例如通过用5′-O-甲基核糖核苷酸修饰来完成(见Nykanen et al.，(2001)ATPrequirements and small interfering RNA structure in the RNA interferencepathway.Cell 107，309-321.)。也可以使用防止磷酸化的其它修饰，例如用H而不是O-Me简单地取代5′-OH。或者，可以对5′-磷酸酯添加巨大的庞大基团，使其成为磷酸二酯键。

需要时，可以将本文所述的核酸(例如iRNA、DNA等)试剂配制为用于施用给受试者，例如肠胃外施用，例如通过注射、口、局部施用至眼等。同样，可以将核酸与可药用的介质组合，提供药物组合物。为了易于解释，在这一章节中主要关于未经修饰的iRNA试剂讨论配制物、组合物和方法。然而，应当理解这些配制物、组合物和方法可以用其它iRNA试剂(例如经修饰的iRNA试剂)实践，并且这类实践属于本发明。

经配制的iRNA试剂组合物可呈现多种状态。在一些例子中，组合物至少部分是结晶、均一的结晶和/或无水的(例如少于80％、50％、30％、20％或10％的水)。在另一例子中，iRNA试剂是水相，例如处于包含水的溶液中，该形式是通过吸入施用的优选形式。水相或者结晶组合物可以被掺入递送介质例如脂质体(尤其是用于水相)或颗粒(例如微粒可适用于结晶组合物)中。通常以与预期的施用方法相容的方式配制iRNA试剂组合物。

iRNA试剂制剂可以与另一试剂组合配制，所述另一试剂例如为另一治疗性试剂或稳定iRNA试剂的试剂，例如与iRNA试剂络合形成iRNP的蛋白质。还有其它药剂包括螯合剂例如EDTA(例如用以去除二价阳离子例如Mg24)，盐，RNAse抑制剂(例如光谱特异性的RNAse抑制剂，例如RNAsin)等等。

在一个实施方式中，iRNA试剂制剂包含另一iRNA试剂，例如能够介导关于第二基因的RNAi的第二iRNA试剂。还有其它制剂可包含至少三种、五种、十种、十二种、十五种或成百中或更多不同的iRNA物类。在一些实施方式中，试剂指向相同的基因，但是指向不同的靶序列。

可以通过与适当的、可药用的介质(即载体或稀释剂)组合，将核酸配制为药物组合物，并且可以将核酸配制为固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。同样，药剂的施用可以以多种方式实现，包括口、颊、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、经皮、气管内等等施用。

在药物剂型中，药剂可以单独施用，或者与其它有药物活性的化合物适当地关联以及组合施用。以下的方法和赋形剂仅用于举例而不以任何方式限制。

对口服制剂而言，药剂可以单独使用或者与制造片剂、粉末、颗粒或胶囊的适当添加剂组合使用，例如与常规的添加剂例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂例如微晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶组合；与崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂例如滑石或硬脂酸镁组合；和需要时与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和调味剂组合。

可以通过将药剂溶于、分散于或乳化于水性或非水性溶剂中，将药剂配制为用于注射的制剂，所述溶剂例如植物油或其它类似的油，合成的脂肪酸甘油酯，高级脂肪酸或丙二醇的酯；并且在需要时含有常规添加剂，例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

药剂可以在要通过吸入施用的气雾剂配制物中使用。本发明的化合物可以被配制进加压的可用推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。

另外，可以通过将药剂与多种基质混合来制造栓剂，所述基质例如乳化基质或水溶性基质。本发明的化合物可以通过栓剂被直肠施用。栓剂可包含介质例如可可脂、碳蜡和聚乙二醇，所述介质在体温下融化但是在室温下固化。

可以提供用于口或直肠施用的单位剂型例如糖浆剂、酏剂和悬浮液，其中每个剂量单位(例如茶匙、汤匙、片剂或栓剂)含有预定量的含有一种或多种抑制剂的组合物。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可在组合物中包含抑制剂，所述组合物为无菌水、生理盐水或另一可药用运载体中的溶液。

在本文中使用时，术语“单位剂型”是指适合用作人和动物受试者的单位剂量的物理离散的单位，每个单位含有以下述用量计算的预定量的本发明化合物，所述用量足以与可药用的稀释剂、运载体或介质一起产生期望的效果。本发明的新单位剂型的规格取决于使用的具体化合物和要达到的效果，以及与宿主中每种化合物相关的药物效应动力学。

可药用的赋形剂例如介质、佐剂、运载体或稀释剂是公众容易获得的。另外，可药用的辅助物质例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等等是公众容易获得的。

也可以通过其它途径，包括微注射或泡囊的融合，向组织或宿主细胞中引入核酸。也可以使用快速注射进行肌内施用，如Furth et al.(1992)，Anal Biochem 205：365-368所述。核酸可以被包裹在金微粒上，并通过粒子轰击设备或“基因枪”皮内递送，如文献中所述(见例如Tang et al.(1992)，Nature 356：152-154)，其中用DNA包裹金微粒，然后将其轰击进皮肤细胞中。感兴趣的其它核酸递送方案包括但不限于以下中所述方案：感兴趣的美国专利，包括5,985,847和5,922,687(其公开内容通过引用并入本文)；WO/11092；Acsadi et al.，New Biol.(1991)3：71-81；Hickman etal.，Hum.Gen.Ther.(1994)5：1477-1483和Wolff et al.，Science(1990)247：1465-1468；等。见例如上文所述病毒介导和非病毒介导的递送方案。相应地，感兴趣的是用于这类递送方法中的药物介质。

通过所述方法的实施方式产生的核糖核酸可用于多种不同的应用，包括但不限于差别基因表达分析，基因沉默应用，核酸文库生产应用和治疗性应用(例如在反义RNA、siRNA的生产等中)。根据本发明的实施方式生产的RNA的这类应用类型的其它细节在2004年10月8日提交，并且在2006年4月13日作为US-2006-0078889-A1公布的题为″Array-BasedMethods for Producing Ribonucleic Acids，″的未决美国专利申请No.10/961,991中提供；其公开内容通过引用并入本文。

试剂盒

还感兴趣的是用于实践本发明的某些实施方式的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包含至少2种不同的受保护的单体，例如根据本发明的2′硫代碳保护的核苷单体，其中试剂盒可包含具有相同核碱基的单体，或者包含不同核碱基例如A、G、C和U的单体。试剂盒还可包含本发明方法中使用的另外的试剂，例如缓冲液、氧化剂、加帽剂、切割剂等。

一个特异的实施方式包含四种这类核苷单体，分别包括腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶。腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶中每种任选地被例如相同的硫代碳保护基保护，所述硫代碳保护基保护核苷的2′-OH。核苷单体任选地包含5′-保护基(例如DMT)、3′-保护基，和/或亚磷酰胺基团。试剂盒还可包含用于RNA合成后去保护的试剂，例如TBAF，tBuOOH，H₂O₂，HF，HF-吡啶，HF-TEMED HF-TEA，吡啶，TEMED，纯烷基胺，有机溶剂中的胺，纯胺或溶剂体系中的混合物，和/或TEA或TBAH。

一些其它试剂盒实施方式包含适用于制备核苷单体前体的组分。所述试剂盒可包含TIPSCl₂和二硫代氯甲酸酯或硫代羰基氯甲酸酯。试剂盒还可包含试剂例如HF、吡啶、CH3CN、含DMT的封闭剂(例如DMT氯化物)和/或CH₃OP(NiPr₂)₂。试剂盒可包含例如上文所述的去保护剂/组合物。试剂盒还可包含未受保护的核糖核苷单体，例如腺苷、尿苷、尿苷和/或胞苷。

在某些实施方式中，试剂盒还会包含实践受试方法的说明书或获得所述说明书的手段(例如指导使用者进入提供说明书的网页的网站URL)，其中这些说明书可以印刷在基材上，其中所述基材可以是以下的一个或多个：包装插入页、包装、试剂容器等等。在受试试剂盒中，一种或多种组分可根据便利或者期望而存在于相同或不同的容器中。

以下的实施例例证了本发明化合物的合成，并且不旨在限制附带的权利要求中公开的本发明的范围。

实施例

I.多种2′-硫代羟基碳酸酯单体的合成。

A.5′-O-DMT-2′-O-硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺尿苷的合成

NMI(N-甲基咪唑)

HF/吡啶是由HF/吡啶：70/30：w/w制成的复合物

根据R，三苯甲基化反应可以是缓慢的，并且可以小量(0.1当量)添加NMI或DMAP来加速反应。为了合成2′-O-叔丁基硫代羟基碳酸酯(BSC)尿苷，可以使用受5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)2′-O-(对硝基苯基)碳酸酯保护的尿苷作为前体。如下文所述，2-甲基-2-丙硫化钠可被用于置换对硝基苯基碳酸酯。

作为其中相应的氯硫代甲酸酯不可得的合成2′-硫代羟基碳酸酯的一般途径，可能使用相应的硫醇衍生物，并使其与光气反应获得相应的氯硫代甲酸酯，或者也可能使硫醇与2′O-(对硝基苯基)氧羰基保护的核苷反应。

B.5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)2′-O-叔丁基硫羰基(BSC)尿苷的合成：

将5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)2′-O-(对-硝基苯基)碳酸酯保护的尿苷(15mmole)与吡啶共同蒸发3次，然后用真空泵干燥4小时。添加无水吡啶(150mL)和2-甲基-2-丙硫化钠(24mmole)，将混合物在室温下搅拌16小时。使用己烷与EtOAc(0-30％)的梯度，通过柱色谱纯化产物。产率76.4％；ESI MS：609(M+Li)，637(M+Cl)

C.5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)2′-O-乙基硫羰基(ESC)尿苷的合成：

将5′，3′-O-(T四异丙基而硅氧烷-1，3-二基)尿苷(15mmole)与吡啶共蒸发3次，然后用真空泵干燥12小时。添加无水吡啶(150mL)和氯硫代甲酸乙酯(ethyl chlorothioformate)(18mmole)，并将混合物在室温下搅拌16小时。使用含氯仿梯度(50-100％)的己烷，通过柱色谱纯化产物。

产率74.3％

ESI MS：581(M+Li)，609(M+Cl)

D.受TIPS 2′-O-硫羰基保护的尿苷的去除：

小心地将氟化氢-吡啶复合物(HF∶Py 7∶3，7mL)倒入冰冷的吡啶(8mL)在乙腈(46.5mL)中的溶液中。然后将由此形成的吡啶-HF试剂(32mL)转移至含有被5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)2′-O-碳酸酯保护的尿苷(10mmole)中，并将混合物在室温下搅拌2小时。用50％的氯化钙水溶液(300mL)淬灭反应。用EtOAc萃取粗产物(3-5次)，并用无水Na₂SO₄干燥。过滤后将有机层浓缩至干燥，并用真空泵处理16小时。

产率85-100％；

ESI MS：

BSC类似物：361(M+1)，383(M+Na)，399(M+K)

ESC类似物：333(M+1)，355(M+Na)，371(M+K)

E.5′-O-DMT 2′-O-硫羰基保护的尿苷3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺：

将2′-O-硫代羟基碳酸酯保护的尿苷(3mmole)用真空泵干燥6小时。添加无水THF(30mL)、2，4，6-三甲基吡啶(22.5mmole)和二甲氧基三苯甲基氯化物(3.3mmole)，将混合物在室温下搅拌直至TLC(CHCl₃/MeOH 9∶1)显示核苷底物完全消失(16-24小时)。一次性添加2，4，6-三甲基吡啶(3mmole)和1-甲基咪唑(1.5mmole)，并在10-15分钟内向反应混合物中缓慢添加N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯(N，N-diisopropylmethyl phosphonamidicchloride)。然后将反应混合物再搅拌2小时。真空去除溶剂，并使用含EtOAc(0-50％)梯度的己烷，通过柱色谱纯化粗产物。

产率60-65％

ESI MS：

ESC单体：802(M+Li)，830(M+Cl)

BSC单体：830(M+Li)，858(M+Cl)

³¹P NMR(CDCl₃)：

ESC单体：152.33，151.72

F.5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)2′-O-乙基硫羰基(ESC)N4-苯氧基羰基胞苷的合成

通过与无水吡啶共同蒸发，干燥5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)核糖胞苷(10mMole，4.85g)。将该化合物溶于100ml无水吡啶中，并添加三甲基氯甲硅烷(5当量，50mMole，6.34ml)。将混合物在室温下搅拌2小时并添加氯甲酸苯酯(phenylchloroformate)(1.2当量，12mMole，1.51ml)。将反应在室温下搅拌2小时。通过添加2ml甲醇淬灭过量的氯甲酸酯，通过饱和的碳酸氢钠水溶液稀释反应。用二氯甲烷萃取该溶液。然后在硫酸钠上干燥有机层，并蒸发至干燥。

将该反应的粗产物在160ml二氯甲烷和30ml THF中的5.7g对甲苯磺酸中稀释。将反应在室温下搅拌15分钟。通过添加200ml饱和的碳酸氢钠水溶液，淬灭反应。用二氯甲烷萃取该溶液，将有机层在硫酸钠上干燥并蒸发至干燥。

通过与无水吡啶共同蒸发来干燥粗产物，将其溶于100ml无水吡啶中，并添加氯硫代甲酸乙酯(1.7当量，1.76ml)和DMAP(0.1当量，0.122g)。将反应在室温下搅拌过夜，然后通过碳酸氢钠的饱和水溶液稀释。用二氯甲烷萃取该混合物，将有机层在硫酸钠上干燥，并蒸发至干燥。通过柱色谱纯化粗产物(环己烷/乙酸乙酯75/25)。获得呈泡沫状的产物(4g，4步骤后60％)。

¹H NMR 400MHz(CDCl₃)：8.2(s，1H)；7.45-7.2(m，5H)；5.95(s，1H)；5.55(d，1H)；4.35(m，1H)；4.3(d，1H)；4.2-3.95(m，2H)；2.95-2.8(m，2H)；1.3(t，3H)；1.15-0.95(m，27H)G

质谱ESI：700.2274[M+Li]⁺

G.2′-O-乙基硫羰基N⁴-苯氧基羰基胞苷

通过与无水乙腈共同蒸发来干燥5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)2′-O-乙基硫代羟基碳酸酯N⁴-苯基氨基甲酸酯胞苷(2.57g，5.7mmole)，然后稀释于40ml无水乙腈中并添加HF/吡啶(30当量HF，4.33ml)，并将反应在室温下搅拌5小时。通过添加CaCl₂溶液淬灭氟化物，并用二氯甲烷萃取产物。将有机层在硫酸钠上干燥并蒸发至干燥。

将粗产物与无水乙腈共同蒸发，然后溶于40ml无水THF中，并向反应中添加10当量(7.55ml)的2，4，6-三甲基吡啶。添加DMTC1(1.2当量，2.31g)，并将反应在室温下搅拌3小时。再添加0.5当量的2，4，6-三甲基吡啶(3.3ml)、0.5当量(0.22ml)的N-甲基咪唑和2.5当量(2.75ml)的N，N-二异丙基甲基-膦酰胺氯。将反应在室温下搅拌4小时。用饱和的碳酸氢钠水溶液稀释混合物，并用二氯甲烷萃取。将有机层在硫酸钠上干燥并蒸发至干燥。通过柱色谱纯化粗产物(环己烷/乙酸乙酯/吡啶75/25/5到20/75/5)。获得呈淡黄色泡沫状的期望产物(1.64g，3步骤后31％)。

³¹P NMR 400MHz(CD₃CN)：151.709-151.325

质谱ESI：921.332[M+Li]⁺

H.环外腺苷基氨基的保护

将5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)腺苷(3.9mMole，2g)与无水吡啶共同蒸发两次。将该化合物溶于20ml无水吡啶中，并添加三甲基氯甲硅烷(5当量，19.6mMole，2.48ml)。将混合物在室温下搅拌30分钟，并添加氯甲酸苯酯(2当量，7.84mMole，0.98ml)。将反应在室温下搅拌2小时。然后向反应中添加5ml水，并在室温下将混合物再搅拌2小时。然后用饱和的碳酸氢钠水溶液稀释反应。用二氯甲烷萃取该溶液。然后在硫酸钠上干燥有机层，并蒸发至干燥。通过柱色谱纯化粗产物(CH₂Cl₂到CH₂Cl₂MeOH 90/10)。获得呈白色泡沫的产物(0.62g，25％)

¹H NMR 400MHz(CDCl₃)：9.85(s，1H)；8.75(s，1H)；8.2(s，1H)；7.4-7.2(m，5H)；6.05(s，1H)；5.05(m，1H)；4.65(d，1H)；4.15-4(m，4H)；3.75(s，1H)；1.15-0.95(m，27H)

I.5′-O-DMT-2′-O-乙基硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺-N⁶-苯氧基羰基腺苷的合成

通过与无水吡啶共同蒸发来干燥5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)N⁶-苯氧基羰基腺苷(0.62g，1mMole)，并将其溶于5ml无水吡啶中。添加氯硫代甲酸乙酯(1.7当量，2mMole，0.208m)和DMAP(0.1当量，0.012g)。将反应在室温下搅拌过夜，然后用饱和的碳酸氢钠水溶液稀释。用二氯甲烷萃取粗反应混合物。将有机层在硫酸钠上干燥并蒸发至干燥。

通过与乙腈共同蒸发来干燥粗产物，然后将其稀释于5ml无水乙腈中。添加HF/吡啶(30当量HF，0.375ml)，并将反应在室温下搅拌5小时。通过添加CaCl₂淬灭氟化物，并用二氯甲烷萃取产物。在硫酸钠上干燥有机层并蒸发至干燥。

通过与无水乙腈共同蒸发来干燥粗产物，然后添加5ml THF和10当量(1.35ml)的2，4，6-三甲基吡啶。添加DMTC1(1.2当量，0.4g)，并将反应在室温下搅拌2小时。再添加5当量的2，4，6-三甲基吡啶(0.7ml)和0.5当量(0.039ml)的N-甲基咪唑和2.5当量(1.45ml)的N，N-二异丙基甲基-膦酰胺氯。将反应在室温下搅拌2小时。用饱和的碳酸氢钠水溶液稀释混合物，并用二氯甲烷萃取。将有机层在硫酸钠上干燥并蒸发至干燥。通过柱色谱(己烷/乙酸乙酯/吡啶75/20/5到20/75/5)纯化粗产物。获得程白色泡沫的预期产物。

³¹P NMR 400MHz(CDCl₃)：152.925-152.040

J.5′-O-DMT-2′-O-硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺N⁴-硫羰基胞苷、N⁴-硫羰基尿苷和N⁶-硫羰基腺苷的合成。

II.单体上不同2′-硫代羟基碳酸酯基团的切割/去保护研究

使用THF中的四丁基氟化铵(TBAF)1M的溶液切割多种2′-硫羰基保护基团。似乎所有的硫代羟基碳酸酯被该溶液切割，并且如所预期的，具有更大烷基的硫代羟基碳酸酯具有提高的半衰期。

 R T^1/2 甲基(MSC) 3分钟

 R T^1/2 乙基(ESC) 10分钟 异丙基(ISC) 70分钟 叔丁基(BSC) 60分钟

III.多种2′-硫代羰基碳酸酯和二硫代碳酸酯单体的合成。

A.5′，3′-TIPS-2′五氟苯氧基硫代羰基-尿苷的合成

将5′，3′TIPS-尿苷(5mmol)与吡啶共同蒸发两次并溶于DCM/Py(9ml/4ml)溶液中。添加DMAP(122mg，1mmol)并将溶液浸入水浴(20℃下)中。缓慢(在1分钟内)添加氯硫羰基甲酸五氟苯基酯(Pentafluorophenyl chlorothionoformate)(1.6mL，10mmol)，并将反应搅拌5小时，之后添加水。将溶液用DCM萃取两次，用水洗涤两次，干燥(Na₂SO₄)，过滤并浓缩。在硅胶色谱上纯化粗产物(EtOAC/己烷)，得到标题化合物(64％产率)。质量计算值：712.17，观察值：719.18[M+Li]+，746.2[M+Cl]-。

B.用于合成硫代羰基碳酸酯和二硫代碳酸酯的一般方法：

将3′，5′-TIPS 2′-O-五氟苯基氧硫代羰基尿苷与1，4-二噁烷共同蒸发两次，溶于THF(3ml)中并置于氩气下。添加相关的醇盐(alkoxide)/硫代醇盐(2.1当量)，并将反应混合物搅拌1小时，其中添加std aq的NaHCO₃，并将溶液用EtOAc萃取两次，用水洗涤一次并用盐水洗涤一次，在Na₂SO₄上干燥，浓缩并通过硅胶色谱(EtOAc/己烷)纯化。

IV.多种硫代氨基甲酸酯保护的单体的合成。

A.5′-O-DMT-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺-2′-O-吗啉代硫代氨基甲酸酯尿苷的合成。

在500ml装有胶塞(serum stopper)的圆底烧瓶中，将10mmol，4.8g的3′-5′-四异丙基二硅氧烷尿苷(ChemeGenes)溶于100ml无水乙腈中。向反应中添加1.9克1，1′-硫羰基二咪唑(Aldrich)和0.2克4-(二甲基)氨基吡啶。使用热风枪(heat gun)加热反应并搅拌，直至试剂溶解并且溶液澄清。允许反应搅拌过夜(12小时)。12小时后，反应混合物是晶体的浆体。通过滤过中号烧结玻璃漏斗来分离晶体。将产物用冷乙腈洗涤，并在真空下干燥。TLC分析证实，产物是提供5.97克产物(100％)的单一物类。ESI-Q-TOF质谱分析证实产物是5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2′-硫羰咪唑，质量为M+1，597.12m/e。通过使用热风枪加热，将产物重溶于100ml无水乙腈中。向反应中添加11mmol吗啉。将反应用塞子塞住并搅拌3小时。TLC分析证实了从起始材料到更高级产物(higher running product)的点到点转化。通过蒸发乙腈得到玻璃体，分离该产物。ESI-Q-TOF质谱分析证实产物为5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2′-吗啉代-硫代氨基甲酸酯，质量为M+1，615.21m/e。将氟化氢-吡啶复合物(HF∶Py 7∶3，7mL)小心地倒入冰冷的乙腈(46.5mL)中的吡啶(8mL)溶液中。然后将由此形成的吡啶-HF试剂(32mL)转移至具有5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)2′-吗啉代-硫代氨基甲酸酯保护的尿苷(10mmole)的烧瓶中，并将混合物在室温下搅拌2小时。用5％的氯化钙水溶液(300mL)淬灭反应。用EtOAc萃取粗产物(3-5次)，并用无水Na₂SO₄干燥。过滤后将有机层浓缩为粘稠的油，得到由TLC示为单个点的3.5克(94％产率)产物，其通过ESI-Q-TOF质谱证实为2′-吗啉代-硫代氨基甲酸酯保护的尿苷，其质量为M+1，373.10m/e。将2′-O-吗啉代硫代氨基甲酸酯保护的尿苷(9.4mmole)溶于无水THF(95mL)中，添加2，4，6-三甲基吡啶(70.5mmole)和二甲氧基三苯甲基氯化物(11.75mmole)，并将混合物在室温下搅拌，直至TLC(CHCl₃/MeOH 9∶1)显示核苷底物的完全消失(16-24小时)。一次性添加2，4，6-三甲基吡啶(9.4mmole)和1-甲基咪唑(4.5mmole)，并在10-15分钟内向反应混合物中缓慢添加N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯(23mmol)。然后将反应混合物再搅拌2小时。真空去除溶剂，并使用含EtOAc(0-50％)梯度的己烷，通过柱色谱纯化粗产物。

B.5′-O-DMT-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺-2′-O-硫代吗啉代-1，1-二氧化物硫代氨基甲酸酯尿苷的合成。

在500ml装有胶塞的圆底烧瓶中，将10mmol，4.8g的3′-5′-四异丙基二硅氧烷尿苷(ChemeGenes)溶于100ml无水乙腈中。向反应中添加1.9克1，1′-硫羰基二咪唑(Aldrich)和0.2克4-(二甲基)氨基吡啶。使用热风枪加热反应并搅拌，直至试剂溶解并且溶液澄清。允许反应搅拌过夜(12小时)。12小时后，反应混合物是晶体的浆体。通过滤过中号烧结玻璃漏斗来分离晶体。将产物用冷乙腈洗涤，并在真空下干燥。TLC分析证实，产物是提供5.97克产物(100％)的单一物类。ESI-Q-TOF质谱分析证实产物是5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2′-硫代羰基咪唑，质量为M+1，597.12m/e。通过使用热风枪加热，将产物重溶于100ml无水乙腈中。向反应中添加11mmol硫代吗啉-1，1-二氧化物(TCI America)和1.1mmol 4-(二甲基)氨基吡啶。将反应用塞子塞住并搅拌12小时。12小时后，反应混合物是晶体的浆体。将产物用冷乙腈洗涤，并在真空下干燥。TLC分析证实了产物是提供6.61克产物(99％)的单一物类。ESI-Q-TOF质谱分析证实产物为5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2′-O-硫代吗啉代-1，1-二氧化物硫代氨基甲酸酯，质量为M+1，664.21m/e。将氟化氢-吡啶复合物(HF∶Py7∶3，7mL)小心地倒入冰冷的乙腈(46.5mL)中的吡啶(8mL)溶液中。然后将由此形成的吡啶-HF试剂(32mL)转移至含有被5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)2′-O-硫代吗啉代-1，1-二氧化物硫代氨基甲酸酯保护的尿苷(10mmole)的烧瓶中，并将混合物在室温下搅拌2小时。用5％的氯化钙水溶液(300mL)淬灭反应。用EtOAc萃取粗产物(3-5次)，并用无水Na₂SO₄干燥。过滤后将有机层浓缩为粘稠的油，得到通过TLC示为单个点的3.4克(80％产率)产物，其通过ESI-Q-TOF质谱证实为2′-O-硫代吗啉代-1，1-二氧化物硫代氨基甲酸酯保护的尿苷，其质量为M+1，422.10m/e。将2′-O-硫代吗啉代-1，1-二氧化物硫代氨基甲酸酯保护的尿苷(8.0mmole)重溶于无水THF(80mL)中，添加2，4，6-三甲基吡啶(60mmole)和二甲氧基三苯甲基氯化物(10.0mmole)，并将混合物在室温下搅拌，直至TLC(CHCl₃/MeOH 9∶1)显示核苷底物的完全消失(16-24小时)。一次性添加2，4，6-三甲基吡啶(8.0mmole)和1-甲基咪唑(4.0mmole)，并在10-15分钟内向反应混合物中缓慢添加N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯(20mmol)。然后将反应混合物再搅拌2小时。真空去除溶剂，并使用含EtOAc(0-50％)梯度的己烷，通过柱色谱纯化粗产物。

C.5′-O-DMT-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺-2′-O-二甲基羟氨基硫代氨基甲酸酯尿苷的合成。

在500ml装有胶塞的圆底烧瓶中，将3′-5′-四异丙基二硅氧烷尿苷(ChemeGenes)，10mmol，4.8克溶于100ml无水乙腈中。向反应中添加1.9克1，1′-硫羰基二咪唑(Aldrich)和0.2克4-(二甲基)氨基吡啶。使用热风枪加热反应并搅拌，直至试剂溶解并且溶液澄清。允许反应搅拌过夜(12小时)。12小时后，反应混合物是晶体的浆体。通过滤过中号烧结玻璃漏斗来分离晶体。将产物用冷乙腈洗涤，并在真空下干燥。TLC分析证实，产物是提供5.97克产物(100％)的单一物类。ESI-Q-TOF质谱分析证实产物是5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2′-硫代羰基咪唑，质量为M+1，598.12m/e。将产物悬浮于100ml无水乙腈中。向反应混合物中添加11mmol N，O-二甲基羟氨基盐酸化物(Aldrich)、15mmol二异丙基乙胺和1.1mmol 4-(二甲基)氨基吡啶。使用热风枪加热反应以溶解试剂，产生澄清的溶液。将混合物用塞子塞住并搅拌12小时。12小时后，将反应混合物蒸发为油，并在真空下干燥。TLC分析证实了产物是提供5.9克产物的单一物类。ESI-Q-TOF质谱法分析证实产物是5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2′-O-二甲基羟氨基硫代氨基甲酸酯，质量为M+1，590.24m/e。将氟化氢-吡啶复合物(HF∶Py 7∶3，7mL)小心地倒入冰冷的吡啶(8mL)在乙腈(46.5mL)中的溶液中。然后将由此形成的吡啶-HF试剂(32mL)转移至含5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2′-O-二甲基羟氨基硫代氨基甲酸酯保护的尿苷(10mmole)的烧瓶中，并将混合物在室温下搅拌2小时。用5％的氯化钙水溶液(300mL)淬灭反应。用EtOAc萃取粗产物(3-5次)，并用无水Na₂SO₄干燥。过滤后将有机层浓缩为粘稠的油，得到通过TLC示为单个点的3.1克(86％产率)产物，其通过ESI-Q-TOF质谱证实为2′-O-二甲基羟氨基硫代氨基甲酸酯保护的尿苷，质量为M+1，348.09m/e。将2′-O-二甲基羟氨基硫代氨基甲酸酯保护的尿苷(8.7mmole)重溶于无水THF(90mL)中，添加2，4，6-三甲基吡啶(61mmole)和二甲氧三苯甲基氯化物(10.0mmole)，并将混合物在室温下搅拌直至TLC(CHC13/MeOH 9∶1)显示核苷底物完全消失(16-24小时)。一次性添加2，4，6-三甲基吡啶(9.0mmole)和1-甲基咪唑(4.5mmole)，并耗时10-15分钟缓慢地向反应混合物中添加N，N-二异丙基甲基磷酰胺酸氯化物(22mmol)。然后将反应混合物再搅拌2小时。真空去除溶剂，并使用己烷与EtOAc(0-50％)梯度通过柱色谱纯化粗制产物。

D.5′-O-DMT-3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺-2′-O-苯氨基硫代氨基甲酸酯尿苷的合成。

在500ml装有胶塞的圆底烧瓶中，将10mmol，4.8g的3′-5′-四异丙基二硅氧烷尿苷(ChemeGenes)溶于100ml无水乙腈中。向反应中添加1.9克1，1′-硫羰基二咪唑(Aldrich)和0.2克4-(二甲基)氨基吡啶。使用热风枪加热反应并搅拌，直至试剂溶解并且溶液澄清。允许反应搅拌过夜(12小时)。12小时后，反应混合物是晶体的浆体。通过滤过中号烧结玻璃漏斗来分离晶体。将产物用冷乙腈洗涤，并在真空下干燥。TLC分析证实，产物是提供5.97克产物(100％)的单一物类。ESI-Q-TOF质谱分析证实产物是5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2′-硫代羰基咪唑，质量为M+1，598.12m/e。将产物重溶于100ml无水乙腈中。向反应混合物中添加11mmol苯胺，和11mmol 4-(二甲基)氨基吡啶。为反应装上回流冷凝器并加热回流12小时。12小时后，将反应混合物蒸发为油，并在真空下干燥。TLC分析证实产物以约80％的产率与2，2-脱水尿苷一起存在。使用甲醇/亚甲基氯化物梯度(0-5％)在硅胶上纯化产物。ESI-Q-TOF质谱分析证实产物为5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2′-O-苯氨基硫代氨基甲酸酯，质量为M+1，621.33m/e。小心地将氟化氢-吡啶复合物(HF∶Py 7∶3，7mL)倒入吡啶(6.5mL)在乙腈(37.2mL)中的冰冷溶液中。然后将由此形成的吡啶-HF试剂(25mL)转移至含有被5′，3′-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2′-O-二甲基羟氨基硫代氨基甲酸酯保护的尿苷(8mmole)的烧瓶中，并将混合物在室温下搅拌2小时。用5％的氯化钙水溶液(300mL)淬灭反应。用EtOAc萃取粗产物(3-5次)，并用无水Na₂SO₄干燥。过滤后将有机层浓缩为粘稠的油，得到通过TLC示为单个点的2.4克(81％产率)产物，其通过ESI-Q-TOF质谱证实为2′-O-苯氨基硫代氨基甲酸酯保护的尿苷，其质量为M+1，379.18m/e。将2′-O-苯氨基硫代氨基甲酸酯保护的尿苷(6.4mmole)重溶于无水THF(65mL)中，添加2，4，6-三甲基吡啶(45mmole)和二甲氧基三苯甲基氯化物(8.0mmole)，并将混合物在室温下搅拌，直至TLC(CHCl₃/MeOH 9∶1)显示核苷底物完全消失(16-24小时)。一次性添加2，4，6-三甲基吡啶(6.4mmole)和1-甲基咪唑(3.2mmole)，并在10-15分钟内向反应混合物中缓慢添加N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯(16mmol)。然后将反应混合物再搅拌2小时。真空去除溶剂，并使用含EtOAc(0-50％)梯度的己烷，通过柱色谱纯化粗产物。

V.用于固体支持物上寡聚尿苷合成的一般步骤：

所有的合成使用来自Glen Research的dT-Q-CPG柱，根据标准RNA循环以1microM的规模进行。为了偶联步骤，将亚磷酰胺和四唑输送至合成柱并保留10分钟。

完成所有合成步骤后，并且为了去除磷酸部件上的甲基保护基，用1M 2-氨基甲酰基-2-氰亚乙基-1，1-二硫化二钠在DMF(1mL)中的溶液在室温下处理寡核糖核苷(仍然与CPG连接)30分钟，然后用水洗涤再用乙腈洗涤，并通过氩干燥。

对含有硫代氨基甲酸酯的2′-受保护的寡聚核苷而言，可以在室温下使用一个小时无水乙腈中20％二乙胺切割氰乙基磷酸酯保护基。

通过用THF(1mL)中的1M TBAF溶液处理，从固体支持物上切割寡聚物并进行2′-去保护。重要的是注意TBAF溶液必须被干燥至少于5％水含量。对U₄T五聚体而言，去保护在1小时(ESC保护)和6小时(BSC保护)内完成。

用0.1M TEAA淬灭反应，使用标准过程在Poly-pak盒上脱盐，并蒸发至干燥。将得到的反应产物溶于水中，并通过HPLC分析[ODS-Hypersil(5m)，柱4.0x250，流速1.5mL/min，40分钟内50mM TEAB中0-20％MeCN(线性梯度)]。

在一些情况下，通过在室温下用TEMED/HF/MeCN混合物(2∶1∶7，1mL)处理40分钟，将寡聚物从固体支持物上切割(而不进行2′-去保护)。如前文所述将反应淬灭、脱盐和分析。

对硫代羰基碳酸酯和硫代氨基甲酸酯保护基而言，使用无水胺将寡聚核苷从支持物上切割并去保护。典型的条件是室温下以80psi的无水气态氨处理6到24小时；室温下以30psi的无水甲胺处理1到6小时；溶于乙腈中的氨处理6到24小时；溶于苯酚中的乙二胺处理6到12小时；纯1，3-丙二胺处理4到16小时；纯吗啉，处理16到48小时；无水乙腈中的羟甲基胺处理4到12小时。

将气态胺排出并用无水氩气流洗涤固体支持物。然后将固体支持物置于真空中2到12小时，然后通过HPLC分析使用缓冲的水溶液从支持物上冲洗的寡核苷酸[ODS-Hypersil(5m)，柱4.0x250，流速1.5mL/min，在40分钟内50mM TEAB中0-20％MeCN(线性梯度)]。使用3到10倍体积的乙腈，从支持物上冲洗溶于无水溶剂中的一种或多种无水纯胺。用无水氩气流洗涤得到的支持物。然后将固体支持物置于真空下2到12小时，然后通过HPLC分析使用缓冲的水溶液从支持物上冲洗的寡核苷酸[ODS-Hypersil(5m)，柱4.0x250，流速1.5mL/min，在40分钟内50mMTEAB中0-20％MeCN(线性梯度)]。

VI.在固体支持物上合成3′-TU_(2′ESC)C^POC_(2′ESC)A^POC_(2′ESC)-C^POC_(2′ESC)A^POC_(2′ESC)的混合序列

合成使用来自Glen Research的dT-Q-CPG柱，根据标准RNA循环以1microM的规模进行。为了偶联步骤，将亚磷酰胺和四唑输送至合成柱并保留10分钟。

在该寡核糖核苷酸合成中使用的亚磷酰胺为U_2′ESC 2′O-乙基-硫羰基5′-O-DMT 3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺尿苷；C^POC_2′ESC(2′O-乙基硫羰基5′-O-DMT 3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺N⁴-苯氧基羰基胞苷)和A^POC_2′ESC 2′O-乙基硫羰基5′-O-DMT 3′-O-[甲基-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺N⁴-苯氧基羰基胞苷)

在完成所有合成步骤后，并且为了去除磷酸部件上的甲基保护基，用1M 2-氨基甲酰基-2-氰亚乙基-1，1-二硫化二钠在DMF(1mL)中的溶液在室温下处理30分钟，然后用DMF洗涤、再用甲醇之后用乙腈洗涤，并通过氩干燥。

通过用1M TBAF在THF(1mL)中的溶液过夜处理，从固体支持物上切割寡聚物并进行2′-去保护，所述溶液中添加了MeOH中10％(v/v)的1M TBAOH。

用0.1M TEAA淬灭反应，使用标准过程在Poly-pak盒上脱盐，并蒸发至干燥。将得到的反应产物溶于水中，并通过HPLC分析[ODS-Hypersil(5m)，柱4.0x250，流速1.5mL/min，40分钟内50mM TEAB中0-20％MeCN(线性梯度)]。

VII.去保护

通过Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩尔四丁氟化铵溶液的水含量，发现所述水含量为4.3％。使用-60℃下溶液的19^F NMR测定出10％的二氟化物浓度。将溶液在无水氢氧化钠颗粒上储存9天，水含量降至3.1％，二氟化物含量降至1％。该溶液显示在1小时内使RNA五聚体去保护。

通过Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩尔四丁氟化铵溶液的水含量，发现所述水含量为4.3％。使用-60℃下溶液的19^F NMR测定出10％的二氟化物浓度。将溶液在无水碳酸钾上储存9天，水含量降至3.7％，二氟化物含量降至0％。该溶液显示在1.5小时内使RNA五聚体去保护。

通过Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩尔四丁氟化铵溶液的水含量，发现所述水含量为4.3％。使用-60℃下溶液的19^F NMR测定出10％的二氟化物浓度。向溶液中添加10％(体积/体积)水中的1.0摩尔四丁铵氢氧化物。通过Karl-Fisher滴定测定的最终水浓度为12％，使用19^F NMR测定的二氟化物浓度为0％。该溶液显示在3小时内使RNA五聚体去保护。

通过Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩尔四丁氟化铵溶液的水含量，发现所述水含量为4.3％。使用-60℃下溶液的19^F NMR测定出10％的二氟化物浓度。向溶液中添加10％(体积/体积)甲醇中的1.0摩尔四丁铵氢氧化物。通过Karl-Fisher滴定测定的最终水浓度为3.2％，使用19^FNMR测定的二氟化物浓度为0％。该溶液显示在45分钟内使RNA五聚体去保护。

通过Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩尔四丁氟化铵溶液的水含量，发现所述水含量为4.3％。使用-60℃下溶液的19^F NMR测定出10％的二氟化物浓度。向溶液中添加20％(体积/体积)甲醇中的1.0摩尔四丁铵氢氧化物。通过Karl-Fisher滴定测定的最终水浓度为3.4％，使用19^FNMR测定的二氟化物浓度为0％。该溶液显示在30分钟内使RNA五聚体去保护。

通过Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩尔四丁溴化铵溶液的水含量，发现所述水含量为1.8％。向溶液中添加10％(体积/体积)水中的1.0摩尔四丁铵氢氧化物。该溶液显示在1.2小时内使RNA五聚体去保护。

通过Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩尔四丁溴化铵溶液的水含量，发现所述水含量为1.8％。向溶液中添加20％(体积/体积)水中的1.0摩尔四丁铵氢氧化物。该溶液显示在45分钟内使RNA五聚体完全去保护，然而具有一些降解产物。

通过Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩尔四丁溴化铵溶液的水含量，发现所述水含量为1.8％。向溶液中添加20％(体积/体积)甲醇中的1.0摩尔四丁铵氢氧化物。该溶液显示在30分钟内使RNA五聚体去保护。

通过Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩尔四丁铵乙酸盐溶液的水含量，发现所述水含量为2.2％。向溶液中添加20％(体积/体积)甲醇中的1.0摩尔四丁铵氢氧化物。通过Karl-Fischer滴定分析的最终水浓度为2.4％。该溶液显示在30分钟内使RNA五聚体去保护。

通过Karl-Fischer滴定分析二噁烷中1.0摩尔四丁铵乙酸盐溶液的水含量，发现所述水含量为1.8％。向溶液中添加20％(体积/体积)甲醇中的1.0摩尔四丁铵氢氧化物。通过Karl-Fischer滴定分析的最终水浓度为2.1％。该溶液显示在1.5小时内使RNA五聚体去保护。

通过Karl-Fischer滴定分析乙腈中1.0摩尔四丁铵乙酸盐溶液的水含量，发现所述水含量为1.6％。向溶液中添加20％(体积/体积)甲醇中的1.0摩尔四丁铵氢氧化物。通过Karl-Fischer滴定分析的最终水浓度为1.8％。该溶液显示在30分钟内使RNA五聚体去保护。

A.在2′-乙基硫代羟基碳酸酯保护的化合物上，使用DMSO中的TBAF对RNA寡核苷酸去保护。

TU₂₀

HPLC

分析

ESI-Q-TOF质谱

M(测量值)：6364.0

M(U20T，计算的最强峰值)：6364.6

TU₄₀

HPLC分析

B.使用气态氨使TU₄ 2′-硫代氨基甲酸酯去保护

2′-硫代羰基吗啉代氨基甲酸酯

在80psi下用气态氨处理

HPLC分析

ESI-Trap质谱

在30psi下用气态甲胺处理

HPLC分析

ESI-Trap质谱

C.2′-硫代羰基硫代吗啉代-1，1-二氧化物氨基甲酸酯

在80psi下用气态氨处理

HPLC分析

ESI-Trap质谱

在30psi下用气态甲胺处理

HPLC分析

ESI-Trap质谱

缩写

在本公开中，以下的缩写具有以下的含义。

未定义的缩写具有它们被普遍接受的含义。

℃＝摄氏度

hr＝小时

min＝分钟

sec＝秒

μM＝微摩尔

mM＝毫摩尔

M＝摩尔

ml＝毫升

μl＝微升

mg＝毫克

μg＝微克

DMAP＝4，4′-二甲基氨基吡啶

DMT＝二甲氧基三苯甲基

NMI＝N-甲基咪唑

TBAF＝四丁基氟化铵

TBAOH＝四丁基铵氢氧化物

TBAA＝四丁基铵乙酸盐

TBAB＝四丁基溴化铵

TBDMS＝叔丁基二甲基甲硅烷基

TIPS＝1，3-四异丙基二硅氧烷

TEA＝三乙胺

TEAA＝三乙基铵乙酸盐

TEAB＝三乙基铵碳酸氢盐

TEMED＝N，N，N′，N′-四甲基乙二胺

RP-HPLC＝反相高效液相色谱

参考文献

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尽管已经就清楚理解的目的通过阐述和举例比较详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导，对本领域常规技术人员而言显而易见的是，可以进行某些改变和修饰而不偏离附带的权利要求书的精神和范围。

因此，前文仅阐述了本发明的原理。应当明白，本领域技术人员应当能够进行多种安排，所述安排尽管不是本文所明确描述或显示的，但是体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围中。另外，本文引用的所有例子和有条件的语言原则上旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为了改进现有技术所做贡献的概念，并且应当被理解为不限于这些明确引用的例子和条件。另外，本文叙述原理、方面的所有陈述和本发明的实施方式及其特定实施例旨在包括其结构和功能的等同物。另外，这类等同物旨在包括目前已知的等同物和未来开发的等同物，即开发的实现相同功能的任何元件，与结构无关。因此，本发明的范围不旨在局限于本文显示和描述的示范性实施方式。相反，本发明的范围和思想体现在附带的权利要求书中。