兴国红鲤与“全红”体色瓯江彩鲤的分子遗传鉴别方法

摘要

本发明涉及兴国红鲤(Cyrpinus carpio var.singuonensis)与“全红”体色瓯江彩鲤(Cyrpinus carpio var.color)的分子遗传鉴别方法，包括下列步骤：(1)根据外部形态取出待鉴定的红鲤；(2)提取待鉴定的红鲤的基因组DNA；(3)以提取的基因组DNA为模板，根据CO II基因和tRNA

说明书

技术领域

本发明属于遗传学领域，涉及两种红鲤的分子鉴别方法，具体地讲，涉及兴国红鲤(Cyrpinus carpio var.singuonensis)和“全红”体色瓯江彩鲤(Cyrpinus carpio var.color)分子遗传鉴别方法。

背景技术

兴国红鲤(图1)分布于江西省兴国县，是我国优良的鱼类育种材料，参与构建了生产上许多具有较高经济价值和社会效益的杂交组合，产生了巨大的生产、经济价值和社会效益。瓯江彩鲤分布于浙江省瓯江流域，是一种养殖面积较为广泛，具有食用和观赏双重价值的多体色类型彩鲤。瓯江彩鲤目前已具有7种体色(5种原有的体色类型，2种近几年开发出来的新体色类型)。瓯江彩鲤除体色丰富外，在形态上与兴国红鲤十分相似，均为纺缍形。其中“全红”体色瓯江彩鲤(图2)的体表全身红色，从形态和体色上不能将其与兴国红鲤区别开来。表1为兴国红鲤与“全红”体色瓯江彩鲤外部形态可量性状的比例变化。

表1兴国红鲤与“全红”体色瓯江彩鲤外部形态的可量性状比例

  性状  兴国红鲤  “全红”体色瓯江红鲤  体长/体高  2.87±0.13  2.81±0.19  体长/头长  3.30±0.02  3.51±0.18  头长/吻长  2.54±0.04  2.49±0.19  头长/眼径  5.87±1.14  5.94±0.52  头长/眼间距  2.61±0.05  2.30±0.29  体长/尾柄长  7.18±0.55  8.17±0.98  体长/尾柄高  5.83±0.15  6.81±0.58  尾柄长/尾柄高  0.92±0.11  0.84±0.09

自上世纪70年代以来，对兴国红鲤开展了系统选育工作，它已成为一个优良的水产养殖品种，品种登记号：GS01001-1996。自2000年以来，也对瓯江彩鲤开展了选育工作，目前已选育至第5代，即将选育成为一个水产良种。为保护两个鱼类良种的育种成果与知识产权，为以后养殖生产提供一种有效的品种鉴定方法，发明人在对通过多年的研究，发现这两种鱼在线粒体COII基因和tRNA^Lys基因各存在一个特异性的单核苷酸差异位点(SNP)，可以用于它们的群体鉴定和品种区分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴别兴国红鲤和“全红”体色瓯江彩鲤的群体区分和品种鉴别方法。

本发明所要解决的技术问题通过如下技术方案实现：

一种鉴别兴国红鲤和“全红”体色瓯江彩鲤的分子遗传鉴别方法，包括下列步骤：

(1)根据外部形态取出待鉴定的红鲤；

(2)提取待鉴定的红鲤的基因组DNA；

(3)以提取的基因组DNA为模板，根据CO II基因和tRNA^Lys基因设计引物以进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，纯化和克隆，其中扩增片段包含COII基因的第408位和tRNA^Lys基因第16位核苷酸；

(4)测序扩增的目的DNA序列，进行序列比对；

(5)检测SNP位点，进行结果判定：

(a)检测CO II基因的第408位点(CO II-408)，若该位点为核苷酸G，则为兴国红鲤；若该位点为核苷酸A，则为“全红”体色瓯江彩鲤；或者

(b)检测tRNA^Lys基因第16位点(tRNA^Lys-16)来加以确证，若位点tRNA^Lys-16为核苷酸T，则为兴国红鲤，若为核苷酸C，则为“全红”体色瓯江彩鲤。

所述引物序列为COII-tRNA^Lys-F(5’-CAT CAC CTT GTC AAG GTG AAA-3’)和COII-tRNA^Lys-R(5’-CAT GGT CAG TCT CAG GAT TCA-3’)。还可以采用其它能进行PCR扩增的引物。

CO II基因和tRNA^Lys基因的SNP位点如下表2所示：

表2CO II基因和tRNA^Lys基因的SNP位点

  COII-408  tRNA^Lys-16  兴国红鲤  G  T  “全红”体色瓯江彩鲤  A  C

本发明方法是通过扩增红鲤线粒体DNA的CO II基因和tRNA^Lys基因序列，检测这两个基因序列的单核苷酸多态性位点(SNP)而实现。

本发明可有效、准确地进行鉴别兴国红鲤和“全红”体色瓯江彩鲤，从而为我国这两种红鲤的品种保护和遗传管理提供一种技术手段，具有极强的实用价值。

附图说明

图1是兴国红鲤的照片。

图2是“全红”体色瓯江彩鲤的照片。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体例，进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

通过本实施例对本发明方法进行验证。

(1)取兴国红鲤和“全红”体色瓯江彩鲤样本

选取兴国红鲤和“全红”体色瓯江彩鲤各30尾，有足够数量，因此获得的结果具有统计学意义，准确可靠。

(2)DNA提取

取每尾鱼的尾鳍组织约0.2cm²，装入1.5ml的离心管中，加入400μL STE缓冲液(30mmol/L Tris-HCl，pH8.0，200mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl)。混匀后加入浓度为10％的SDS 90μL和20mg/mL的蛋白酶K 10μL，55℃消化8～10h；加入等体积饱和酚于转轮上缓慢转动1h，10,000r/min离心8min，吸取上清液加入等体积的混合液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)；缓慢转动30min，以10,000r/min的速度离心8min，取上清液加入等体积的氯仿和异戊醇混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，缓慢转动5min，10,000r/min离心5min，取上清液后，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，再用70％的乙醇洗涤，干燥，加入300μL的TE液溶解备用。

(3)PCR扩增与产物克隆、测序

根据已有鲤线粒体基因组全序列，设计一对用于扩增CO II基因和tRNA^Lys基因的引物，引物序列为：CO II-tRNA^Lys-F(正向引物)：5′-CAT CAC CTT GTC AAGGTG AAA-3′和CO II-tRNA^Lys-R(反向引物)：5′-CAT GGT CAG TCT CAG GATTCA-3′。

以提取的DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体积为50μL，内含5μL PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCL，pH9.0，50mmol/L KCL，30mmol/LMgCL2，0.01％的明胶)，2μL dNTP混合液(每种dNTP 0.1mmol/L)，4μL的引物(0.2μmol/L)，2μL基因组DNA(50ng/μl)，2μL Taq酶(2IU)，35μL的蒸馏水。扩增反应条件为94℃预变性5min，接下来进行30个循环，每个循环包括94℃30s，54℃30s，72℃ 1min，30个循环后，72℃延伸5min。

扩增的目的序列产物以琼脂糖电泳检查，观察只有一条扩增产物片段。

纯化PCR扩增产物，连接插入载体pUC18，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选重组子进行内切酶酶切和PCR检验。然后选取重组子于3730型Bigdye-Terminator全自动测序仪上进行测序。

(4)测序扩增的目的DNA序列，进行序列比对

用BioEdit软件对测序结果进行重排和同源比较，与GenBank中的鲤线粒体DNA全序列(序列号：NC_001606)对照，确定COII基因的启始位置和启始密码子ATG。在COII基因最后一个氨基酸的密码子GCC+T不完全终止子后(GCCT)，紧接着的是tRNA^Lys基因的开始位点CGC。两种红鲤的COII基因和tRNA^Lys基因序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

(5)筛选核苷酸变异位点

查找上述单核苷酸变异位点，根据位点差异鉴定这两种红鲤。

首先检测CO II基因的第408位点(CO II-408)，发现30尾兴国红鲤的该位点都为核苷酸G，30尾“全红”体色瓯江彩鲤的该位点都为核苷酸A。

进一步检测tRNA^Lys基因第16位点(tRNA^Lys-16)来加以确证，发现30尾兴国红鲤的该位点为核苷酸T，30尾“全红”体色瓯江彩鲤的该位点都为核苷酸C。

通过以上实施例表明，本发明方法对于鉴别兴国红鲤和“全红”体色瓯江彩鲤是准确可行的。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110>上海海洋大学

<120>兴国红鲤与“全红”体色瓯江彩鲤的分子遗传鉴别技术

<130>TXPI091938

<160>2

<210>1

<211>768

<212>DNA

<213>兴国红鲤

<400>1

ATGGCACACC CAACGCAACT AGGTTTCCAA GACGCGGCCA TACCCGTTAT AGAAGAACTT     60

CTTCACTTCC ACGACCACGC ATTAATAATT GTGCTCCTAA TTAGCACTTT AGTGTTATAT    120

ATTATTACTG CAATGGTATC AACCAAACTT ACTAATAAAT ATATTCTAGA CTCCCAAGAA    180

ATCGAAATTG TATGAACCAT TCTACCAGCC GTCATTTTAG TACTAATCGC CCTGCCCTCC    240

CTACGCATCC TGTACCTTAT AGACGAAATT AACGACCCTC ACCTGACAAT TAAAGCAATA    300

GGACACCAAT GATACTGAAG TTACGAGTAT ACAGACTATG AAAATCTAGG ATTCGACTCC    360

TATATAGTAC CAACCCAAGA CCTTGCCCCC GGACAATTCC GACTTCTGGA AACAGACCAC    420

CGAATAGTTG TTCCAATAGA ATCCCCAGTC CGTGTCCTAG TATCTGCTGA AGACGTGCTA    480

CATTCTTGAG CTGTTCCATC CCTTGGCGTA AAAATGGACG CAGTCCCAGG ACGACTAAAT    540

CAAGCCGCCT TTATTGCCTC ACGCCCAGGG GTGTTTTACG GACAATGCTC TGAAATTTGT    600

GGAGCTAATC ACAGCTTTAT ACCAATTGTA GTTGAAGCAG TACCTCTCGA ACACTTCGAA    660

AACTGATCCT CATTAATACT AGAAGACGCC TCGCTAGGAA GCTAAATATT GGACAAAGCG    720

TTGGCCTTTT AAGCCAAAGA TTGGTGATTC CCGACCACCT CTAGTGAA                 768

<210>2

<211>768

<212>DNA

<213>“全红”体色瓯江彩鲤

<400>2

ATGGCACACC CAACGCAACT AGGTTTCCAA GACGCGGCCA TACCCGTTAT AGAAGAACTT     60

CTTCACTTCC ACGACCACGC ATTAATAATT GTGCTCCTAA TTAGCACTTT AGTGTTATAT    120

ATTATTACTG CAATGGTATC AACCAAACTT ACTAATAAAT ATATTCTAGA CTCCCAAGAA    180

ATCGAAATTG TATGAACCAT TCTACCAGCC GTCATTTTAG TACTAATCGC CCTGCCCTCC    240

CTACGCATCC TGTACCTTAT AGACGAAATT AACGACCCTC ACCTGACAAT TAAAGCAATA    300

GGACACCAAT GATACTGAAG TTACGAGTAT ACAGACTATG AAAATCTAGG ATTCGACTCC    360

TATATAGTAC CAACCCAAGA CCTTGCCCCC GGACAATTCC GACTTCTAGA AACAGACCAC    420

CGAATAGTTG TTCCAATAGA ATCCCCAGTC CGTGTCCTAG TATCTGCTGA AGACGTGCTA    480

CATTCTTGAG CTGTTCCATC CCTTGGCGTA AAAATGGACG CAGTCCCAGG ACGACTAAAT    540

CAAGCCGCCT TTATTGCCTC ACGCCCAGGG GTGTTTTACG GACAATGCTC TGAAATTTGT    600

GGAGCTAATC ACAGCTTTAT ACCAATTGTA GTTGAAGCAG TACCTCTCGA ACACTTCGAA    660

AACTGATCCT CATTAATACT AGAAGACGCC TCGCTAGGAA GCTAAACATT GGACAAAGCG    720

TTGGCCTTTT AAGCCAAAGA TTGGTGATTC CCGACCACCT CTAGTGAA                 768