重组人成纤维细胞生长因子7突变体在制备治疗宫颈糜烂的药物中的应用

摘要

本发明公开了重组人成纤维细胞生长因子7突变体的一种新用途，将其应用于妇女宫颈糜烂的治疗。本发明利用重组人成纤维细胞生长因子7突变体特异性促进上皮细胞增殖的生物活性、提高的稳定性，在病灶部位施用本重组蛋白，促进粘膜上皮损伤的修复，促进宫颈糜烂部位的结构修复，达到对宫颈糜烂的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组人成纤维细胞生长因子7突变体的新用途，特别是制备治疗妇女宫颈糜烂的药物中的应用。具体地说是将重组人成纤维细胞生长因子7突变体制备成既能保持其生物活性、又适合阴道给药的制剂，并经阴道给药治疗妇女宫颈糜烂。

背景技术

宫颈糜烂是妇科常见疾病，多由急、慢性宫颈炎因未得到有效治疗发展而成。宫颈糜烂在性活跃期的妇女中发病率很高，多是因性生活、器械损伤、过度清洗或分娩时宫颈受伤诱发，也有因体质弱导致经期感染导致宫颈糜烂，总发病率达到26％-52％，是严重威胁妇女身体健康，降低妇女生活质量的疾患。宫颈糜烂会导致多种并发症，与宫颈癌的发病有十分密切的关系，患有宫颈糜烂的妇女患宫颈癌的几率比未患宫颈糜烂妇女高10倍以上。

宫颈糜烂不易治愈，主要原因是因为病情容易复发，可能与以下因素有关如宫颈局部免疫力异常，治疗方法不够彻底，病变严重程度，性生活频繁、反复人工流产和年龄偏大等。此外因为宫颈的神经支配属于内脏神经系统，患者对疼痛不敏感，因此宫颈表面糜烂即使非常严重也不会引起病人剧烈的症状，这极易掩盖病情并使患者放松警惕，等病情加重来就诊时，往往症状已相当严重，也是导致宫颈糜烂不易治疗的原因。另外，目前治疗方法疗效欠佳，治疗周期长，患者不易坚持，也是不能治愈的原因之一。

临床上尚无能很好满足需求的治疗方案。市场上的药物多为口服抗生素类、栓剂、洗液等，治疗周期长，容易破坏阴道正常环境，并导致抗生素耐药性，导致治疗效果不好，易复发等弊端。一种新的作用机制的治疗手段为临床急需。

重组人成纤维细胞生长因子7(FGF7)是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的一员，由上皮细胞相邻的间叶细胞所产生。它通过结合只表达在上皮细胞的特异性受体结合促进不同组织上皮细胞的增殖、分化、减少上皮细胞的凋亡，阻止上皮细胞DNA的损伤，增强能降低细胞外部内部环境有毒物质的酶活，从而促进上皮细胞的更新和增值。FGF7也参与组织损伤后的修复。

重组人成纤维细胞生长因子7突变体已经开发为肿瘤放化疗后口腔溃疡的治疗用药，静脉滴注给药，为冻干生物制品，得到FDA和欧洲EMEA的批准上市，证明重组人成纤维细胞生长因子7突变体是非常安全的细胞因子，也是目前全球批准体内注射的第一个细胞因子。但目前没有将FGF7突变体应用于宫颈糜烂的治疗应用。

重组人成纤维细胞生长因子7突变体为缺失N端23个氨基酸残基的人成纤维细胞生长因子7，此突变体比原型提高了生物活性和稳定性，本发明利用人成纤维细胞生长因子对人上皮细胞的专一性和促进分裂分化和迁移的生物学活性、突变体的高活性和高稳定性制备成相应制剂，应用于促进妇女宫颈糜烂部位的修复、结构重建，达到治疗目的。

发明内容

本发明提供一种重组人成纤维细胞生长因子7突变体在制备治疗宫颈糜烂的药物中的应用，更优选的是缺失N端23氨基酸残基的重组人成纤维细胞生长因子7突变体在制备治疗宫颈糜烂药物中的应用，其氨基酸序列如SEQ IDN0：1所示；所述的药物是以重组人成纤维细胞生长因子7突变体为活性成分，加上药学上可以接受的辅料制备而成的药剂。

本发明的另一方面是提供一种治疗宫颈糜烂的药物组合物，其由有效量的重组人成纤维细胞生长因子7突变体为活性成分，加上药学上可以接受的辅料制备而成药剂。所述重组人成纤维细胞生长因子7突变体含量为500ng～50ug/ml，优选的，所述重组人成纤维细胞生长因子7突变体含量为2.5ug～20ug/ml。

本发明所述药剂是外用固体制剂、半固体制剂或液体制剂，其中，固体制剂是冻干粉剂、泡腾片、或栓剂；半固体制剂是凝胶制剂、乳剂或膏剂；液体制剂为喷雾剂。

本发明所使用重组人成纤维细胞生长因子7突变体为用E.coli表达的缺失23氨基酸残基的140氨基酸人成纤维细胞生长因子7。

本发明所用重组人成纤维细胞生长因子7突变体保存方式为冷冻干燥后4-8℃冷藏保存，使用时用特定溶媒溶解后，直接使用于溃疡部位或用适当载体将药物送至溃疡部位。

试验证明，重组人成纤维细胞生长因子7突变体能促进宫颈糜烂部位快速修复，完成结构重建。

下面通过具体实施方式对本发明作进一步描述，但并非对本发明的限制

具体实施方式

实施例一

实施例1本发明冻干制剂的的制备

活性成分：重组人成纤维细胞生长因子7突变体(可购买美国安进公司的产品palifermin或kepivance)或者利用常规的基因重组技术生产重组人成纤维细胞生长因子7突变体，其方法如下：

a、按照生物技术领域技术人员所熟知的方法，人工合成或者用RT-PCR技术克隆重组人成纤维细胞生长因子7突变体的cDNA序列【Fibroblastgrowth factor 7，Homo sapiens，GeneID 2252】，构建重组质粒，并转染工程菌E.coli表达，得到表达重组人成纤维细胞生长因子7突变体的基因工程菌，并经发酵培养基因工程菌进行重组人成纤维细胞生长因子7突变体的生产；

b、经过亲和层析、离子交换层析等分离纯化步骤，获得纯度达到95％以上的重组人成纤维细胞生长因子7突变体，按照Edman法测定蛋白N-末端序列，其序列与SEQ ID NO1 N-末端15个氨基酸残基相符合，同时通过质谱法测定分子量，与预期分子量16278Da相吻合证明得到的蛋白为重组人成纤维细胞生长因子7突变体，并经检测物热源物质和生物活性测定，符合国家注射用蛋白的质量标准。

辅料：甘露醇、组氨酸、蔗糖等

将辅料溶解、与相应的重组人成纤维细胞生长因子7突变体原液混合，调整pH值到6.5、组成为每毫升液体含1毫克重组人成纤维细胞生长因子1突变体、50毫克甘露醇、25毫克蔗糖、2毫克组氨酸，经过滤除菌后，冷冻干燥，即为冻干制剂，规格按照需要确定。

实施例2本发明喷雾制剂的制备

为便于运输和保存，重组人人成纤维细胞生长因子7突变体制备成冻干制剂，使用时可根据需要配制为喷雾制剂：将冻干制剂用生理盐水或医学常用溶媒溶解，溶解后的活性物质浓度范围为500ng～50ug/ml，装入符合要求的喷雾器中，即可喷雾使用。

实施例3本发明凝胶制剂的制备

为便于运输和保存，重组人成纤维细胞生长因子7突变体制备成冻干制剂，使用时可根据需要配制为凝胶制剂，制备方法如下：

用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)的低温呈液态，体温凝聚成凝胶的特点，将其配制成重组人成纤维细胞生长因子7冻干粉的凝胶伴侣，与人成纤维细胞生长因子7冻干粉共同低温(4-8℃)保存，使用时用凝胶伴侣溶解冻干粉，吸出涂抹到患处，体温作用即形成凝胶覆盖患处，并释放人成纤维细胞生长因子7突变体产生治疗作用。

20％ Pluronic F-127液制备方法：20mM PBS pH7.0缓冲液，缓慢加入Pluronic F-127搅拌30分钟，4℃下过夜，过滤除菌分装成1ml每支，4-8℃运输或保存。

使用时，凝胶伴侣与重组人成纤维细胞生长因子1突变体冻干粉溶解配制方法与生理盐水配制方法相同，配制后重组人成纤维细胞生长因子1浓度为500ng～50ug/ml。

试验例一：重组人成纤维细胞生长因子7突变体对大鼠宫颈糜烂的治疗

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

SD雌性大鼠，体重220-250g，60只；四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供，合格证号：2003-05。

1.1.2实验药物

重组人成纤维细胞生长因子7突变体为重组人成纤维细胞生长因子7突变体冻干粉(按照实施例一方法制备)，由成都博发生物技术有限公司提供；制剂：冻干粉，1mg/支；批号20080601。

25％苯酚胶浆由液化苯酚5mL，西黄嗜胶1g，甘油4mL加蒸馏水至20mL而成。

1.2实验方法

1.2.1实验方法

取大鼠50只，按体重随机分为6组，每组60只，分别为正常对照组、模型对照组、溶媒对照组、重组人成纤维细胞生长因子7突变体治疗组(低、中、高)。模型组及治疗组阴道注入0.1ml/100g苯酚胶浆，每天1次，连续3次，空白组给予等体积注射用水。模型标准：肉眼可见大鼠阴道口红肿，阴道口有脓性物流出。各组动物经阴道分别给予相应处理。每天1次，连续7日。处理方法如下：

  组别  剂量(μg/ml)  正常对照组  注射用水  模型对照组  注射用水

  组别  剂量(μg/ml)  溶媒对照组  溶解液  低剂量组  2.5  中剂量组  10  高剂量组  20

1.2.2观察指标

末次给药后次日，处死动物，进行以下观察：

1)观察阴道红肿及留出物情况；

2)解剖阴道-宫颈，称重，计算脏器指数(％)；

3)取宫颈组织，用10％福尔马林溶液固定、石蜡包埋切片、组织病理学检查。

组织病理学评分标准如下：

  项目  组织学描述  评分  黏膜病变  未见明显变性坏死、脱落及溃疡  0  可见轻度变性坏死、脱落及溃疡  1  可见明显变性坏死、脱落及溃疡  2  可见大量变性坏死、脱落及溃疡  3  黏膜下层血管扩张充血  未见明显扩张血管  0  可见轻度扩张血管  1  未见明显扩张血管  2  未见较多扩张血管  3  黏膜下层炎细胞浸润  未见明显炎细胞浸润  0  可见轻度炎细胞浸润  1  可见明显炎细胞浸润  2  可见大量炎细胞浸润  3

  项目  组织学描述  评分  脓肿  无  0  有  1

1.3统计学方法

结果用均数±标准差表示，组间比较采用SPSS11.0统计处理。

2结果

2.1重组人成纤维细胞生长因子7突变体对阴道及分泌物影响

实验动物阴道注入25％苯酚胶浆，注射第2天，大部分动物阴道口红肿，并伴有少量脓性物流出。第4日，所有注入25％苯酚胶浆动物阴道口红肿，并且流出脓性物增多。给药期间，中、高剂量组阴道口红肿减轻，脓性物流出减少，实验结束时已无异物流出。模型组、对照组和低剂量组实验期间阴道口红肿减轻，脓性流出物减少；实验结束，仍有少量异物流出。

2.2重组人成纤维细胞生长因子7突变体对阴道-宫颈影响

研究结果表明：重组人成纤维细胞生长因子7突变体显著降低模型动物阴道-宫颈重量指数(结果见表1)。

表1重组人成纤维细胞生长因子7突变体对阴道-宫颈影响

  组别  剂量(μg/ml)  阴道-宫颈指数(％)  空白组  -  0.161±0.019  模型组  -  0.324±0.163  对照组  0.304±0.202  低剂量组  2.5  0.178±0.162  中剂量组  10  0.146±0.135  高剂量组  20  0.101±0.105

2.3重组人成纤维细胞生长因子7突变体对病理组织学影响

组织病理学研究表明：宫颈黏膜鳞状上皮细胞变性、坏死、脱落、形成溃疡；黏膜下明显充血、水肿，大量单核细胞、巨噬细胞浸润。中、高剂量组固有层未见炎性细胞浸润，可见肉芽组织，复层上皮基本修复，绒毛结构出现；表皮基底层细胞明显增多。

表2重组人成纤维细胞生长因子7突变体7天治疗病理组织学研究

3.结论

实验动物一般观察结果及宫颈组织病理学结果说明模型建立成功。阴道局部涂抹重组人成纤维细胞生长因子7突变体，连续7天治疗，具有明显促进宫颈黏膜鳞状上皮增生，减轻炎症反应，对宫颈糜烂明显的具有治疗作用

试验例2重组人成纤维细胞生长因子7突变体治疗宫颈糜烂临床效果观察宫颈糜烂是已婚妇女的常见病、高发病，可导致妇女痛经、不育，易并发宫颈部位的慢性感染，且有文献证实宫颈糜烂是诱发宫颈癌的高危因素。目前治疗宫颈糜烂的方法很多，但疗效欠佳。我们采用重组人成纤维细胞生长因子7突变体治疗宫颈糜烂病例20例，疗效显著，现报道如下。

1临床资料

1.1一般资料

试验治疗药品为实施例1制备的重组人成纤维细胞生长因子7突变体冻干粉，为1mg/ml规格，用生理盐水溶解，配置成5ug/ml的浓度，5ug/ml rhKGF1水凝胶(为实施例3制备的凝胶制剂)配合使用，也可以直接使用按相同方法配制的10ug/ml的rhKGF1水凝胶或水溶液。

20例病例均为住院和门诊患者，全部为已婚妇女，这些妇女均采用爱宝疗、干扰素等治疗无效，采用自身对照前后对照方式使用治疗1月。年龄23岁～46岁，平均(34.6±1.23)岁；病程3个月～20个月，平均8个月；按糜烂面积分I度糜烂8例，II度糜烂7例，III度糜烂5例；按病理分型分乳突型4例，颗粒型12例，单纯型4例。

1.2诊断标准

所有病例诊断均参照全国高等医药院校教材《妇产科学》中宫颈糜烂的诊断标准[1]。轻度糜烂(I度)：宫颈糜烂面积小于整个宫颈面积的1/3；中度糜烂(II度)：宫颈糜烂面积占整个宫颈面积的1/3～2/3；重度糜烂(III度)：宫颈糜烂面积占整个宫颈面积的2/3以上。再根据糜烂面的深浅程度分为单纯型糜烂、颗粒型糜烂和乳头型糜烂。

2治疗方法

所有病例均采用重组人成纤维细胞生长因子7突变体局部外用方式治疗。治疗前做官颈刮片及阴道分泌物检查，排除宫颈癌及滴虫、霉菌、淋病等感染，于月经干净后5d～7d治疗。患者排空膀胱后取截石位，以1‰新洁尔灭消毒外阴、阴道，窥器暴露宫颈，新洁尔灭消毒，以无菌干纱布拭擦阴道及宫颈的分泌物，将冻干粉用湿棉球涂抹于宫颈，保持30分钟，然后取出棉球，隔二日使用一次。术后应保持外阴清洁，1个月内禁房事、盆浴及内诊检查。

3疗效判断

(1)痊愈：有症状者症状完全消失，糜烂面消失，宫颈光滑；

(2)显效：有症状者症状减轻，糜烂面积缩小＞50％，或中度转变为轻度及重度转变为中度；(3)有效：有症状者症状减轻，糜烂面积缩小＜50％，或糜烂面积缩小不明显，颗粒型转变为单纯型，乳头型转变为颗粒型；

(4)无效：治疗前后症状、糜烂面积无变化。

4结果

4.1疗效判定：20例患者中痊愈者12人(60％)，显效6人(30％)，有效2人，总有效率为100％，其中乳头型患者1例痊愈，2例显效，1例转为颗粒型，判为有效。

4.2症状改善：20例患者中，所有患者均有不同程度的症状改善。其中白带异常、腰腹坠痛和接触性出血的有效率分别为95％、88％和97％。

4.3不良反应

全组未出现明显的全身不良反应，所有患者耐受良好。

讨论：

宫颈糜烂在已婚妇女中的发病率高达50％以上，这不仅影响着患者的生活和工作，而且反复治疗也带来较大的经济负担，过去认为与物理、化学刺激、分娩损伤或细菌、原虫感染有关。现在研究表明，宫颈糜烂与人乳头瘤病毒16型(HPV216)、单纯性疱疹病毒2型(HSV22)、巨细胞病毒(MV)及沙眼衣原体感染密切相关，且与宫颈癌关系密切。宫颈糜烂患者中宫颈癌的发病率是正常宫颈的4～7倍，而重度糜烂患者的发病率是轻度糜烂患者的10.1倍。因此积极治疗宫颈糜烂对预防宫颈癌具有重要意义^[2]。

虽然目前对于此病的治疗已有较多的方法，但疗效不甚满意。宫颈糜烂的治疗通常使用内服或外用药物治疗，目前药物治疗有效率低，有报道仅能达到30-40％有效率。而物理治疗包括激光、微波、冷冻等，其原理均为使宫颈阴道部糜烂的组织破坏，使新生的鳞状上皮重新覆盖而达到治疗的目的，治疗方法较昂贵，术后出血时间长，且患者心理负担大，且易出现宫颈深部组织受损导致不育等并发症。且目前方法对于治疗糜烂面大、病变较深的病变，效果均差[3，4]。

重组人成纤维细胞生长因子7突变体治疗宫颈糜烂在国内外尚无报道。重组人成纤维细胞生长因子7突变体具有促进上皮细胞增生，有效修复创伤组织的特点，外用治疗宫颈糜烂在临床上观察到极好效果，且对于传统治疗无效的病例，或者糜烂面大、病变深其它治疗方法无效的病例均有良好效果。局部用药，未发现任何副作用。该治疗方法还具有费用低、使用方便的特点，患者自己在家亦可以上药。基于以上观察，重组人成纤维细胞生长因子7突变体治疗宫颈糜烂具有广泛的临床应用前景。

参考文献：

[1]乐杰.妇产科学[M].6版.北京：人民卫生出版社，2005：255.

[2]李长东，张为远.慢性宫颈炎一定会发展成宫颈癌吗.中国全科医学。2009，5(C)：23

[3]祁志高，张石云，刘佳.三种方法治疗宫颈糜烂的临床观察.吉林医学2009，30(6)：547

[4]郝凤英.微波二氧化碳激光和宫颈环形电切术对宫颈糜烂的临床观察[J].山西医药杂志，2006，35(6)：552.

治疗宫颈糜烂药物.ST25.txt

SEQUENCE LISTING

<110>成都博发生物技术有限公司

<120>重组人成纤维细胞生长因子7突变体在制备治疗宫颈糜烂的药物中的应用

<130>CD566-09P108072

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>140

<212>PRT

<213>重组人成纤维细胞生长因子7突变体

<400>1

Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe

1               5                   10                  15

Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys

            20                  25                  30

Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr

        35                  40                  45

Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr

    50                  55                  60

Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn

65                  70                  75                  80

Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr

                85                  90                  95

Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala

            100                 105                 110

Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu

        115                 120                 125

Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

    130                 135                 140