一种携带外源基因在包装细胞中高效生产的重组病毒载体、其构建方法及其用途

摘要

本发明提供一种携带外源基因在包装细胞中高效生产的重组病毒载体、其构建方法及其用途。其特征在于：在该病毒可操作地连接的外源基因的3’非翻译区中插入有至少一个下述微小RNA的靶位点核苷酸序列：所述微小RNA在病毒包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达。从而实现选择性地抑制外源基因在病毒包装细胞中的表达，避免外源基因对病毒包装与生产的负面影响，提高病毒的生产效率和滴度，同时在靶细胞中不降低外源基因的表达水平，不影响治疗效果或研究外源基因的功能。

说明书

发明领域

本发明一般地涉及重组病毒载体。更具体地说，本发明涉及一类携带外源基因在包装细胞中高效生产的的重组病毒载体、其构建方法及其用途。

背景技术

病毒对特定细胞感染率高，可高效地将外源基因转导到细胞内，并长时间表达，常作为基因转移的工具介导外源基因在靶细胞中的超量表达，通过功能获得(gain-of-function)的方式研究基因的功能。另一方面，病毒也是基因治疗最常用的载体，截止2008年9月，世界上已有1472个基因治疗方案用于临床试验，其中共1006项临床试验采用不同种类的病毒作为载体，占总数的68.3％(参见数据库http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/)。

重组病毒的包装与扩增需要合适的包装细胞系，如293细胞，即含有5型腺病毒E1区的人胚肾细胞，常用于重组腺病毒、腺相关病毒的包装与生产；293T及293FT细胞(293T的快速生长变种)，由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，常用于重组慢病毒的包装与生产；GP293细胞，由293细胞派生，同时表达Gag-pol蛋白，常用于逆转录病毒的包装与生产。携带外源基因的重组病毒可在包装细胞中组装或复制增殖，促使重组病毒基因组中包含的外源基因大量扩增与表达。然而，一方面过量表达的外源基因对细胞具有一定的毒性，尤其是自杀基因，细胞凋亡基因，细胞周期相关基因等，导致病毒包装细胞提早死亡，缩短了重组病毒各功能基因在包装细胞中转录与翻译的时机，并导致部分病毒颗粒来不及组装；另一方面，外源基因的大量转录与翻译也会占用细胞过多的RNA转录、蛋白质翻译相关的酶类与资源，从而间接抑制了重组病毒各功能基因的转录与翻译。两个方面的影响降低了重组病毒在包装细胞中的生产效率，无法获得足够的病毒滴度。

因此，为使携带外源基因的重组病毒获得较高的病毒滴度，非常需要能在包装细胞中进行高效生产重组病毒的方法。

微小RNA(microRNA)是生物体内源的小片段RNA，通过与靶基因成熟mRNA的3’非翻译区中的靶位点核苷酸序列结合，抑制靶基因蛋白的翻译。微小RNA具有高度的组织特异性和时序性，在不同类型的细胞中表达水平差异大，因而可借助微小RNA的调控机制以及表达组织特异性，利用病毒包装细胞高水平表达而靶细胞中不表达或低表达的微小RNA调控外源基因的表达，使外源基因在包装细胞中不表达，提高病毒生产效率和滴度，而在靶细胞中不降低外源基因的表达水平，保持原有的治疗效果或通过功能获得的方式研究外源基因功能。

发明概述

本发明提供了一种重组病毒载体，其特征在于该病毒可操作地连接的外源基因的3’非翻译区中插入至少一个下述微小RNA(microRNA)的靶位点核苷酸序列，所述微小RNA在病毒包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达。

在一个实施方案中，所述病毒选自腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-associated virus)、反转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(Poxvirus)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)、艾巴氏病毒(Epstein-Barr virus)、人乳突状瘤病毒(Human Papillomavirus)、杆状病毒(Baculoviruses)、黄病毒(Flavivirus)、麻疹病毒(Measlesvirus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、Semliki森林病毒(Semliki forest virus)、仙台病毒(Sendai virus)、猿猴病毒40(Simian virus 40)和α-病毒(Alphaviruses)中的至少一种。所述病毒优选选自腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒、慢病毒、痘苗病毒，更优选所述病毒选自腺病毒。

在一个实施方案中，所述病毒可操作地连接的外源基因选自细胞凋亡基因、前药转换酶基因、细胞周期相关基因、细胞因子基因、信号转导基因、转录因子基因、癌基因、抑癌基因、血管抑制基因、抗体基因(包括全长抗体、嵌合抗体、Fab片段、Fv片段)、疫苗基因中的至少一种。优选所述基因选自细胞凋亡基因、前药转换酶基因、抑癌基因、血管抑制基因、抗体基因、疫苗基因，更优选所述基因选自细胞凋亡基因与抗体基因。

在一个实施方案中，所述病毒靶细胞可以选自心肌细胞、骨骼肌细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、肝细胞、淋巴细胞、神经细胞、脂肪细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、肿瘤细胞中的至少一种。所述靶细胞优选选自肝细胞、肿瘤细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述微小RNA靶位点序列由1个或多个以上相同的微小RNA靶位点序列以串联重复的方式构成。其中，微小RNA靶位点序列的单元个数为100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或者1个。优选1-3个，1-5个，1-7个，1-9个，1-11个，1-15个，1-20个。

在一个实施方案中，所述微小RNA靶位点序列由1个或多个以上不同的微小RNA靶位点序列以连续串联或间隔串联的方式构成。其中，微小RNA靶位点序列的单元个数分别为100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或者1个。优选1-3个，1-5个，1-7个，1-9个，1-11个，1-15个，1-20个。

在一个实施方案中，所述病毒包装细胞选自293，293T，293FT，293E，293ET，293KB，293Eco，GP293和FIP293中的至少一种。所述包装细胞优选选自293，293FT。

在一个实施方案中，所述微小RNA靶位点序列选自miR-15a，miR-16，miR-17，miR-18a，miR-19b和miR-196a中的至少一种。所述微小RNA靶位点序列优选选自miR-15a，miR-18a，miR-16。

在本发明的一个实施方案中，所选用的病毒为人类腺病毒载体，其包括A、B、C、D、E及F6个亚属。

在本发明的一个实施方案中，所选用的腺病毒载体来源于人类C亚属5型的腺病毒。

在一个实施方案中，本发明还涉及重组病毒载体的构建方法，其特征在于：在所述病毒载体可操作地连接的外源基因的3’非翻译区中插入了至少一个下述微小RNA的靶位点核苷酸序列，所述微小RNA在病毒包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达。

在一个实施方案中，所述的重组病毒用于使重组病毒可操作地连接的外源基因不在病毒包装细胞中表达，而在靶细胞中正常表达。在一个实施方案中，所述重组病毒用于抑制肿瘤细胞生长。

附图简述

图1：pPE3-F11的载体图谱。主要由pBHGlox(delta)E1，3Cre改造而成，E1区缺失，可与包含腺病毒左臂的质粒胞内同源重组，获得有感染能力的腺病毒；包含来源于pBHGE3的E3区，其5型纤毛蛋白基因被5/11 fiber替换。

图2：表示病毒载体Ad11-RTX与Ad11-RTX-15T在HEK293细胞中的复制能力比较结果。

图3：表示Rituxan在HEK293与L02细胞中的表达量分析结果。

图4：表示对照组与治疗组小鼠不同时间段移植瘤体积统计分析结果。

发明详述

如上文所述，本发明涉及一种重组病毒载体，其特征在于该病毒可操作地连接的外源基因的3’非翻译区中至少包含一个病毒包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达的微小RNA(microRNA)的靶位点核苷酸序列。

微小RNA(microRNA，miRNA)是生物体内源，长度约为19-25个核苷酸的非编码小RNA，它通过与靶基因mRNA上的靶序列互补配对结合，在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制(Lai，2002)。据估计，在人类基因组中存在约1000个miRNAs，大多数微小RNA位于基因间隔区或蛋白编码基因的内含子区，少数位于外显子区或者mRNA非翻译区。大部分微小RNA单独存在，部分微小RNA聚集在一起，成为一个微小RNA基因簇。生物信息学数据显示，人类约1/3的蛋白编码基因受微小RNA的调控，每个微小RNA可以调节100-200个靶基因，而多个微小RNA可调节同一个基因，组成了一个复杂的调控网络(Berezikov et al.，2006)。

微小RNA在物种进化中相当保守，只在特定的组织和发育阶段表达，具有高度的组织特异性和时序性。如miR-1和miR-133在心脏和骨骼肌组织中特异表达，miR-1可调控心肌细胞在分化与增殖之间的平衡，而miR-133可调控肌肉细胞的分化，其表达下降可以促进斑马鱼鱼鳍的再生；miR-122在人和小鼠的肝脏中高量特异表达，其含量可占肝脏所有miRNA的70％；miR-126在心、肺内皮细胞中特异表达，可抑制淋巴细胞与内皮细胞的相互作用，防止血管炎症的发生；miR-142、miR-181、miR-223在造血组织中特异表达，其中miR-181在小鼠胸腺细胞发育的CD4⁺CD8⁺双阳性期特异性表达，调控B细胞的成熟，miR-223在骨髓中表达高，可调控粒细胞的成熟；miR-143在脂肪组织中特异表达，能调控脂肪细胞的分化，敲除miR-143将导致甘油三酯的累积；miR-371-373簇(包括miR-271，miR-272，miR-273)在人的胚胎中特异表达，而mir-290-295簇(包括miR-290，miR-291，miR-292，miR-293，miR-294，miR-295)则在小鼠的胚胎中特异表达，它们在胚胎干细胞的分化过程中起重要作用；miR-375在鼠胰岛细胞中特异表达，调控胰岛细胞发育和胰岛素分泌，另外，miR-375还在斑马鱼脑下垂体高效表达，调节其他激素和神经内分泌产物的分泌(参见综述Landgraf et al.，2007)。

在293系列细胞中表达水平较高的微小RNA有：miR-15a，miR-16，miR-17，miR-18a，miR-19b，miR-196a(参见微小RNA数据库http://www.microrna.org/microrna/get ExprForTissues.do？tissue＝hsa_Kidney-embryo-HEK293+)。其中miR-15a与miR-16紧密相邻，位于人基因组13q14区，属于同一微小RNA簇；miR-17、miR-18a与miR-19b紧密相邻，位于人基因组13q31区，属于miR-17-92簇；miR-196a在人基因组中有两个拷贝，其中miR-196a-1位于第17染色体，而miR-196a-2位于第12染色体。除在293系列细胞中较高水平表达外，miR-15a与miR-16在多种T细胞、B细胞中也有较高的表达量，而在65％的B细胞慢性淋巴型白血病(CLL)病人，50％的套细胞淋巴瘤病人，16-40％的骨髓瘤病人，60％的前列腺癌病人中均有13q14区的缺失，导致miR-15a与miR-16基因的丧失(Calin et al.，2005)；miR-17、miR-18a与miR-19b所在的基因组13q31区在散布的B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等肿瘤中常发生位点的扩增，导致其表达异常上调(He et al.，2005)；miR-196a在乳腺癌细胞系MCF7中表达水平较高。以上微小RNA在心、肺、肝、脾、卵巢、子宫、前列腺、甲状腺等器官组织中表达水平水平较低或不表达。

在本发明应用包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达的微小RNA的靶位点核苷酸序列插入重组病毒基因组中包含的外源基因的3’非翻译区，从而使外源基因不能在包装细胞内合成蛋白，并不影响重组病毒在包装细胞中的正常包装与增殖，从而提高重组病毒的生产效率，提高病毒滴度。而在靶细胞中不降低外源基因的表达水平，保持原有的治疗效果或通过功能获得研究外源基因功能。

“重组病毒”包括腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-associated virus)、反转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、痘苗病毒(Vacciniavirus)、牛痘病毒(Poxvirus)、单纯疱疹病毒(Herpes simplexvirus)、艾巴氏病毒(Epstein-Barrvirus)、人乳突状瘤病毒(Human Papillomavirus)、杆状病毒(Baculoviruses)、黄病毒(Flavivirus)、麻疹病毒(Measles virus)、新城疫病毒(Neweastle disease virus)、Semliki森林病毒(Semlikiforest virus)、仙台病毒(Sendai virus)、猿猴病毒40(Simianvirus 40)和α-病毒(Alphaviruses)。“包装细胞”是指用于病毒重组、扩增的细胞系，它可以是从天然细胞中培育出的可稳定传代的细胞系，也可以是经改造的其基因组中包含病毒包装必需基因的细胞系。如293细胞可用于腺病毒的重组与扩增。

“靶细胞”是指重组病毒的目标感染细胞，既可以是功能缺损或紊乱，需重组病毒携带外源基因进行校正的细胞，也可以是功能正常，适宜于重组病毒感染后表达外源基因，研究外源基因功能的细胞。

“包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达的微小RNA”是指在包装细胞与靶细胞之间表达水平差异大的微小RNA，即在包装细胞表达水平高，而在靶细胞表达水平低或无。如miR-15a，它在293细胞中表达水平高，而在正常人肝细胞系L02表达水平极低。通常，所述的“低表达”是指与包装细胞相比，靶细胞中微小RNA表达量不足包装细胞的1/3。

“微小RNA的靶位点核苷酸序列”是指微小RNA可与之结合从而发挥调控作用的DNA序列。它既可以是与成熟微小RNA完全反向互补配对的DNA序列，也可以是已知的微小RNA靶基因中与微小RNA结合，与微小RNA不完全反向互补配对的DNA序列。

“外源基因”是指重组病毒基因组中包含的但不属于野生型病毒基因组的蛋白编码基因，它可以是人类或其它物种的天然蛋白编码基因，也可以是人工合成的蛋白编码基因。

“外源基因的3’非翻译区”是指外源基因成熟mRNA中编码序列下游不翻译的区域，它位于外源基因终止密码子和polyA尾之间。

“相同微小RNA靶位点序列的串联重复”是指2个以上相同微小RNA靶位点序列不间隔的首尾相连，或者2个以上相同微小RNA靶位点序列首尾相连但中间相隔若干个核苷酸序列。

“不同微小RNA靶位点序列连续串联”是指一种微小RNA靶位点序列串联重复后连接另一种微小RNA靶位点序列的串联重复。不同微小RNA靶位点序列间隔串联是指一种微小RNA靶位点序列后连接另一种微小RNA靶位点序列，并以此为单元重复2次以上。

在本发明的一个实施方案中，包装细胞选自人肾胚HEK293细胞系，及从HEK293中衍生培育出的其它细胞系，如293T，293FT，293E，293ET，293KB，293Eco，GP293，FIP293等。

在本发明的一个实施方案中，所述微小RNA靶位点核苷酸序列可以选自293系列细胞中高水平表达的miR-15a，miR-16，miR-17，miR-18a，miR-19b，miR-196a中的至少一种。

在本发明中中还例示性地公开了采用本发明的设计策略的重组腺病毒载体、其构建方法以及所述重组腺病毒的实际用途。例如通过在携带全长美罗华Rituxan全长抗体基因的的3’非翻译区插入5个拷贝miR-15a靶位点序列的DNA片段，使该含有外源基因美罗华的重组腺病毒在包装细胞293中获得高滴度，而且通过该方法扩增的病毒感染靶细胞-肝细胞后，可以有效地在肝细胞中表达有活性的Rituxan抗体，并使之分泌到细胞外，最终作用于CD20阳性的肿瘤细胞，导致肿瘤细胞死亡。

在本发明中还例示性地公开了采用本发明的设计策略的重组慢病毒载体、其构建方法以及所述重组慢病毒的实际用途。例如通过在重组慢病毒可操作地连接的人P53基因的3’非翻译区插入4个拷贝miR-15a靶位点序列的DNA片段，使之在包装细胞293FT细胞中获得了高滴度的重组慢病毒。

与现有重组病毒载体相比，本发明具有如下有益效果：

本发明在重组病毒载体可操作地连接的外源基因的3’非翻译区中插入至少一个包装细胞中高水平表达而靶细胞中不表达或低表达的微小RNA的靶位点核苷酸序列，使外源基因不能在包装系列细胞中随着病毒的复制而大量表达，避免了外源基因过量表达造成的细胞毒性及对细胞转录、翻译相关酶类和资源的竞争，提高了重组病毒的生产效率和病毒滴度。而在靶细胞中不降低外源基因的表达水平，保持原有的治疗效果或通过gain-of-function研究外源基因功能。

本发明中的实施例仅用于例示性说明本发明的具体实施方案，其不限制本申请的保护范围，任何本领域技术人员可以根据现有技术进行的等价的改良都包含在本申请的保护范围之内。

具体实施方式

一.实施例1：携带美罗华(Rituxan)基因并可在293细胞中高效生产的重组腺病毒载体的构建

1.携带美罗华(Rituxan)基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建

pDC315载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，含有5型腺病毒左臂E1区1417至2344bp序列片段，及反向末端重复序列(ITR)，可以与包含腺病毒右臂的骨架质粒发生同源重组，获得复制缺陷型腺病毒。pDC315载体经酶切改造，替换mCMV启动子，连接EF1α(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha)启动子及内含子、新的多克隆位点，保留原有的SV40 PolyA信号序列，命名该载体为pDC338。应用多聚酶链反应(PCR)技术分别扩增美罗华(Rituxan)基因轻链、重链基因序列，并用核糖体进入位点序列(IRES)连接轻重链基因，命名为pDC338-RTX。

引物1：CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGG(SEQ ID NO：1)

引物2：TGCGTCGACTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAA(SEQ ID NO：2)

引物3：CGCGGATCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTA(SEQ ID NO：3)

引物4：CCCGCTAGCTTACTATTTACCCGGAGACAGGGA(SEQ ID NO：4)

应用引物3和引物4扩增，获得720bp的轻链基因，首尾分别加入EcoRI和SalI酶切位点，应用引物5和引物6扩增，获得1431bp的重链基因，首尾分别加入BamHI和NheI酶切位点。EF1α启动子至SV40 PolyA信号之间序列的测序结果(5’-3’)如下：

TCTAGAGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAG

TTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTG

GGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATA

TAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG

GTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGT

GCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTG

GAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGA

GTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGC

CTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGA

CGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATT

TCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGC

GAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCC

GGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGG

CTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGC

AGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACAC

AAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGG

GCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTG

GGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTA

GGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCT

TGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTC

GTGAGGAATTAGCTTGGTACTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGGT

AAGCTCGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCT

CCCAGATACCACCGGACAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTC

CAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCACTGG

TTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGC

TTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACTTCTTACTCTCTCACCA

TCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAAC

CCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATC

TGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGT

GCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCC

CTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTA

CAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACG

CCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGA

GAGTGTTGATAAGTCGACCCGGCGGGTTTCTGACATCCGGCGGGTTTCTGACATCCGGC

GGGTTTCTGACATCCGGCGGGTTTCTGACATCCGGCGGGTCGATCGTTCTGACATCCGG

CGGGTTTCTGACATCCGGCGGGTTTCTGACATCCGGCGGGTTTCTGACATCCGGCGGGT

TTCTGACATCCGGCGGGTAAGCTTGGATCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTT

CCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCAGGTACAACTGCAGCAGCCTGGGGCTG

AGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTT

ACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTGG

AGCTATTTATCCCGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCA

CATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCT

GAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACTACGGCGGTGACTGGTACTT

CAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCAT

CGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGC

TGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT

GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA

GCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG

AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA

AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCC

TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC

GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG

CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC

GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG

TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAA

AGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCA

AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG

GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA

CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGC

AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAG

AAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAAGCTAGCACTAGTCTCGACTTCGAGCA

ACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACA

AATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATC

TTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAAGATCC(SEQ ID NO：5)

2.携带美罗华(Rituxan)基因并受miR-15a调控的复制缺陷型腺病毒载体的构建

合成包含5个拷贝miR-15a靶位点序列的DNA片段(5×miR-15T)，并在5’-末端与3’-末端分别加入NheI和SpeI的酶切位点，该DNA片段由上海生工生物工程技术有限公司进行全长基因合成。经测序正确，命名为pUC57-miR-15T，其核苷酸序列如下(5’-3’)：

GCTAGCCACAAACCATTATGTGCTGCTAGATCCACAAACCATTATGTGCTGCTAACGAT

CACAAACCATTATGTGCTGCTACTCCACAAACCATTATGTGCTGCTACGATCGCACAAA

CCATTATGTGCTGCTAACTAGT(SEQ ID NO：6)

利用NheI和SpeI双酶切pUC57-miR-15T质粒，回收146bp的5×miR-15T片段，将其插入pDC338-RTX载体的美罗华基因的3’非翻译区(重链基因后，SV40 Poly A加尾信号前)，命名为pDC338-RTX-15T。

3.携带美罗华(Rituxan)基因并受miR-15a调控的复制缺陷型腺病毒的重组

HEK293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pDC338-RTX和pDC338-RTX-15T分别与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3-F11通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。pPE3-F11由pBHGlox(delta)E1，3Cre改造而成，E1区缺失，可与包含腺病毒左臂的穿梭质粒胞内同源重组，获得有感染能力的腺病毒，含有来源于pBHGE3的E3区，其5型纤毛蛋白基因被5/11fiber替换，具体载体图谱见附图1。pBHGlox(delta)E1，3Cre与pBHGE3购于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)。共转染后9-14天出现腺病毒空斑，经过三次腺病毒空斑纯化，即得携带Rituxan全长抗体基因的重组腺病毒和携带Rituxan全长抗体基因并受miR-15a调控的重组腺病毒，分别命名为Ad11-RTX和Ad11-RTX-15T(CCTCC-V200813，2009年1月9日，中国典型培养物保藏中心)。

腺病毒在HEK293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒。

4.携带Rituxan基因的重组腺病毒和携带Rituxan基因并受miR-15a调控的重组腺病毒在HEK293细胞中的复制能力比较

将HEK293细胞株按5×10⁵细胞/孔铺在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO₂培养，第二天换无血清培养基1ml，然后，分别加入重组腺病毒Ad11-RTX、Ad11-RTX-15T，其腺病毒量为MOI＝5，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，并加入5％胎牛血清的培养液培养，分别在0小时及48小时收集，冻融三次，用TCID50法来检测腺病毒滴度(方法参见美国Qbiogene公司的AdEasyTM操作手册)，结果发现在HEK293中的腺病毒复制能力Ad11-RTX-15T是Ad11-RTX的100倍(见图2)。表明miR-15aT靶位点核苷酸序列的插入可显著提高重组腺病毒的生产效率。

5.携带Rituxan基因的重组腺病毒和携带Rituxan基因并受miR-15a调控的重组腺病毒在HEK293细胞中表达Rituxan的能力比较

将HEK293细胞按1×10⁵细胞/孔铺在24-孔板中，在37℃孵箱5％CO₂培养。第二天分别加入重组腺病毒Ad11-RTX、Ad11-RTX-15T，其腺病毒量为MOI＝5，两小时后洗去病毒。分别在3天与7天后收集细胞，应用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)检测上清中Rituxan抗体的表达水平，结果发现在第3天，Ad11-RTX与Ad11-RTX-15T感染HEK293细胞后抗体的浓度分别为2.19±0.2μg/ml，0.31±0.1μg/ml。在第7天，Ad11-RTX与Ad11-RTX-15T感染后抗体的浓度分别为3.43±0.3μg/ml，0.39±0.2μg/ml。可见在各个时间段，Ad11-RTX与Ad11-RTX-15T感染HEK293细胞后Rituxan蛋白的表达水平Ad11-RTX-15T均远低于Ad11-RTX，分别降低了7.0倍和8.8倍(见图3)。表明miR-15a靶位点核苷酸序列的插入可使外源基因在病毒包装细胞293中的表达变化显著下降。

6.携带Rituxan基因的重组腺病毒和携带Rituxan基因并受miR-15a调控的重组腺病毒在正常肝细胞中表达抗体效率比较

人正常肝细胞株L02 miR-15a表达阴性，将其按1×10⁵细胞/孔铺在24-孔板中，在37℃孵箱5％CO₂培养。第二天分别加入重组腺病毒Ad11-RTX、Ad11-RTX-15T，其腺病毒量为MOI＝5，两小时后洗去病毒。分别在第3天和第7天收集细胞，应用酶联免疫吸附剂测定(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)检测抗体的表达水平，结果发现在第3天，Ad11-RTX与Ad11-RTX-15T感染L02细胞后抗体的浓度分别为1.55±0.1μg/ml，1.67±0.2μg/ml。在第7天，Ad11-RTX与Ad11-RTX-15T感染后抗体的浓度分别为3.21±0.4μg/ml，3.35±0.2μg/ml。可见在各个时间段，Ad11-RTX与Ad11-RTX-15T感染肝细胞L02后Rituxan蛋白的表达水平相似(见图3)。表明miR-15a靶位点核苷酸序列的插入未引起外源基因在靶细胞中的表达变化。

7.携带Rituxan基因并受miR-15a调控的重组腺病毒在裸鼠体内治疗移植肿瘤

将4-5周龄的SCID小鼠皮下接种CD20阳性的Raji细胞株1×10⁷，两周后，一次给予荷瘤小鼠尾静脉注射携带Rituxan基因的重组腺病毒Ad11-RTX，以及携带Rituxan基因并受miR-15a调控的重组腺病毒Ad11-RTX-15T，剂量各为5×10⁸pfu，统计肿瘤体积的随时间的变化情况。结果发现，其未治疗组3周后肿瘤体积增加3倍以上，而治疗组可显著缩小肿瘤的大小，且重组腺病毒Ad11-RTX与Ad11-RTX-15T抑制肿瘤生长的作用无显著差异(见图4)。表明在动物体内miR-15a靶位点核苷酸序列的插入未降低治疗效果。

二.实施例2：携带人P53基因并可在293FT细胞中高效生产的重组慢病毒的构建

1.包含人P53基因的慢病毒包装用表达质粒的构建

pKCDNA-CMV--EF1α-GFP质粒购于康成生物公司，它含有EF1α启动子控制下的GFP基因的表达盒，外源基因可以在CMV启动子的控制下表达。提取人总RNA，应用逆转录酶合成单链cDNA，并应用多聚酶链反应(PCR)技术从单链cDNA文库中扩增出人P53基因的开放阅读框。命名为pKCDNA-P53。

引物5：CCGTCTAGAACCATGGAGGAGCCGCAGTCAGA(SEQ ID NO：7)

引物6：TGCGAATTCTCAGTCTGAGTCAGGCCC(SEQ ID NO：8)

引物5与引物6扩增获得1197bp的P53基因的编码区序列，首尾分别加入XbaI和NheI酶切位点。其测序结果(5’-3’)见下：

TCTAGAACCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGA

AACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGT

CCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAA

GACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGC

ACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTT

CTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCAT

TCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTG

CCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCA

CCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGG

CGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCT

TATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGAC

ATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCAC

TACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCAC

CATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGC

GTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAA

GGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACAC

CAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGA

TCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAG

GATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTC

CAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTG

ACTCAGACTGAGCTAGC(SEQ ID NO：9)

2.包含人P53基因并受miR-15a调控的慢病毒包装用表达质粒的构建

合成包含4个拷贝miR-15a靶位点序列的DNA片段(4×miR-15T)，并在5’-末端与3’-末端分别加入NheI和EcoRI的酶切位点，该DNA片段由上海生工生物工程技术有限公司进行全长基因合成，并经测序验证正确。将4×miR-15T片段插入pKCDNA-P53载体的人P53基因的3’非翻译区(终止密码子后，SV40 Poly A加尾信号前)，命名为pKCDNA-P53-15T。4×miR-15T片段的核苷酸序列如下(5’-3’)：GCTAGCCACAAACCATTATGTGCTGCTAGATCCACAAACCATTATGTGCTGCTAACGATCACAAACCATTATGTGCTGCTACTCCACAAACCATTATGTGCTGCTAGAATTC(SEQID NO：10)

3.包含人P53基因并受miR-15a调控的慢病毒的包装重组

将293FT细胞按7.5×10⁵铺在10cm dish上，5％CO2培养箱过夜培养。第二天将10％DMEM培养基换成2％的DMEM培养基，4小时后将20μg表达质粒(pKCDNA-P53与pKCDNA-P53-15T)，10μg包装质粒pCMVdelta8.91与5μg包装质粒pMD.G混合，加无菌水至250μl，震荡混匀。向上述混合液中依次加入250μl的0.5MCaCl₂，而后向上述混合液中逐滴加入500μl的2×HBS，边加边震荡。静置30分钟，将上述混合液均匀加入细胞培养基中。转染后12小时，倒掉2％DMEM培养基，PBS清洗两遍，换回10％DMEM培养基，分别在36小时，60小时后收取细胞培养基。将收集含有病毒颗粒的细胞培养基以4000g离心10min，收集上清液，并用0.45μm滤器过滤，滤过的液体置于40mL超速离心管中，4℃，25000r/min离心20分钟，使用500ul冰PBS液重悬病毒沉淀。包装获得的携带人P53基因的慢病毒，以及携带人P53基因并受miR-15a调控的慢病毒分别命名为Le-P53和Le-P53-15T。

4.包含人P53基因并受miR-15a调控的慢病毒的滴度测定

在六孔板中按2x10⁵/孔铺Hela细胞，使用10％DMEM培养基培养，置于5％CO2培养箱过夜。将待测病毒(Le-P53和Le-P53-15T)梯度稀释为10^-2-10^-6倍，将每个浓度的病毒液稀释于2％DMEM培养基，终体积为1ml。稀释完成后，将六孔板中原先的培养基倒掉，换成加入病毒稀释液的培养基，置于5％CO₂培养箱过夜培养。第二天将含有病毒的2％DMEM培养基换成10％DMEM培养基，感染后第四到五天，用PBS清洗细胞，消化后重悬，经流式细胞仪检测荧光表达情况，计算公式：病毒滴度(TU/mL)＝细胞数量x荧光阳性细胞的百分比/病毒液体积(ml)。流式细胞仪测定表明Le-P53-15T的病毒滴度为8.75x10⁹TU/mL，而Le-P53的病毒滴度为1.37x10⁸TU/mL，Le-P53-15T的病毒滴度是Le-P53的64倍。表明miR-15a靶位点核苷酸序列的插入可显著提供重组慢病毒在包装细胞293FT的病毒滴度。

5.包含人P53基因并受miR-15a调控的慢病毒在肿瘤细胞中表达P53的水平测定

肝癌细胞株Hep3B，肺癌细胞株A549，乳腺癌细胞株MCF7购于ATCC，miR-15a表达均为阴性。将上述肿瘤细胞按5×10⁴细胞/孔铺在24-孔板中，在37℃孵箱5％CO₂培养过夜。第二天分别加入重组慢病毒Le-P53、Le-P53-15T，MOI值为10。分别在第1、2、3天，提取总RNA，应用引物7与引物8，通过实时定量RT-PCR的方法检测P53的表达水平。结果发现在各个时间段，Le-P53与Le-P53-15T表达P53的水平无显著差异。表明miR-15a靶位点核苷酸序列的插入未引起靶细胞中外源P53的表达量变化。

引物7：GCGCACAGAGGAAGAGAATC(SEQ ID NO：11)

引物8：CAAGGCCTCATTCAGCTCTC(SEQ ID NO：12)

通过上述试验证明，本发明的重组病毒在包装细胞中具有更高的增殖效率或生产效率，而在靶细胞中不影响外源基因的表达水平。

参考文献：

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3.Calin GA，Ferracin M，Cimmino A，Di Leva G，Shimizu M，Wojcik SE，Iorio MV，Visone R，Sever NI，Fabbri M，Iuliano R，Palumbo T，Pichiorri F，Roldo C，Garzon R，Sevignani C，RassentiL，Alder H，Volinia S，Liu CG，Kipps TJ，Negrini M，Croce CM.A MicroRNA signature associated with prognosis and progressionin chronic lymphocytic leukemia.N Engl J Med.2005；353(17)：1793-801

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序列表

<110>第二军医大学东方肝胆外科医院

<120>一种携带外源基因在包装细胞中高效生产的重组病毒载体、其构建方法及其

     用途

<130>IDC080120

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>54

<212>DNA

<213>引物1

<400>1

ccggaattca ccatggaagc cccagctcag cttctcttcc tcctgctact ctgg    54

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>引物2

<400>2

tgcgtcgact tatcaacact ctcccctgtt gaa                           33

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>引物3

<400>3

cgcggatcca ccatggagtt ttggctgagc tgggttttcc ttgttgctat ttta    54

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>引物4

<400>4

cccgctagct tactat ttac ccggagacag gga                                 33

<210>5

<211>3691

<212>DNA

<213>启动子+轻链+IRES+重链+SV40 polyA信号序列

<400>5

tctagagctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt    1

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg    61

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa    121

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa    181

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt    241

gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg    301

ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg    361

cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg    421

ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt    481

tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg    541

gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc    601

tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg    661

tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg    721

caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat    781

ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct    841

ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc    901

tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg    961

cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga    1021

tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc    1081

agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtgaggaatt agcttggtac    1141

taatacgact cactataggg agacccaagc tggctaggta agctcgaatt caccatggaa    1201

gccccagctc agcttctctt cctcctgcta ctctggctcc cagataccac cggacaaatt    1261

gttctctccc agtctccagc aatcctgtct gcatctccag gggagaaggt cacaatgact    1321

tgcagggcca gctcaagtgt aagttacatc cactggttcc agcagaagcc aggatcctcc    1381

cccaaaccct ggatttatgc cacatccaac ctggcttctg gagtccctgt tcgcttcagt    1441

ggcagtgggt ctgggacttc ttactctctc accatcagca gagtggaggc tgaagatgct    1501

gccacttatt actgccagca gtggactagt aacccaccca cgttcggagg ggggaccaag    1561

ctggaaatca aacgtactgt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag    1621

cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag    1681

gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc    1741

acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa    1801

gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg    1861

cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgttgataag tcgacccggc gggtttctga    1921

catccggcgg gtttctgaca tccggcgggt ttctgacatc cggcgggttt ctgacatccg    1981

gcgggtcgat cgttctgaca tccggcgggt ttctgacatc cggcgggttt ctgacatccg    2041

gcgggtttct gacatccggc gggtttctga catccggcgg gtaagcttgg atccaccatg    2101

gagttttggc tgagctgggt tttccttgtt gctattttaa aaggtgtcca gtgtcaggta    2161

caactgcagc agcctggggc tgagctggtg aagcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc    2221

aaggcttctg gctacacatt taccagttac aatatgcact gggtaaaaca gacacctggt    2281

cggggcctgg aatggattgg agctatttat cccggaaatg gtgatacttc ctacaatcag    2341

aagttcaaag gcaaggccac attgactgca gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag    2401

ctcagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctattact gtgcaagatc gacttactac    2461

ggcggtgact ggtacttcaa tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctctgcagcc    2521

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc    2581

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg    2641

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga    2701

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac    2761

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa    2821

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg    2881

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag    2941

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac    3001

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc    3061

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag    3121

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa    3181

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg    3241

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc    3301

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg    3361

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag    3421

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag    3481

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatag taagctagca ctagtctcga cttcgagcaa    3541

cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa    3601

taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta    3661

tcatgtctgg atcgtctagc atcgaagatc c                                   3691

<210>6

<211>140

<212>DNA

<213>pUC57-miR-15T

<400>6

gctagccaca aaccattatg tgctgctaga tccacaaacc attatgtgct gctaacgatc    60

acaaaccatt atgtgctgct actccacaaa ccattatgtg ctgctacgat cgcacaaacc    120

attatgtgct gctaactagt                                                140

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>引物5

<400>7

ccgtctagaa ccatggagga gccgcagtca ga                                  32

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>引物6

<400>8

tgcgaattct cagtctgagt caggccc                                        27

<210>9

<211>1197

<212>DNA

<213>P53

<400>9

tctagaacca tggaggagcc gcagtcagat cctagcgtcg agccccctct gagtcaggaa    60

acattttcag acctatggaa actacttcct gaaaacaacg ttctgtcccc cttgccgtcc    120

caagcaatgg atgatttgat gctgtccccg gacgatattg aacaatggtt cactgaagac    180

ccaggtccag atgaagctcc cagaatgcca gaggctgctc cccccgtggc ccctgcacca    240

gcagctccta caccggcggc ccctgcacca gccccctcct ggcccctgtc atcttctgtc    300

ccttcccaga aaacctacca gggcagctac ggtttccgtc tgggcttctt gcattctggg    360

acagccaagt ctgtgacttg cacgtactcc cctgccctca acaagatgtt ttgccaactg    420

gccaagacct gccctgtgca gctgtgggtt gattccacac ccccgcccgg cacccgcgtc    480

cgcgccatgg ccatctacaa gcagtcacag cacatgacgg aggttgtgag gcgctgcccc    540

caccatgagc gctgctcaga tagcgatggt ctggcccctc ctcagcatct tatccgagtg    600

gaaggaaatt tgcgtgtgga gtatttggat gacagaaaca cttttcgaca tagtgtggtg    660

gtgccctatg agccgcctga ggttggctct gactgtacca ccatccacta caactacatg    720

tgtaacagtt cctgcatggg cggcatgaac cggaggccca tcctcaccat catcacactg    780

gaagactcca gtggtaatct actgggacgg aacagctttg aggtgcgtgt ttgtgcctgt    840

cctgggagag accggcgcac agaggaagag aatctccgca agaaagggga gcctcaccac    900

gagctgcccc cagggagcac taagcgagca ctgcccaaca acaccagctc ctctccccag    960

ccaaagaaga aaccactgga tggagaatat ttcacccttc agatccgtgg gcgtgagcgc    1020

ttcgagatgt tccgagagct gaatgaggcc ttggaactca aggatgccca ggctgggaag    1080

gagccagggg ggagcagggc tcactccagc cacctgaagt ccaaaaaggg tcagtctacc    1140

tcccgccata aaaaactcat gttcaagaca gaagggcctg actcagactg agctagc       1197

<210>10

<211>112

<212>DNA

<213>4×miR-15T

<400>10

gctagccaca aaccattatg tgctgctaga tccacaaacc attatgtgct gctaacgatc    60

acaaaccatt atgtgctgct actccacaaa ccattatgtg ctgctagaat tc            112

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>引物7

<400>11

gcgcacagag gaagagaatc                                                20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>引物8

<400>12

caaggcctca ttcagc tctc    20