营养组合物在制备恢复线粒体损伤药物中的应用

摘要

本发明公开一种营养组合物在制备恢复线粒体损伤药物中的应用，本发明作为药物可为线粒体损伤的恢复提供基本营养条件，进而充分发挥机体对损伤线粒体的自主恢复本能，达到恢复线粒体损伤的目的。本发明解决了向机体植入外源基因所存在的种种问题，具有有效、安全、简便、经济、不产生免疫排斥等优点。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种营养组合物的用途，尤其是一种营养组合物在制备恢复线粒体损伤药物中的应用。

背景技术：

线粒体疾病是以线粒体结构和功能缺陷为主要原因的疾病，目前已发现与线粒体基因(mtDNA)突变有关的人类疾病多达百余种。mtDNA发生突变后，可导致细胞能量少、细胞活力下降，最终导致器官乃至整体功能下降，出现疾病或衰老征象。如在恶性肿瘤细胞中的线粒体明显减少、氧化代谢趋向降低，而无氧酵解趋向增强。目前对于线粒体疾病的治疗方法有如下几种：

①补充疗法：给病人添加呼吸链所需的辅酶，如辅酶Q等；

②选择疗法：选择ATP合成酶的抑制剂——氯霉素，连续低剂量使用此药以促进对缺陷线粒体的排斥；

③基因疗法：将线粒体基因转入患者体内，以替代缺陷mtDNA发挥作用。

由于在遗传学方面已有如下权威结论：“不论是器质性疾病还是功能性疾病，都有必要在基因水平上去探究其病因”，“人类正常的衰老和死亡也受到基因的调控”，“不论是防治疾病还是延缓衰老，都可以从基因这个层次上来研究解决问题”为此，基因治疗已经成为现代科学研究的热点。

基因治疗是纠正与疾病相关的缺陷基因的一种技术，现有方法大多都是以正常基因替换异常的致病基因。如将载有治疗基因的病毒载体感染靶细胞；脂质体携带治疗基因穿过靶细胞膜进入细胞；通过化学方法将治疗基因与特异细胞受体结合，开展靶向治疗。此外，也有少数用RNA干扰的方法。虽然1990年开始进行第一例基因治疗已获得成功，但仍面临如下问题有待解决：①外源基因在受体表达不稳定、时间短，限制了基因治疗的疗效；②外源基因移植引起免疫系统对已识别过的外来物产生免疫增强，使病人的治疗难以重复；③病毒载体对病人可能有各种潜在的危险；④许多疾病是由多基因缺陷引起的，无法用单基因纠正解决问题。

专利申请号为200710012788.8的专利申请公开了一种“促进造血干细胞增殖与血红蛋白合成的营养组合物”。该营养组合物的原料及重量比如下：核苷酸90～110、精氨酸20～30、赖氨酸20～30、半胱氨酸10～20、甘氨酸25～35、组氨酸20～30、卵磷脂110～130、脑磷脂50～70、维生素E 0.4～0.6、维生素C 5～7、叶酸0.02～0.04、维生素B₂0.05～0.07、维生素B₆0.07～0.08、维生素B₁₂0.0001～0.0002、铁0.5～1.5、锌0.5～0.7、锰0.4～0.6、枸杞多糖14～16、葡萄籽提取物14～16。可明显提高血中血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)及血小板(Plt)数量；可刺激骨髓造血干细胞的增殖，使造血干细胞明显增多；明显提高细胞内线粒体数目；对肝、脾的损伤具有明显的恢复作用。该营养组合物适用于营养不良性贫血(缺铁性贫血及叶酸与维生素B₁₂营养不良性贫血)、红细胞生成减少所致贫血以及红细胞破坏过多或丢失所致贫血。但是，该专利申请文件没有记载该营养组合物具有恢复线粒体损伤的作用。

发明内容：

本发明是发现了上述营养组合物对于损伤的线粒体具有恢复作用。

本发明的技术解决方案是一种营养组合物在制备恢复线粒体损伤药物中的应用。

本发明作为药物可为线粒体损伤的恢复提供基本营养条件，进而充分发挥机体对线粒体损伤的自主修复本能，达到恢复线粒体损伤的目的。本发明解决了向机体植入外源基因所存在的种种问题，具有有效、安全、简便、经济、不产生免疫排斥等优点。

附图说明：

图1是本发明实施例各实验组造血细胞、肝细胞及脾细胞内线粒体膜电位示意图。

图2是本发明实施例各实验组造血细胞、肝细胞及脾细胞内线粒体DNA含量示意图。

具体实施方式：

1.建立模型、实验分组和实验流程

再生障碍性贫血小鼠模型的建立：本实验采用BALB/c小鼠。实验步骤：第1天皮下注射乙酰苯肼100mg/kg，次日X射线2.0Gy照射后，于第5天环磷酰胺80mg/kg腹腔注射，第15天重复以上步骤但不给予射线处理。以单纯等量生理盐水相应部位注射为正常对照组。

实验分组：根据动物药理学的药品剂量和综合实验的设计分析，分为：①正常对照组；②再障模型组；③高剂量组，以1445.55mg/kg.d营养组合物对再障小鼠灌胃；④中剂量组，以963.7mg/kg.d营养组合物对再障小鼠灌胃；⑤低剂量组，以674.59mg/kg.d营养组合物对再障小鼠灌胃。

实验流程：首先，按前述再障小鼠模型的建立方法，注射乙酰苯肼、环磷酰胺及X射线照射。从第7天开始，营养组合物高、中、低剂量组分别以相应剂量对再障小鼠进行灌胃，每天一次，直至第49天，拉颈处死小鼠，采样进行检测。

2.实验方法

2.1线粒体膜电位测定

细胞(5×10⁵个)接种于25cm²培养瓶中，37℃培养24h后，加入不同浓度的姜黄素分别作用1h和6h后，收获细胞，PBS洗两遍，重悬于2ml含1.0μM罗丹明123的新鲜培养液中，37℃水浴振摇孵育10min，离心去掉细胞，荧光比色计测定培养液中罗丹明123的强度，激发波长490nm，发射波长520nm，结果以细胞吸收的罗丹明123的荧光强度表示。

2.2线粒体DNA含量测定

将骨髓单个核细胞(5×10⁷)、新鲜组织肝脏、脾、匀浆、裂解、离心，获取线粒体。按照DNA提取试剂盒说明提取线粒体中的DNA，采用紫外分光光度计测量其含量。

计算公式如下：

DNA浓度(μg/μl)＝A₂₆₀×50μg/ml×稀释倍数×10^-3

2.3统计学分析

所有数据均用SPSS 12.0软件进行统计分析。每一项分析至少有三次结果。数值用均数±SD表示，采用t检验。P＜0.05认为有显著性差异，并在统计学上有意义。

3.实验结果

3.1线粒体膜电位测定

采用荧光探针罗丹明123(Rh123)测定营养组合物对各实验组线粒体膜电位的影响。Rh123为亲脂性阳离子荧光素，能顺利通过活细胞的细胞膜和线粒体膜，进入线粒体。进入线粒体后由于线粒体膜的负电位差使Rh123选择性富集在线粒体上，而在胞浆中却很少结合，线粒体对Rh123的摄入量取决于其膜电位的高低。一定的膜电位形成一定的荧光强度且成正比关系，其荧光强度的大小反映线粒体膜受损程度。

如图1所示：与正常对照组相比，再障模型组小鼠造血细胞、肝细胞、脾细胞内线粒体膜电位呈明显下降趋势，表明线粒体功能明显下降；不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较，小鼠造血细胞、肝细胞、脾细胞内线粒体膜电位明显增高，呈量效关系。

罗丹明荧光强度的具体数值见表1。

#P＜0.05再障组与对照组

^*P＜0.05营养组合物组与再障组

以上结果表明营养组合物可促进再障小鼠骨髓造血细胞、肝细胞、脾细胞线粒体膜电位升高。

3.2线粒体DNA含量测定

采用紫外分光光度计测定营养组合物对各实验组线粒DNA含量的影响。

如图2所示：与正常对照组相比，再障模型组小鼠造血细胞、肝细胞、脾细胞线粒体DNA的含量有明显下降趋势；不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较，小鼠造血细胞、肝细胞、脾细胞线粒体DNA的含量明显增高，呈量效关系。

具体数值见表2。

#P＜0.05再障组与对照组

*P＜0.05营养组合物与再障组

以上结果表明营养组合物对再障小鼠骨髓造血细胞、肝细胞、脾细胞线粒体的损伤具有恢复作用。

结论：

营养组合物可促进再障小鼠骨髓造血细胞、肝细胞、脾细胞线粒体膜电位增高和DNA含量增加，说明营养组合物对上述细胞线粒体损伤具有恢复作用。