枣树金属硫蛋白基因及其在处理重金属污染中的应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种枣树金属硫蛋白基因及其在处理重金属污染中的应用，枣树金属硫蛋白基因，其核苷酸序列以及氨基酸序列如序列表中所示SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。(1)将枣树金属硫蛋白基因ZjMT经PCR扩增后与表达载体pGEX-4T-2进行连接，将枣树金属硫蛋白基因ZjMT克隆至表达载体，构建重组表达质粒pGEX-4T-2-ZjMT；(2)将重组表达质粒pGEX-4T-2-ZjMT转化入表达菌株E.coli BL21，构建基因工程菌pGEX-ZjMT-B。该工程菌株对重金属的结合能力明显增强，是实现生物回收重金属和治理重金属污染的有效手段。本发明首次发现ZjMT对重金属离子有吸附作用，实验证明该基因工程菌pGEX-ZjMT-B能不同程度的耐受重金属离子的毒性作用，同时通过富集量测定实验表明其富集重金属离子的量大大提高。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种枣树金属硫蛋白基因及其在处理重金属污染中的应用。

背景技术

水体和土壤是人类生态环境的重要组成部分，也是人类赖以生存的主要自然资源。但是随着现代工业的迅速发展，工业废物、矿泥废物、城市废水、放射性废物、采矿废物等环境废物中含有大量的重金属，如镉、汞、铅等，它们进入环境后不能被生物降解，大都参与食物链循环，并最终在生物体内累积，破坏生物体正常生理代谢活动，严重影响周围环境和人畜健康。迄今为止，重金属污染已经成为世界各国环境污染的重要来源之一。如何有效地处理重金属污染，回收贵重金属，尽快实施重金属超标排放-达标排放-零排放的技术转型，已经成为当前保护环境、节省资源的必经之路。

目前对重金属污染的治理没有特别有效的方法，除对工厂减少重金属排放的治理外，尚无能力对污染区进行精细的处理。对于土壤的重金属污染国际上通常采用工程、农业、改良和生物等措施进行重金属污染的治理；而对于含重金属废水传统的处理方法主要有化学沉淀法、化学氧化还原法、电解法、吸附法、电渗析发、反渗透法等，这些方法在一定条件下有效，但都存在各自的优缺点。例如化学沉淀法虽易快速的除去大量金属离子，但容易形成二次污染。离子交换法尽管操作简单，但需要一定的条件效果才好，而且离子交换树脂选择交换性能不好、价格昂贵。

与传统的处理方法相比，生物吸附法以其广阔的应用前景和较好的环境、社会效益引起了人们的注意。所谓生物法一般是指利用自然界中的植物、微生物(如细菌、真菌、酵母菌、藻类等)，经一定的驯化培养后，形成一些能够吸收、吸附被污染土壤和水中的重金属离子，从而达到治理目的。研究表明，有许多植物能够在重金属污染的土壤上生长，其根、茎、叶中含有高浓度的重金属元素；很多细菌、藻类、真菌等微生物对金属离子有很强的吸附能力。与传统化学、物理方法相比，生物法处理被污染的土壤、废水具有经济、高效且无害化等优点，尤其在处理低浓度重金属污染的土壤、废水中更显示了其相当的优势。

然而从自然界直接筛选出的耐重金属植物一般生物量少，难以直接应用于治理污染土壤；选出的微生物也往往对重金属离子的富集效率低、对环境的适应力差，不利于生物吸附的工程应用。近年来随着分子生物技术的飞速发展，人们已能按自己的意愿改造微生物，选育性能优良的菌株。运用基因工程技术构建具有超强富集能力及高选择性的基因重组微生物，已成为重金属废水生物处理和重金属资源合理利用的新的发展方向。

当前利用生物法处理重金属污染土壤、废水的焦点多集中在克隆一些新的基因，构建新型基因工程菌和转基因植物上，即通过对微生物进行微观研究，确定其吸附重金属的机理和结合重金属的位点，然后运用基因工程技术，将具有吸附性能的基因转入生物量大的植物体内或者克隆到同源或异源的微生物中，以此来提高微生物与重金属离子的亲和力、增强微生物对目标重金属离子的选择性。

金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)是一类广泛存在于生命体中的富含半胱氨酸、能被重金属诱导的低分子量金属结合蛋白，其疏基含量丰富，并在参与金属离子的运输和供给、减除金属离子的解毒、维持细胞内环境的稳态等方而起重要作用。早在1957年，Margoshes和Vallee在研究重金属锡的生物学功能时，从马肾的细胞中分离首次分离出了动物MT。而植物金属硫蛋白的研究起步较晚，Casterline和Barnett于1977年从大豆根中首次发现了植物MT，接着第一个植物MT蛋白小麦胚乳Ec蛋白被分离出来，以后陆续从豌豆、水稻、拟南芥、番茄、荞麦、印度芥菜和玉米等多种植物中发现并分离了许多植物MT基因。到目前为止，还未见有从枣树中分离出MT基因并应用于环境治理的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枣树金属硫蛋白基因及其在处理重金属污染中的应用。

本发明是采用如下技术方案实现的：一种枣树金属硫蛋白基因，其核苷酸序列以及与它对应的氨基酸序列分别如序列表中所示SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

利用所述枣树金属硫蛋白基因制备基因工程菌的方法，包括以下步骤：(1)将枣树金属硫蛋白基因ZjMT经PCR扩增后与表达载体pGEX-4T-2进行连接，将枣树金属硫蛋白基因ZjMT克隆至表达载体，构建重组表达质粒pGEX-4T-2-ZjMT；(2)将重组表达质粒pGEX-4T-2-ZjMT转化入表达菌株Ecoli BL21(DE3)，成功构建表达融合蛋白的基因工程菌pGEX-ZjMT-B。

本发明为：从枣树生长早期结果枝的cDNA文库中克隆到一个225bp(核苷酸)的基因片段，经过与GnBank中已经注册的基因序列比对，证明该片段为一个金属硫蛋白基因的全长cDNA，将其命名为ZjMT(Zizyphus jujuba Mill Metallothionein)。根据该基因的核苷酸序列，设计并合成含酶切位点的一对引物：上游引物P1序列为5′CTGGATCCATGTCTGGCTGTGGTTGT 3′，包括BamH I酶切位点(即划线部分)和保护碱基CT，以及金属硫蛋白起始密码子ATG；下游引物P2为3′AGAAGCTTTCATTTGCACGTGCATG 5′，包括Hind III酶切位点(即划线部分)和保护碱基AG，以及金属硫蛋白终止密码子TGA。然后使用PCR技术成功扩增出ZjMT的目的基因片段，电泳分析ZjMT基因的目的片段大小约为241bp，与预计分子量大小一致(基因全长225bp，加酶切位点和保护碱基后为241bp)。通过将载体pGEX-4T-2制作成T载体后，与PCR扩增出的ZjMT基因的目的片段连接，将ZjMT基因克隆至表达载体pGEX-4T-2，构建重组表达质粒pGEX-4T-2-ZjMT。然后用冷激转化法将重组表达质粒pGEX-4T-2-ZjMT转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)，经PCR以及BamH I、HindIII的双酶切鉴定，转化子稳定转入表达菌种，证实含ZjMT基因工程菌pGEX-ZjMT-B构建成功。最后经IPTG诱导、SDS-PAGE的分子量鉴定，证实基因工程菌pGEX-ZjMT-B成功表达了约35kDa大小的融合蛋白，与预计蛋白分子量大小一致。同时经试验验证该基因工程菌在诱导剂IPTG终浓度0.1mM、诱导时间在4h后，融合蛋白的表达量达到最大。

本发明还提供了一种枣树金属硫蛋白基因及其在处理重金属污染中的应用。

将携带有枣树金属硫蛋白基因的载体pGEX-4T-2-ZjMT通过基因工程手段转入大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)中，构建生物工程菌pGEX-ZjMT-B。该工程菌株对重金属的结合能力明显增强，是实现生物回收重金属和治理重金属污染的有效手段。本发明首次发现枣树金属硫蛋白基因对重金属离子有吸附作用，并首次对构建的生物工程菌pGEX-ZjMT-B进行了重金属离子吸附实验。实验证明该基因工程菌pGEX-ZjMT-B能不同程度的耐受重金属离子(包括Cu，Pb，Cd，Cr，Zn，Mn，Ni，Al)的毒性作用，同时通过富集量测定实验表明工程菌pGEX-ZjMT-B与对照菌pGEX-B对不同的重金属离子吸附能力大不相同，而且工程菌pGEX-ZjMT-B与对照菌pGEX-B相比，富集重金属离子的量大大提高。

附图说明

图1为ZjMT基因的PCR扩增结果

图2为pGEX-4T-2-ZjMT重组质粒菌落PCR鉴定结果

图3为pGEX-4T-2-ZjMT质粒双酶切鉴定结果

图4为pGEX-ZjMT-B重组质粒菌落PCR鉴定结果

图5为pGEX-4T-2-ZjMT重组质粒双酶切鉴定结果

图6为pGEX-ZjMT-B的SDS-PAGE分析结果

图7为IPTG诱导培养时间对ZjMT融合蛋白表达的影响结果

图8为IPTG诱导浓度对ZjMT融合蛋白表达的影响结果

图9为菌种的生长曲线

图10为pGEX-ZjMT-B在不同金属离子中的生长曲线

图11为pGEX-ZjMT-B在不同铜离子浓度中的生长曲线

图12为pGEX-ZjMT-B在不同铅离子浓度中的生长曲线

图13为pGEX-ZjMT-B在不同镉离子浓度中的生长曲线

图14为pGEX-ZjMT-B在不同铝离子浓度中的生长曲线

图15为pGEX-ZjMT-B在不同铬离子浓度中的生长曲线

图16为pGEX-ZjMT-B在不同锰离子浓度中的生长曲线

图17为pGEX-ZjMT-B在不同镍离子浓度中的生长曲线

图18为pGEX-ZjMT-B在不同锌离子浓度中的生长曲线

图19为pGEX-ZjMT-B对Cu²⁺的吸附图谱

图20为pGEX-ZjMT-B对Pb²⁺的吸附图谱

图21为pGEX-ZjMT-B对Cd²⁺的吸附图谱

具体实施方式

实施例1：枣树金属硫蛋白基因ZjMT的获得及重组表达质粒pGEX-4T-2-ZjMT的构建

一、实验方法

1.1感受态细胞的制备

取冻存于-80℃冰箱中的大肠杆菌DH5α，划线接种于LB培养基平板上，37℃培养过夜。从平板中挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃恒温振荡器225r/min振摇培养过夜。按照1％的接种量将过夜培养物接种至50mL的LB液体培养基中，200r/min振摇培养至OD₆₀₀为0.5-0.6。将培养物置于冰上10min，4℃、8,000g离心10min。弃上清，加入5mL预冷的75mmol/L CaCL₂溶液悬浮细胞，置于冰上10min，使细胞致敏。4℃8,000g离心10min，收集菌体。每50mL原培养物加入2mL冰预冷的75mmol/L CaCl₂保存液(内含15％甘油)，按200μL/离心管分装细胞，-80℃冰箱保存备用。

1.2连接产物的转化

将5μL待转化的连接产物加入到100μL的新鲜或保存于-80℃的大肠杆菌感受态细胞DH5α中，温和混匀，冰上放置30min。放入预加温到42℃的循环水浴中热休克90s，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3-5min。加400μL SOC培养基，将管转移到37℃的摇床上，温浴40min使细菌复苏，复苏期应温和的摇动细胞(转速低于225转份)。将适当体积已转化的感受态细胞转移到LB平板(含抗性)。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃静置培养过夜。

1.3质粒DNA的提取

碱裂解法快速提取质粒pGEX-4T-2、pSPORT1-MT。其提取方法是本领域的技术人员熟知的，在此不作详细描述。

1.4T载体的制备

用Smal I酶解1μg pGEX-4T-2，37℃2h以上；溶液扩大体积至100μl，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(V∶V∶V＝25∶24∶1)充分混匀后，1,3000g 10min；转移上层水相至新的离心管中，加入200μl冷的无水乙醇，-20℃放置30min以上以沉淀线性化DNA；1,4000g 10min离心收集沉淀，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀后，真空干燥。

将线性化质粒DNA溶于10μl水中，按顺序加入下列物质：2.5μl 10×PCR buffer、0.5μl100mmol/L dTTP、0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，用水补充体积至25μl，72℃2h；用水扩大反应体系至100ul，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(V∶V∶V＝25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提，1,3000g 10min；转移上层水相至新的离心管中，加入200μl冷的无水乙醇，-20℃放置30min以上；1,4000g 10min离心收集沉淀，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀两次，真空干燥。将沉淀溶于适量TE溶液中，含量大致为25-50ng/μl，-20℃保存备用。

1.5 ZjMT核苷酸序列的获得

春天采集壶瓶枣树(Ziziphus jujuba Mill.HUPING)长度约2mm的结果枝(枣吊)，利用CTAB法提取总RNA，根据mRNA纯化试剂盒(货号：Z5200)购自Promega(美国)方法从提取到的总RNA中分离纯化mRNA。利用cDNA文库构建试剂盒(货号：18248-039)购自Invitrogen(美国)构建cDNA文库。将获得的文库中的cDNA与克隆载体pSPORT1连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素抗性的平皿37℃培养过夜，蓝白斑筛选重组质粒并委托上海生工测序。

将测序结果利用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线分析软件进行Blast分析，结果表明其中的一个cDNA序列为枣树中的金属硫蛋白同源基因全序列。将其命名为ZjMT(Zizyphusjujuba Mill Metallothionein)。

根据上述已经获得的枣树金属硫蛋白基因的精确核苷酸序列设计并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成如下引物，用于ZjMT基因的克隆。上游引物P1序列为5′CTGGATCCATGTCTGGCTGTGGTTGT 3′，包括BamH I酶切位点(即划线部分)和保护碱基CT，以及金属硫蛋白起始密码子ATG；下游引物P2为3′AGAAGCTTTCATTTGCACGTGCATG 5′，包括Hind III酶切位点(即划线部分)和保护碱基AG，以及金属硫蛋白终止密码子TGA。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以克隆载体pSPORT1-ZjMT为模板，以P1和P2为引物，扩增获得含完整开放阅读框的枣树金属硫蛋白基因。PCR反应体系组成为：5μL 10×PCR buffer，1μL 2.5Mm dNTPs，10pmol P1，10pmol P2，1.5U Taq DNA聚合酶，50ng的模板，去离子水补充体积至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃30s、52℃30s、72℃1min 35个循环，最后72℃延伸5min。

取5μL PCR产物，1.2％琼脂糖凝胶电泳分析确认片段大小。按照DNA纯化试剂盒说明操作，纯化PCR产物。

1.6重组表达质粒pGEX-4T-2-ZjMT的构建

用DNA连接酶将制备好的pGEX-4T-2-T载体与纯化后的ZjMTPCR产物进行连接，连接反应体系总体积为10μL，包括0.5μL 4DNA连接酶、300ng基因片段和300ng pGEX-4T-2-T。16℃连接过夜，按前述方法将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞。

1.7重组表达质粒的鉴定

待转化菌于氨苄青霉素抗性平板上长出菌落后，用无菌牙签挑取24个白色的转化子菌落，沸水浴裂解。取1μL作为模板进行PCR阳性鉴定，将鉴定为阳性的转化体划线培养。

将PCR鉴定为阳性的克隆子用碱裂减法提取质粒DNA后，再用BamH I进行单酶切鉴定。将上述单酶切没有切出目的片段的质粒pGEX-4T-2-ZjMT，用BamH I和HindIII双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳后验证片段的大小，保存有目的片段的阳性菌。

1.8序列测定

将酶切鉴定正确的阳性克隆质粒送上海生工生物工程公司进行序列测定，得到枣树金属硫蛋白基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

二、实验结果与分析

2.1PCR扩增的ZjMT基因片段

含ZjMT基因的重组质粒pSPORT1-ZjMT为模板，PCR扩增出目的片段，扩增产物经与分子量标记(marker)对比电泳结果表明，扩增片段与预计分子量241bp大小一致如图1所示，图中1：DNA marker；2：PCR产物。

2.2重组表达质粒pGEX-4T-2-ZjMT的构建与鉴定

载体pGEX-4T-2-T与ZjMT片段连接后，单菌落经PCR鉴定后结果表明，在241bp间有明显的目的基因扩增条带，与预期结果一致，如图2所示，图中1：DNA marker；2-9：菌落PCR；提取有扩增带的阳性克隆质粒并经BamH I单酶切没有目的片段后，将该质粒经BamH I和HindIII双酶切鉴定，酶切图谱如图3所示，图中1：DNA marker；2：pGEX-4T-2-ZjMT质粒酶切，结果表明有一条241bp的条带，与原PCR扩增带完全一致，证明目的基因ZjMT的表达载体构建成功，所获表达载体命名为pGEX-4T-2-ZjMT。

2.3实验结果总结

根据枣ZjMT精确基因序列，设计并合成含酶切位点的一对引物，成功从pSPORT1-MT中克隆得含完整阅读框的ZjMT基因，使用PCR技术成功扩增出ZjMT的目的基因片段，通过电泳分析ZjMT的目的基因片段大小约为241bp，与预计分子量大小一致。将PCR扩增的外源片段ZjMT的目的基因片段基因与表达载体pGEX-4T-2进行A/T克隆，构建了表达载体pGEX-4T-2-ZjMT。该表达载体的构建为下一步在原核系统中表达ZjMT基因奠定了基础。

实施例2：基因工程菌pGEX-ZjMT-B的构建(即ZjMT在原核生物中的表达)

一、实验方法

3.1基因工程菌pGEX-ZjMT-B的构建和筛选

①将前章构建的重组质粒pGEX-4T-2-ZjMT和载体pGEX-4T-2通过热激法，导入表达菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂于分别含氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB平板，37℃静置培养过夜。

②从37℃过夜培养的重组质粒pGEX-4T-2-ZjMT转化的平板上分别随机挑选生长良好的5个单菌落，各取二分之一菌落沸水浴裂解，进行PCR鉴定，将鉴定出的阳性工程菌重新划线，保存。

③碱裂减法提取PCR鉴定出的阳性重组质粒，用BamHI和HindIII进行双酶切重组质粒pGEX-4T-2-ZjMT，琼脂糖凝胶电泳验证质粒的稳定性。

④鉴定出的阳性工程菌重新划线保存一份，备用。

⑤从鉴定出的阳性工程菌pGEX-ZjMT-B(导入pGEX-4T-2-ZjMT质粒的E.coli BL21(DE3)的菌株)与对照菌pGEX-B(导入pGEX-4T-2质粒的E.coli BL21(DE3)的菌株)进行SDS-PAGE检测。加入IPTG终浓度至0.4mmol/L，分别在37℃进行诱导培养5h。

3.2SDS-PAGE不连续系统电泳样品制备

①将阳性工程菌pGEX-ZjMT-B与对照菌pGEX-B分别挑取1-2个单菌落，接入10mL分别含氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养过夜。

②按1∶100的比例接种于相同的LB培养基上，37℃培养2-4h以上，至OD₆₀₀约为0.5。

③在培养物中加入不同浓度的IPTG，37℃继续通气培养。

④于不同诱导时间取2mL样品放于微量离心管中，室温，13,000g离心1min。

⑤沉淀重悬于200μL 1×SDS上样缓冲液，用时加20μL巯基乙醇，混匀。100℃加热5-10min，冰上放置，待全部样品处理完后上样。

3.3SDS-PAGE不连续系统电泳操作方法

①将玻璃板依次用自来水、SDS、自来水洗净，用无水乙醇擦拭干净，再用超纯水冲洗干净，晾干。待玻璃板干后，根据厂家的说明安装玻璃板。

②称取1.5g琼脂粉，放入三角瓶，加入100mL 1×电泳缓冲液，加热溶解，置桌面上冷却至不烫手(约50-60℃)，开始在玻璃板外边缘灌注电极胶。电极胶装完后，静置15min左右。

③按照下表3-1所示先配制15％分离胶。迅速在两玻璃板的间缝中注入分离胶溶液，注意不要动作太大，防止出现气泡。可用5mL移液器吸取胶溶液均匀灌下，不要把胶溶液溢到外面。离玻璃板上端5cm左右停止灌注，用少许超纯水封住胶的液面，将凝胶垂自放置于室温约30min待胶完全凝固。

表3-1SDS-PAGE分离胶和浓缩胶成分表

④用滤纸吸干液面上的水，灌注5％浓缩胶，离玻璃板上端2mm左右停止灌注，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，避免混入气泡，将凝胶垂自置室温下。

⑤积层胶聚合完全后，小心移出梳子，立即用去离子水洗涤加样槽以去除未聚合的沉凝物，一小时左右后，在电泳槽中加入1×电泳缓冲液。

⑥浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，用微量移液器加样。

⑦打开电泳仪，开始电泳，浓缩胶稳压70v，但是电流不要超过20mA，当凝胶中溴酚蓝到达分离胶时升压至150v继续电泳，当溴酚蓝距凝胶底部1cm处分离胶底部，电泳结束。

⑧将胶卸下，左下切角，加入适量的固定液进行固定处理。

⑨凝胶固定约1.5h，考马斯亮蓝R-250染色2h，最后脱色至背景清晰为止。

⑩照相保存，观察分析结果。

3.4融合蛋白分子量的表达和测定

从鉴定出的阳性工程菌pGEX-ZjMT-B与对照菌pGEX-B进行SDS-PAGE检测。加入IPTG终浓度至0.4mM，分别在37℃进行诱导培养5h。

在同一块SDS-PAGE凝胶上分离标准分子量蛋白质和待测的重组蛋白，凝胶经考马斯亮蓝R-250染色后，照相保存，然后利用生物软件网的Protein Analysis，对重组蛋白的分子量进行分析计算，工程菌pGEX-ZjMT-B表达蛋白大小与预计一致。

3.5IPTG诱导对ZjMT融合蛋白影响

3.5.1IPTG诱导时间对ZjMT融合蛋白表达的影响

选取鉴定出的阳性工程菌pGEX-ZjMT-B，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.5左右，加人IPTG至终浓度为0.4mM，37℃诱导培养，于0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h取出2mL菌液，以不含插入子的pGEX作为空白对照，菌pGEX-B同样加人IPTG至终浓度为0.4mM，37℃诱导培养，于0h、1h、2h、3h、4h取出2mL菌液，按上述样品制备的方法制备样品，每个样品取20μL，进行SDS-PAGE检测，分析菌液诱导时间对蛋白诱导表达量的影响。

3.5.2IPTG诱导浓度对ZjMT融合蛋白表达的影响

选取鉴定出的阳性工程菌pGEX-ZjMT-B，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.5左右，加入IPTG至终浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mM，37℃诱导培养4h，以不含插入子的pGEX作为空白对照，菌pGEX-B同样加入IPTG至终浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM，按上述样品制备的方法制备样品，每个样品取20μL，进行SDS-PAGE检测，分析菌液诱导浓度对蛋白诱导表达量的影响。

二、实验结果与分析

4.1重组菌的筛选

含重组质粒pGEX-4T-2-ZjMT的经PCR鉴定后结果表明，在241bp处有明显的目的基因扩增条带，与预期结果一致如图4所示，图中1：DNA marker；2-4：基因工程菌pGEX-ZjMT-B菌落PCR；提取带有目的基因的阳性克隆质粒，用BamHI和HindIII进行双酶切重组质粒，琼脂糖凝胶电泳结表明在241bp处有一条条带，图谱如图5所示，图中：1：DNA marker；2-3：pGEX-4T-2-ZjMT质粒双酶切；证明带有目的基因ZjMT的载体pGEX-4T-2-ZjMT成功转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。

4.2基因工程菌pGEX-ZjMT-B表达融合蛋白的SDS-PAGE分析

工程菌pGEX-ZjMT-B经IPTG诱导4h后取样，电泳结果如图6所示，图中：1：低分子量蛋白marker；2：pGEX-ZjMT-B；3：pGEX-B，GST蛋白分子量为26.985kDa，等电点为6.453，加上重组入的外源片段MT基因片段大小为237bp，其携带的遗传信息以三联体密码子的方式被翻译成79个氨基酸残基，分子量约为8kDa，经生物软件网的Protein Analysis分析蛋白质分子量可知，融合蛋白的总分子量约35kDa；根据对基因工程菌的SDS-PAGE分析显示：目的蛋白的迁移位置在35kDa附近，目的融合蛋白成功表达。

4.3IPTG诱导对ZjMT融合蛋白表达的影响

4.3.1IPTG诱导时间

IPTG是重组菌表达目的蛋白常用的诱导剂。在用新鲜培养基百分之一转接工程菌pGEX-ZjMT-B和对照菌pGEX-B振荡培养OD₆₀₀值为0.5左右，加入IPTG至终浓度0.4mM，分别于不同时间收获菌体，进行SDS-PAGE检测。结果表明：而且在开始，随着诱导时间的增加其表达的蛋白量也明显增加，在4h处表达量达到最大，后随着时间的增加，蛋白量没有明显变化如图7所示，图中：1：低分子量蛋白marker；2-8：pGEX-ZjMT-B，IPTG诱导时间分别为0、1、2、3、4、5、6h；9-13：pGEX-B，IPTG诱导时间分别为0、1、2、3、4h。

4.3.2IPTG诱导浓度

实验采用不同终浓度的IPTG(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mM)分别进行诱导表达，进行SDS-PAGE检测。结果表明：不同IPTG诱导浓度下，工程菌pGEX-ZjMT-B表达的蛋白条带变化不明显，说明IPTG诱导浓度对蛋白表达量影响不大，即IPTG在低浓度下就可以诱导融合蛋白大量表达如图8所示，图中：1：低分子量蛋白marker；2-9：pGEX-ZjMT-B，IPTG诱导浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mM；10-16：pGEX-B，IPTG诱导浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM。

4.4室验结果总结

基因工程的最终目的就是要在合适的系统中高效表达所需的活性蛋白，因此，在表达某一种蛋白质之前，首先要明确所要表达蛋白的结构特点及最终目标，然后根据需要选择相应的宿主-载体系统。根据所选取的宿主菌的不同，有原核表达和真核表达两种。

在本发明中，之所以选择大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌，是因为大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用广泛的经典原核表达系统；与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高、培养方法简单、生长迅速、成本低、抗污染能力强等特点，是用作表达多种蛋白质的理想工具。

本实施例即在实施例1的基础上，将重组质粒pGEX-4T-2-ZjMT转化入表达菌E.coliBL21(DE3)，构建表达融合蛋白的基因工程菌pGEX-ZjMT-B，通过SDS-PAGE鉴定，基因工程菌pGEX-ZjMT-B在35kDa处表达了目的蛋白，与预计蛋白分子量大小一致。并同时研究了融合蛋白在不同浓度IPTG和不同诱导时间下的表达情况；表明融合蛋白在IPTG终浓度0.1mM且诱导4h后即可获得融合蛋白的大量表达。

实施例3：基因工程菌pGEX-ZjMT-B在处理重金属污染中的应用

一、实验方法

5.1细菌生长曲线的测定

取出培养皿，用无菌牙签挑取单个的工程菌pGEX-ZjMT-B和对照菌pGEX-B菌落，放入10mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，封好管口(注意：不能旋紧)。37℃恒温振荡器225r/min振摇培养过夜，活化细菌。取500μL过夜培养的菌液加入到50mL含氨苄青霉素抗性的LB新鲜培养基中，记下移入菌体的时间，并测量初始的OD₆₀₀值。以后每隔一定的时间依次取样测定OD₆₀₀值，记下取样的时间。

5.2细胞干重的测量

取出培养皿，用无菌牙签挑取单个的工程菌pGEX-ZjMT-B和对照菌pGEX-B菌落，放入10mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，封好管口(注意：不能旋紧)。37℃恒温振荡器225r/min振摇培养过夜，活化细菌。取500μL过夜培养的菌液加入到含氨苄青霉素抗性的LB新鲜培养基中，37℃振荡培养。测量基因重组菌和对照菌菌体悬浮液OD₆₀₀的值，然后取50mL该悬浮液用微型离心机分离菌体后洗涤、烘干，得出50mL的细菌的干重，经公式换算可知相应的OD₆₀₀为1时对应多少毫克每升的细菌。

5.3不同金属离子对细菌生长的影响

取出培养皿，用无菌牙签挑取单个的工程菌pGEX-ZjMT-B菌落，放入10mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，封好管口(注意：不能旋紧)。37℃恒温振荡器225r/min振摇培养过夜，活化细菌。取500μL过夜培养的菌液加入到含氨苄青霉素抗性的LB新鲜培养基中，记下移入菌体的时间，并测量初始的OD₆₀₀值，37℃振荡培养。每隔一定的时间测量OD₆₀₀，当OD₆₀₀为0.5左右时，根据实验需要，分别加入IPTG使其终浓度为0.1mM，并分别加入铜(Cu²⁺)、铅(Pb²⁺)、镉(Cd²⁺)、汞(Hg²⁺)使其浓度为200μM。记录取样时间，以后每隔一定的时间依次取样测定OD₆₀₀值，记下取样的时间。

5.4金属离子浓度对细菌生长的影响

取出培养皿，用无菌牙签挑取单个的工程菌pGEX-ZjMT-B和对照菌pGEX-B菌落，放入含有10ml LB液体培养基的试管中，封好管口(注意：不能旋紧)。37℃恒温振荡器225r/min振摇培养过夜，活化细菌。取500μL过夜培养的菌液加入到50mL LB新鲜培养基中，记下移入菌体的时间，并测量初始的OD₆₀₀值，37℃振荡培养。每隔一定的时间测量OD₆₀₀，当OD₆₀₀为0.5左右时，根据实验需要，分别加入IPTG使其终浓度为0.1mM，并分别加入铜(Cu²⁺)、铅(Pb²⁺)、镉(Cd²⁺)、铬(Cr³⁺)、铝(Al³⁺)、镍(Ni²⁺)、锌(Zn²⁺)、锰(Mn²⁺)观察不同浓度下，细菌生长曲线的变化。记录取样时间，以后每隔一定的时间依次取样测定OD₆₀₀值，记下取样的时间。

5.5基因工程菌对不同金属离子的富集量的试验

取出培养皿，用无菌牙签挑取单个工程菌pGEX-ZjMT-B和对照菌pGEX-B菌落，放入10mL含氨苄青霉素抗性MJS液体培养基的，封好管口(注意：不能旋紧)。37℃恒温振荡器r/min振摇培养过夜，活化细菌。

取6个已泡过硝酸的250mL的锥形瓶，分别加入100mL含氨苄青霉素抗性MJS培养基，1∶100接种于含氨苄青霉素抗性MJS新鲜培养基中，37℃恒温振荡器225r/min振摇培养2h至OD₆₀₀到0.5左右，工程菌pGEX-ZjMT-B和对照菌pGEX-B中分别加入Pb²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺，调节其终浓度为200μM。继续37℃恒温振摇培养4h，用泡过硝酸的大离心管在大型离心机中以5,000g的速度离心10min。

用含0.85％NaCl的5mmol/L HEPES(pH7.1)缓冲液冲洗细菌沉淀三次，离心后收集细菌沉淀，于Eppendorf管冻干。在干菌中加入70％硝酸4mL，于42℃水浴反应过夜，加6mL去离子水稀释待测。

5.6分析测量方法

5.6.1比浊度法测量菌体浓度

菌体浓度测量采用核酸蛋白检测仪在600nm波长下测定其光密度，利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况。每次测量样品的消光系数前，需要将两个比色皿装适量的去离子水调零，消除两个比色皿的差异。

5.6.2金属离子浓度的测量

将待测的重金属离子溶液用去离子水稀释到待测金属离子的最佳浓度范围内进行测量。采用瓦里安AA240FS快速序列式原子吸收光谱仪进行测定。

二、实验结果与分析

6.1细菌生长曲线的比较

微生物生长一般包括四个阶段：停滞期、指数期或对数期、稳定期和衰亡期。微生物各自的生长曲线形状基本相同，即表现出相似的生长规律。停滞期一般为几个小时，此时细胞体积不断增大，积累有机物并存储化学能；指数期生物进入快速分裂期，生物个体成指数或对数增长；指数期细胞的分裂速度降低，新生成的细胞数目与老死的细胞数目基本保持一致；衰亡期细胞的死亡速率超过生成速率，活体数目开始下降。

由于工程菌pGEX-ZjMT-B和对照菌pGEX-B导入的是相同的宿主菌，所以在没有诱导剂和金属离子的情况下，二者的生长曲线大致相同。二者的停滞期很短，基本都为2h左右，此后细胞进入指数生长期，pGEX-ZjMT-B和pGEX-B生长繁殖很快，到20h左右都到达菌体的最大生长量，OD₆₀₀分别为2.89和2.86，而且在20-24h之间，pGEX-ZjMT-B和pGEX-B基本进入稳定期，随着进一步培养，由于一些营养成分的缺失以及代谢废物的增多，二者生长均进入衰亡期开始自溶，OD₆₀₀值下降。

本实验的目的是为pGEX-ZjMT-B和pGEX-B在含金属离子的液体培养基中的生长和富集情况做前期准备，所以绘制pGEX-ZjMT-B和pGEX-B在不含金属离子的液体培养基中的生长曲线，了解细菌各时期的生长变化，以便和含金属离子的液体培养基中的细菌生长情况进行比较，有助于把握加入IPTG和金属离子的时间。图9为pGEX-ZjMT-B和pGEX-B的生长曲线。

6.2细胞干重的测量

通过实验，测量所得的pGEX-ZjMT-B和pGEX-B的细胞干重(g/L，OD₆₀₀＝1)分别为0.612和0.610。

6.3不同金属离子对pGEX-ZjMT-B生长的影响

为了了解pGEX-ZjMT-B对不同金属离子耐受性的反应情况，本研究使用了4种常见的有毒的重金属离子：铜(Cu²⁺)、铅(Pb²⁺)、镉(Cd²⁺)、汞(Hg²⁺)，各金属离子在培养基中的终浓度均为200μM，通过通过测量OD₆₀₀观察在培养基中加入不同的金属离子后pGEX-ZjMT-B的生长状况，得到在不同的金属离子溶液中pGEX-ZjMT-B的生长曲线如图10。

如图所示，在含Cu²⁺、Pb²⁺的培养液中，pGEX-ZjMT-B的生长受到的影响很小；含Cd²⁺的溶液中，pGEX-ZjMT-B的生长相对较缓；含Hg²⁺的溶液中，细菌几乎不能生长，在一开始生长就受到抑制，表现出了毒性效应而死亡。

由于本实验是在菌株进入对数期后，加入IPTG和金属离子的，在进入对数期即第3.5h，在含有Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺四种金属离子的培养液中pGEX-ZjMT-B的生长和无金属离子的培养液中pGEX-ZjMT-B的生长几乎接近；但到第4.5h，在含Cu²⁺、Pb²⁺的培养液中，pGEX-ZjMT-B的生长没有受到明显影响，含Cd²⁺的培养液中pGEX-ZjMT-B的生长速度减慢，而含Hg²⁺的培养液中，pGEX-ZjMT-B的生长受到明显抑制，细菌数目下降；随培养时间的增加，在含Cu²⁺和Pb²⁺培养液中，pGEX-ZjMT-B的生长依然没有受到明显影响；含Cd²⁺的培养液中pGEX-ZjMT-B的生长速度更加缓慢，甚至在7-8h出现一个短暂的停歇，细菌数量基本不变；此时，含Hg²⁺的培养液中，pGEX-ZjMT-B的生长早已受到抑制，细菌数量减少；到第20h，pGEX-ZjMT-B在Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺四种金属离子培养液中和无金属离子的培养液中的生长已出现明显差异，此时的OD₆₀₀分别为：2.575、2.68、1.779、0.21、2.88。

由上图可以看出，在相同浓度的Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺溶液中，pGEX-ZjMT-B都表现出较好的耐受性，而在Hg²⁺溶液中，pGEX-ZjMT-B几乎不能生长，在一开始就表现出了毒性效应，表明pGEX-ZjMT-B对Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺有较好的耐受性，此实验为后面进一步研究pGEX-ZjMT-B对Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺的吸附性能打下基础。

6.4不同浓度的金属离子对pGEX-ZjMT-B生长曲线的影响

基于以上试验结果，下面主要考察工程菌pGEX-ZjMT-B对各种Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Al³⁺、Cr³⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺离子浓度的耐受性。以不加各种金属离子的培养液为对照。图11-18列出了各种金属离子浓度下的实验结果。

在LB液体培养基中，工程菌pGEX-ZjMT-B的生长受抑制程度随着培养基中金属离子浓度提高而增加，而且表现出对各种金属离子有不同的耐受性。

①Cu²⁺浓度对工程菌pGEX-ZjMT-B的影响：在图11中，pGEX-ZjMT-B在2000μM以下的含Cu²⁺培养液中均能生长，但随着浓度的增长生长明显受到抑制，培养24h与对照(没有Cu²⁺的培养液)相同达到稳定期；当Cu²⁺浓度达到3000μM时，工程菌的生长受到严重抑制，前期几乎没有生长，但7h以后工程菌的生长又得到了恢复，24和以后基本恢复到没有加Cu²⁺的培养的稳定水平；当Cu²⁺浓度达到4000μM时，工程菌不能生长，而且培养24h和以后也不能恢复。

在相同的培养条件，pGEX-B在100-400μM铜离子溶液中不受影响，随着Cu²⁺浓度的增大，对照菌pGEX-B进入指数期的时间略显延长，生长速度减慢。当铜离子浓度为1500μM时，其迟滞期显著延长，相同培养条件下，对照菌pGEX-B的生长受到明显的抑制，较早进入稳定期，OD₆₀₀值下降。

②Pb²⁺浓度对工程菌pGEX-ZjMT-B的影响：在图12中，pGEX-ZjMT-B在800μM以下Pb²⁺培养液中生长基本不受影响。在Pb²⁺浓度1600μM时，当加入Pb²⁺时出现菌体裂解的现象(培养液变白，显微镜下观察到解体的菌体残片)，但随培养时间的延长，最终达到与低浓度溶液相同的OD₆₀₀值；随着Pb²⁺浓度得升高，菌体解体的比例也同时升高，当在Pb²⁺浓度达到2600μM以上时，由于菌体解体使培养液变白，显微镜下几乎观察不到存活的菌体。

③Cd²⁺浓度对工程菌pGEX-ZjMT-B的影响：在图13中，工程菌pGEX-ZjMT-B在900μM以下Cd²⁺培养液中能生长，但生长随着浓度的增加明显下降。当Cd²⁺浓度增加到1200μM以上时，随着培养时间的增加，工程菌的浓度不但没有升高反而降低到了初始浓度(0.5)以下，说明工程菌由于Cd²⁺的毒性使菌体出现死亡。表现了镉离子相比铜离子、铅离子有更强的生物毒性。

④Al³⁺浓度对工程菌pGEX-ZjMT-B的影响：图14中，工程菌pGEX-ZjMT-B在1500μM以下Al³⁺培养液中能生长，当Al³⁺浓度增加到3000μM时，与Pb²⁺同样出现菌体裂解的现象，并随Al³⁺浓度的增加菌体裂解比例增高，4500μM时，显微镜下几乎观察不到存活的菌体。

⑤Cr³⁺浓度对工程菌pGEX-ZjMT-B的影响：图15，工程菌pGEX-ZjMT-B在Cr³⁺培养液中随着Cr³⁺浓度的升高生长逐渐减弱，当Cr³⁺浓度增加至4200μM时，菌体生长严重受阻，但随着培养时间的延长菌体逐渐恢复生长；但当Cr³⁺浓度继续增加至4400μM时，延长培养时间也不能使菌体恢复生长。

⑥Mn²⁺浓度对工程菌pGEX-ZjMT-B的影响：图16中，工程菌pGEX-ZjMT-B在Mn²⁺培养液中随着Mn²⁺浓度的升高生长逐渐减弱，当Mn²⁺浓度升至10000μM时，菌体几乎没有生长，维持在初始浓度的0.5，但没有出现随培养时间的增加恢复生长或者菌体死亡(浓度降到0。县以下)现象。

⑦Ni²⁺浓度对工程菌pGEX-ZjMT-B的影响：图17中，工程菌pGEX-ZjMT-B在Ni²⁺培养液中随着Ni²⁺浓度的升高生长逐渐减弱，Ni²⁺浓度在1000μM以下培养21h以后都会恢复到几乎同样的正常生长水平；1500μM时已经在培养21h以后不能恢复到正常生长水平；增加至3000μM时则不能恢复生长。

⑧Zn²⁺浓度对工程菌pGEX-ZjMT-B的影响：图18中，工程菌pGEX-ZjMT-B在Zn²⁺培养液中的生长与上述Ni²⁺的趋势相同，只是当Zn²⁺浓度增至1500μM时，菌体已不能恢复生长。

6.5细菌的平衡富集量

在浓度均为200μM的Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺溶液中，工程菌pGEX-ZjMT-B和对照菌pGEX-B对不同金属离子的富集实验结果如图19-21。与pGEX-B相比，重组了金属硫蛋白基因的pGEX-ZjMT-B对金属离子的富集容量有很大的提高。这是因为重组菌中表达出来的金属硫蛋白所起的作用，金属硫蛋白将溶液中金属离子的高选择性结合后跨过细胞膜转运到细胞质内，使在细胞内富集。

①细菌对Cu²⁺的富集：Cu²⁺标准溶液的浓度分别为0、1、2、3、4、5mg/L，用。瓦里安AA240FS快速序列式原子吸收光谱仪测得的平均吸光度为0.0007、0.1383、0.2675、0.3810、0.4905、0.5990，用Excell拟合的线性方程为：Asp＝0.1189C+0.0156，测得pGEX-ZjMT-B和pGEX-B菌液分别平均吸光度0.1564、0.2221，由公式计算得出pGEX-ZjMT-B和pGEX-B可吸附Cu²⁺的量分别为17.368、11.842mg吸附量提高了43.1％，如图19所示。

②细菌对Pb²⁺的富集：Pb²⁺标准溶液的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L，用。瓦里安AA240FS快速序列式原子吸收光谱仪测得的平均吸光度为0.0008、0.0063、0.0119、0.0171、0.0225、0.0276，用Excell拟合的线性方程为：Asp＝0.0537C+0.001，将待测液体稀释50倍，测得pGEX-ZjMT-B和pGEX-B菌液的平均吸光度分别为0.0103、0.0075，由公式计算得出pGEX-ZjMT-B和pGEX-B可吸附Pb²⁺的量分别为86.592、60.515mg，吸附量提高了46.7％，如图20所示。

③细菌对Cd²⁺的富集：Cd²⁺标准溶液的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L，用。瓦里安AA240FS快速序列式原子吸收光谱仪测得的平均吸光度为0.0007、0.0422、0.0847、0.1228、0.1602、0.1993，用Excell拟合的线性方程为：Asp＝0.3957C+0.0027，将待测液体稀释50倍，测得pGEX-ZjMT-B和pGEX-B菌液的平均吸光度分别为0.0120、0.0108，由公式计算得出pGEX-ZjMT-B和pGEX-B可吸附Cd²⁺的量分别为17.513、10.235mg，吸附量提高了71.1％，如图21所示。

6.6室验结果总结

将重金属耐受基因通过基因工程手段转入微生物中，增强工程菌株对重金属的结合能力，是实现生物回收重金属和治理重金属污染的有效手段。

本发明构建了在E.coli BL21(DE3)表达金属硫蛋白的工程菌pGEX-ZjMT-B用于对Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺的吸附，通过考察在不含重金属的液体培养液中工程菌pGEX-ZjMT-B和对照菌pGEX-B的生长状况，大体把握了加入诱导剂IPTG和金属离子的时间。在终浓度分别为200μM Pb²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺的液体培养液中，工程菌pGEX-ZjMT-B经过诱导剂IPTG的诱导，发现Pb²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺对工程菌影响较小。

进一步考察了八种金属离子浓度对工程菌pGEX-ZjMT-B相比对照菌pGEX-B生长情况的影响，发现工程菌pGEX-ZjMT-B在终浓度高浓度的Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Al³⁺、Cr³⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺生长良好，而pGEX-B的生长已受到抑制，说明工程菌pGEX-ZjMT-B能较好的耐受金属离子的毒性作用。

最后，为了使工程菌pGEX-ZjMT-B能够在实际的污染环境中发挥高效的去除重金属功能，又对其在含有单一重金属的液体培养基中的情况进行了科学的分析。通过研究工程菌pGEX-ZjMT-B对Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺的富集实验，表明工程菌pGEX-ZjMT-B与对照菌pGEX-B对不同的金属离子吸附能力大不相同，吸附Pb²⁺的能力高于吸附Cu²⁺、Cd²⁺；通过对Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺吸附量的比较，工程菌pGEX-ZjMT-B与对照菌pGEX-B相比，吸附量分别提高43.1％、46.7％、71.1％。

SEQUENCE LISTING

<110>山西省农业生物技术研究中心

<120>枣树金属硫蛋白基因及其在处理重金属污染中的应用

<160>2

<210>1

<211>225

<212>DNA

<213>枣树(Ziziphus jujuba Mill.)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(225)

<400>1

atgtctggct gtggttgtgg ctctagctgc tcgtgtggaa gtggctgcaa atgtggtaga 60

aaccctgacc tcggttactc cgagaagacc accactgaaa ccatcgttgt tggggttgca 120

ccagttaaga tagacaatga tggatcggag gtgagccatg gaacagagaa cgaggggtgc 180

ggctgcggca gtaactgcaa gtgcgaccca tgcacgtgca aatga                 225

<210>2

<211>75

<212>PRT

<213>枣树(Ziziphus jujuba Mill.)

<400>2

Met Ser Gly Cys Gly Cys Gly Ser Ser Cys Ser Cys Gly Ser Gly

1                5                   10                  15

Cys Lys Cys Gly Arg Asn Pro Asp Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Thr

                 20                  25                  30

Thr Thr Glu Thr Ile Val Val Gly Val Ala Pro Val Lys Ile Asp

                 35                  40                  45

Asn Asp Gly Ser Glu Val Ser His Gly Thr Glu Asn Glu Gly Cys

                 50                  55                  60

Gly Cys Gly Ser Asn Cys Lys Cys Asp Pro Cys Thr Cys Lys *

                 65                  70                  75