阿糖胞苷前药衍生物及其在抗癌抗肿瘤中的用途

摘要

本发明的阿糖胞苷前药衍生物的设计是通过对N4，O5位置进行化学修饰，而设计出的新型的前药衍生物，可避免N4氨基被代谢失效并引起毒性；另外，让O5羟基容易被磷酸化而激活，主要有益效果是：增加生物利用度，减少多重抗药性(多靶向设计技术)，增加溶解度，增加酯溶性。本发明详细提供了阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，阿糖胞苷前药衍生物制剂及其制备方法，并通过大量的实验数据证明了本发明的阿糖胞苷前药衍生物在抗癌抗肿瘤方面的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及医学技术领域，特别是涉及一种新型的阿糖胞苷前药衍生物及其合成路线，本发明还涉及阿糖胞苷前药衍生物制剂及其制备方法和阿糖胞苷前药衍生物及其制剂在抗癌抗肿瘤中的用途。

背景技术

癌症是目前危害人类生命健康的最主要的疾病，治疗癌症的现有手段主要包括：手术切除、放射性疗法、化学疗法或这些方法的并用。化学疗法已经得到了广泛的应用而且已经用于多种不同类型的癌症的治疗。然而，大多数化学疗法所用的抗癌药物都仅限于延缓癌症的恶化从而延长病人的生命，很难达到治愈的目的。各类癌症的发病机理虽然各不相同，但是它们其实是具有共同特征的一大类症候群。癌细胞除了代谢旺盛、不断地分化之外，与正常细胞的生理差别不是很大。这对于开发选择性地清除癌细胞、且不杀伤正常细胞的药物是个巨大的挑战。抗癌药物开发的另一大挑战是癌细胞耐药性，即经过一段时间化疗之后引起的耐药抗药性，用过的化疗药物，即使增加剂量，对癌细胞也不再起作用。肿瘤细胞的转移也常使得无法用化学疗法进行治疗。到目前为止，没有一种抗癌药物能够医治所有的癌症。寻找高效、高选择性、低毒、无耐药性、而且急需的新型抗癌药物仍然极具挑战性。大多化疗抗癌药物都会产生严重的副作用，从而导致化学治疗不能继续进行。因此，现有药物在治疗不同种类的肿瘤时受到极大的限制。所以，寻找高效、低毒的新型抗癌药物对维护人类健康仍然迫切需要。

阿糖胞苷是胞嘧啶核苷的类似物，DNA多聚酶的抑制剂。它能够阻止DNA合成，也可掺入DNA，干扰DNA的复制，此外还可阻断胞嘧啶核苷酸还原成脱氧胞嘧啶核苷酸(Sylvester，R.K.，Fisher，A.J.，and Lobell，M.，Drug Intelligence& Clinical Pharmacy：Vol.21，No.2，pp.177-180(1987)；Boyer et al.，NovelCytarabine Monophospate Prodrugs，United States Patent Application Publication，Pub.No.：US 2007/0037774 A1，(Feb.15，2007)；Colon-Cesario，M.，Wang，J.，Ramos，X.，Garcia，H.G.，Davila，J.J.，Laguna，J.，Rosado，C.，and Pena de Ortiz，S.，J.Neurosci.，26(20)：5524-5533(2006))。

目前，阿糖胞苷主要用于急性白血病的治疗。对急性粒细胞白血病疗效最好，对急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病也有效，对恶性淋巴瘤、肺癌、消化道癌、头颈部癌有一定疗效，对病毒性角膜炎及流行性结膜炎等也有一定疗效，然而，对多数实体肿瘤无效。阿糖胞苷的活性不是很高，为了提高疗效，阿糖胞苷一般均与其他药物，如：甲氧柔红霉素、全反式维甲酸联合三氧化二砷、吡柔比星、拓扑替康-足叶乙甙-环磷酰胺、氟达拉滨等合并使用。阿糖胞苷具有骨髓抑制、消化道反应等副作用，少数病人可有肝功异常、发热、皮疹等副作用(Bolwell，B.J.，Cassileth，P.A.，Gale，R.P.Leukemia.2(5)：253-60(1988)；Kimby，E.，Nygren，P.，Glimelius，B.Acta Oncol.40(2-3)：231-52(2001)；Stamatopoulos，K.Leukemia Research，Volume 22，Issue 8，pp 759-761，(2003)；Burnett，A.K.，Milligan，D.，Prentice，A.G.，Goldstone，A.H.，McMullin，M.F.，Hills，R.K.，Wheatley，K.Cancer.109(6)：1007-10(2007))。

阿糖胞苷为抗代谢药物，在细胞内先经脱氧胞苷酶催化磷酸化，转变为有活性的阿糖胞苷酸，再进一步转为相应的二磷酸及三磷酸阿糖胞苷而起作用。阿糖胞苷主要通过与DNA合成过程中所需的三磷酸脱氧胞苷竞争，而抑制DNA多聚酶，干扰核苷酸掺入DNA，并能抑制核苷酸还原酶，阻止核苷酸转变为脱氧核苷酸，但对RNA和蛋白质的合成无显著作用，属于作用于S期的细胞周期特异性药物，对处于S增殖期细胞的作用最为敏感，并对G1/S及S/G2转换期也有作用。静脉注射后迅速从血中消失，40％可通过血脑屏障，药物在体内主要在肝中代谢为无活性的阿糖尿苷，70％～90％通过肾排泄。为了开发对实体肿瘤如肝癌有疗效的抗癌新药，必须寻找对肝脏靶向性的新药。显然，抗肝炎病毒的药物可以作为极好的借鉴。例如，米夫定及阿德福韦(adefovir，PMEA)己被批准作为乙型肝炎抗病毒治疗药物(Starrett，et al.，″Synthesis，oralbioavailability determination，and in vitro evaluation of prodrugs of the antiviralagent 9-[2-(phosphonomethoxy)ethyl]adenine(PMEA)，″J Med Chem.，37(12)：1857-64(1994)；Shaw，et al.，″Pharmacokinextics and Metabolism ofSelected Prodrugs of PMEA in Rats，″Drug Metabolism Dis.，25(3)：362-366(1997)；Wacher，V.J.，et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 46：89-102(2001)；Wacher，et al.，″Active  Secretion and Enterocytic Drug Metabolism Barriers to DrugAbsorption，″Adv.Drug Del.Rev.，46：89-102(2001)；Murono，et al.，″Preventionand inhibition of nasopharyngeal carcinoma growth by antiviral phosphonatednucleoside analogs，″Cancer Res.，61(21)：7875-7(2001))。2003年，MetabasisTherapeutics，Inc公司的科学家K.Raja Reddy，Mark D.Erion，Michael C.Matelich，Joseph J.Kopcho提出用环磷酸核苷类作为抗肝癌治疗药物的前药(United States Patent 7,214,668；)，当化合物进入肝脏后，被肝脏的CYP 3A4代谢酶催化解离成无环磷酸核苷类衍生物而具有抗癌的活性。2007年，MetabasisTherapeutics，Inc公司又提出新的环磷酸阿糖胞苷衍生物作为抗癌前药的专利申请(Novel Cytarabine Monophospate Prodrugs，United States Patent ApplicationPublication，Pub.No.：US 2007/0037774 A1，Boyer et al.，Feb.15，2007；Phosphonic acid based prodrugs of PMEA and its analogues，United States Patent7,214,668，Reddy，et al.May 8，2007)。这些专利申请的核心是将环磷酸接入阿糖胞苷的核糖环上的-OCH2-核糖位置上，即O5位置，而对阿糖胞苷胞嘧啶环上的氨基不加修饰。

阿糖胞苷一般不能用于治疗肝癌，其原因在于当其胞核苷骨架结构进入肝脏之后，它的N4氨基(见图1)被代谢失效并引起毒性；另一方面是其糖甙结构上的O5羟基(见图1)必须被磷酸化而激活，而此激活过程在肝内过于缓慢。

发明内容

本发明旨在克服上述已有技术的不足，提供一种高效、低毒，无耐药性，能够被迅速激活的阿糖胞苷前药衍生物，并提供了阿糖胞苷前药衍生物的合成路线以及阿糖胞苷前药衍生物制剂的制备方法，本发明还提供了阿糖胞苷前药衍生物及其制剂在抗癌抗肿瘤方面的应用的实验数据。

本发明的阿糖胞苷前药衍生物，其特征在于：所述阿糖胞苷前药衍生物是具有下述通式(I)、(II)、(III)中的任意一种通式的化合物：

其中，W表示C＝O、S(O)O和C(O)O中的任意一种基团；

其中，Y表示(CH₂)n或H₂C-O-CH₂，其中，n＝2～6；

X表示OH、O-P(O)(OR¹)₂和磷酸基中的任意一种基团，所述磷酸基为单磷酸基、二磷酸基和三磷酸基中的任意一种；

R¹、R²是C_1-18饱和的或不饱和的脂肪基团，所述不饱和的脂肪基团中含有一个或多个不饱和健，所述不饱和健包括顺式或反式异构体；

A表示O或S或CH₂或无基团；

p＝1-5；

R³是氨基、烷基取代氨基、芳香基取代氨基、杂环基取代氨基、NHOH、NHOR⁴和如下基团中的任意一种：

其中R⁴是卤原子、氨基、硝基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、羧基、羟基、氰基、三氟甲基、苄基、苯基、芳香基、酰基、羰基、取代氨基、黄酸基、酰胺基、黄酰胺基、氨基酸、碳环基和杂环基中的任意一种。

其中，R¹可以是H、C_1-18烷基、C_3-18环烷基，苄基，苯基和芳环基中的任意一种；R²是H、C₁-C₁₈烷基、C_3-18环烷基、C_2-18烯基、C_2-18炔基、环烯基、苄基、苯基、芳香基，环氨基、碳环基、杂环基、苯胺基和取代苯胺基中的任意一种。其中每一个基团可以进而取代，而且其中可含有杂原子。

本发明的通式(I)的阿糖胞苷前药衍生物包括具有下述结构式的代表性化合物：

本发明的通式(II)的阿糖胞苷前药衍生物包括具有下述结构式的代表性化合物：

本发明的通式(III)的阿糖胞苷前药衍生物包括具有下述结构式的代表性化合物：

为了清晰起见但并非限制本发明，除另外说明之外，本发明所使用的所有科技术语和在本发明领域内技术人员常使用和理解的意义相同。本发明所引用的专利申请或已发表的申请及其他论文均属于原始引用并未加修改。

本专利所用“一个”或“一种”或“一类”意指最少一个/种/类或一个/种/类或一个/种/类以上。

本发明所用“烷基”意指各种饱和的直链的、带侧链的或环状的碳氢基团，特包括含有十个或十个碳以下的小烷基。例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基、庚基、辛基和壬基等仅为本定义中的一些典型例子。

本发明所用“烯基”与上述“烷基”定义相同，但其中必须最少有一个碳碳双键(C＝C)，所以本发明所用的烯基包括含有两个到十个碳原子的直链的、带有分支链的或环状的并至少含有一个碳碳双键的烃基，如乙烯基、丙烯基、丁烯基和戊烯基等。

本发明所用的“炔基”为上述烷基或烯基并含有至少一个碳碳三键，所以，炔基包括含有两个到十个碳原子并含有至少一个碳碳三键的直链的、带有分支链的或环状的烃基或炔基，如乙炔基、丙炔基、丁炔基和戊炔基等。

本发明中的“饱和”意指该基团中不含不饱和键，如碳碳双键或碳碳三键；而“不饱和”则指该基团中含有一个或一个以上的碳碳双键或碳碳三键。

本发明所用“环烷基”为环状的碳氢基团并优先选用含有三到八个碳的环烷基。因此环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷均为本定义下的典型例子。环烷基中含有一个或两个碳碳双键即形成“环烯基”。环烷基上还可带有烷基、烯基、炔基和其他基团。

本发明所使用的“芳香基”为环状共轭芳香系统并可在环中含有一个或一个以上的非碳原子(除碳以外的其他杂原子如氮)，如苯基、萘基和吡啶基等。

本发明中还常用到的“杂环基”指任何多个原子通过共价键构成的环状基团和化合物，并且至少含有一个非碳原子。特指杂环基团包括含有氮，硫或氧非碳原子的五元和六元环状系统如嘧唑、吡咯、吡啶或嘧啶等。

本发明中的“烷氧基”指把氧原子与直链或带支链的烷基连接所形成的烷基氧化基。此类烷氧基团的例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基等。

同样地，“烷硫基”指把硫原子与直链或带支链的烷基连接所形成的烷基硫化基。此类烷硫基团的例子包括甲硫基、乙硫基、丙硫基或异丙硫基等。

本发明中的“卤原子基”为氟，氯，溴，碘。

本发明中的“氨基酸”指取代的天然和非天然的氨基酸，纯的L-或D-构型或外消旋混合物，以及其由氨基和羧基而衍生出来的基团。

特别值得进一步说明的是，上述所定义的各种取代基还包括它们被进一步取代而构成的基团，其中这些新的取代基也可含有其他的基团。例如烷基或芳香基上的氢原子被氨基、卤素或其他基团取代即成为新的属于上述各定义中的基团。

本发明中所用的“磷酸”或“磷酸酯”是最高氧化态的五价磷原子上连有四个氧原子，一个氧原子以双键与磷原子相连，两个氧原子以单键与磷原子相连，而且，这两个氧原子上可以是氢原子、负电荷或如上所定义的各种烷基、芳香基等，如-P(＝O)(O-)₂，-P(O)(OR)₂。磷原子上的另外一个氧原子与本发明中的衍生物相连。

本发明中的“前药”指本发明的阿糖胞苷前药衍生物被用到体内后，在体内断裂或增加某个结构单元所形成的起生物作用的化合物。

本发明中提及的有机溶剂包括：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、多聚乙二醇(PEG)和四氢呋喃(THF)。

本发明解决的另一个技术问题是提供了多个通式(I)、(II)或(III)的结构式的阿糖胞苷前药衍生物的简单有效的合成路线，其技术放案分别如下：

1.阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：

(1)酸酐化合物与脂肪醇混和，加热回流或室温搅拌，反应3～5个小时，冷却得到的第一中间产物(B)不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

(2)阿糖胞苷，第一中间产物(B)，PyBOP和DMAP溶于DMF，室温～60℃搅拌7～24小时，得到反应液通过柱层析色谱提纯，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

所述酸酐化合物为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一中；所述脂肪醇为甲醇、乙醇、正辛醇、月桂醇、正癸醇、正十四醇、正十六醇和十八醇中的任意一种。(参考合成路线1～5，8、9、11、12、16～23)

2.阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：

(1)将2，6-二甲基氨基苯或环烷基苯并咪唑、酸酐化合物和DMAP溶于四氢呋喃，控制温度35～50℃反应3～5小时，析出固体，所得第二中间产物(C)不经纯化，直接用于下一步反应；

(2)将阿糖胞苷，第二中间产物(C)，PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12～24小时，反应液倒入水中，析出固体或将反应液通过柱层析色谱提纯，得到通式(II)的阿糖胞苷前药衍生物。

所述酸酐化合物为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一种。(参考合成路线14，15)

3.阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：

(1)酸酐化合物与脂肪醇混和，加热回流或室温搅拌，反应3～5个小时，冷却得到的第一中间产物(B)不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

(2)第一中间产物(B)，SOCl₂和1～2滴DMF溶于二氯甲烷，加热回流3～4小时，旋转蒸发减压除去溶剂和过量的SOCl₂得到第三中间产物(D)，不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

(3)阿糖胞苷盐酸盐和第三中间产物(D)溶于DMF，室温搅拌2～4天，减压蒸馏除去DMF后得到的油状物加乙醚搅拌固化，得到的半固体产品用NaHCO₃水溶液中和、过滤，所得固体用水洗至中性后用乙酸乙酯重结晶、过滤或所得固体溶于甲醇，过滤除去不溶物，然后通过柱层析色谱提纯，得到通式(III)的阿糖胞苷衍生物。

所述酸酐化合物为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一种；所述所述脂肪醇为甲醇、乙醇、正辛醇、正癸醇、月桂醇，正十四醇、正十六醇和十八醇中的任意一种。(参考合成路线6、7、10，13)

阿糖胞苷前药衍生物制剂的制备方法，其特征在于：

(1)将具有通式(I)、(II)或(III)中的任意一种结构式的阿糖胞苷前药衍生物溶解到水、生理盐水、环糊精水溶液、水溶性的有机溶剂、非离子性的表面活性剂、水溶性的类脂、脂肪酸、脂肪酸酯和磷脂中的任意一种或多种的组合溶剂而制得制剂溶液；

(2)将所述制剂溶液再用生理盐水或葡萄糖注射液稀释而制成阿糖胞苷前药衍生物制剂。

所述有机溶剂是乙醇、丙二醇、甘油、甘油酯、多聚乙二醇(PEG)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)中的任意一种或多种的组合溶剂。

本发明的阿糖胞苷前药衍生物制剂，其特征在于：是由上述阿糖胞苷前药衍生物制剂的制备方法制备得到的产品。

阿糖胞苷前药衍生物在抗癌抗肿瘤中的用途。所述癌症包括但不仅限于白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌和肾癌。

本发明的阿糖胞苷前药衍生物制剂在抗癌抗肿瘤中的用途。所述癌症包括但不仅限于癌症包括白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌和肾癌。所述阿糖胞苷前药衍生物制剂还可与其他化疗药物联合用在抗癌抗肿瘤中，所述其他化疗药物包括烷化剂、植物生物碱类、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类及其它已知的抗癌药物。在所述联合用药过程中，包括运用至少一种具有上述所列举的代表性的阿糖胞苷前药衍生物。

以本发明的阿糖胞苷前药衍生物为成份制备成药用制剂，可以用于口服的或非肠道途径给药。此处所指的非肠道途径给药是指皮下皮内、静脉内、动脉内、肌肉内、心房内、滑膜内、胸骨内注射或滴注。

本发明采用新的设计技术构思设计出阿糖胞苷前药衍生物。阿糖胞苷(参照附图1)不能用于治疗肝癌的原因一方面在于当其胞核苷骨架结构进入肝脏之后，它的N4氨基被代谢失效并引起毒性，另一方面是其糖甙结构上的O5羟基必须被磷酸化而激活，而此激活过程在肝内过于缓慢。

本发明的阿糖胞苷前药衍生物的设计是通过对N4，O5位置进行化学修饰，而设计出了新型的前药衍生物，避免N4氨基被代谢失效并引起毒性；另外，让O5羟基容易被磷酸化而激活，主要有益效果是：增加生物利用度，减少多重抗药性(多靶向设计技术)，增加溶解度，增加酯溶性。本发明详细提供了阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，阿糖胞苷前药衍生物制剂及其制备方法，并通过大量的实验数据证明了本发明的阿糖胞苷前药衍生物在抗癌抗肿瘤方面的用途。

附图说明

图1表示阿糖胞苷的结构和N4，O5修饰位置的示意图。

图2表示本发明的通式-I的具有代表性的阿糖胞苷前药衍生物的结构示意图。

图3表示本发明的通式-II的具有代表性的阿糖胞苷前药衍生物的结构示意图。

图4表示本发明的通式-III的具有代表性的阿糖胞苷前药衍生物的结构示意图。

图5表示本发明的阿糖胞苷前药衍生物抑制BEL-7402肝癌细胞株的药物浓度-抑制率曲线图。

具体实施方式

本发明的一些代表性阿糖胞苷前药衍生物的合成路线列举如下。本发明专利中的其他类似阿糖胞苷前药衍生物通过相同或类似的方法合成得到。合成路线1：

第一中间产物B1的合成(路线1)：丁二酸酐(25g，250mmol)溶于甲醇(50ml)，加热回流，反应3个小时。得到的第一中间产物B1不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物1的合成(路线1)：阿糖胞苷(1.0g，4.1mmol)，第一中间产物B1(0.6g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(20ml)，室温搅拌24小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝9/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物1(16.9mg)，LC(UV 254nm)纯度＞95％。LC-MS m/z 358[M+H]⁺(分子式C₁₄H₁₉N₃O₈，分子量357)。

合成路线2：

第一中间产物B2的合成(路线2)：戊二酸酐(28.5g，250mmol)溶于乙醇(100毫升)，加热回流，反应5个小时。得到的第一中间产物B2不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物2的合成(路线2)：阿糖胞苷(1.0g，4.1mmol)，第一中间产物B2(0.79g，4.9mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝9/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物2(46.9mg)，LC(UV 254nm)纯度＞95％。LC-MS m/z 386[M+H]⁺(分子式C₁₆H₂₃N₃O₈，分子量385)。

第一中间产物B3的合成(路线3)：戊二酸酐(11.4g，100mmol)溶于甲醇(50ml)，加热回流，反应3个小时。得到的第一中间产物B3不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物3的合成(路线3)：阿糖胞苷(1.0g，4.1mmol)，第一中间产物B3(0.72g，4.9mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌7小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝9/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物3(78.3mg)，LC(UV 254nm)纯度91％。LC-MS m/z 372[M+H]⁺(分子式C₁₅H₂₁N₃O₈，分子量371)。

合成路线4：

第一中间产物B 4的合成(路线4)：戊二酸酐(3.4g，30mmol)溶于月桂醇(10ml，45mmol)，控制温度30℃，反应5个小时。得到的第一中间产物B4不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物4的合成(路线4)：阿糖胞苷(1.0g，4.1mmol)，第一中间产物B 4(1.36g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝9/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物4(169.3mg)，LC(UV 254nm)纯度98％。LC-MS m/z 526[M+H]⁺(分子式C₂₆H₄₃N₃O₈，分子量525)；¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ10.84(s，1H)，8.06(d，1H)，7.20(d，1H)，6.05(d，1H)，5.49(d，2H)，5.07(t，1H)，4.06(m，1H)，3.99(t，2H)，3.92(m，1H)，3.82(m，1H)，3.61(m，2H)，2.43(t，2H)，2.32(t，2H)，1.79(m，2H)，1.55(m，2H)，1.24(m，18H)，0.85(t，3H)。

合成路线5：

第一中间产物B 5的合成(路线5)：丁二酸酐(3.0g，30mmol)溶于月桂醇(8.37g，45mmol)，室温搅拌，反应5个小时。得到的第一中间产物B5不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物5的合成(路线5)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B5(1.3g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝9/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物5(16.3mg)，LC(UV 254nm)纯度98％。LC-MS m/z 512[M+H]⁺(分子式C₂₅H₄₁N₃O₈，分子量511)。

第一中间产物B 6的合成(路线4)：戊二酸酐(3.4g，30mmol)溶于月桂醇(10ml，45mmol)，控制温度30℃，反应5个小时。得到的第一中间产物B6不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

第三中间产物D6的合成(路线6)：第一中间产物B6(4.0g，13.3mmol)，SOCl₂(3.17g，26.6mmol)和1滴DMF溶于二氯甲烷(20ml)，加热回流3小时。旋转蒸发减压除去溶剂和过量的SOCl₂得到第三中间产物D6。得到的产物不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物6的合成(路线6)：阿糖胞苷盐酸盐(0.7g，2.5mmol)和第三中间产物D6(1.04g，3.26mmol)溶于DMF(6ml)，室温搅拌2天。减压蒸馏除去DMF。油状物加12.5ml乙醚搅拌固化，共三次。得到的半固体促产品用5ml，1mol/L的NaHCO₃水溶液中和。过滤，所得固体用水洗至中性，用60ml乙酸乙酯重结晶，过滤，得到阿糖胞苷前药衍生物6(89.4mg)，LC(UV 254nm)纯度＞95％。LC-MS m/z 526[M+H]⁺(分子式C₂₆H₄₃N₃O₈，分子量525)；¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ7.46(d，1H)，7.10(brs，1H)，7.01(brs，1H)，6.08(d，1H)，5.65(d，1H)，5.57(m，2H)，4.29(dd，1H)，4.19(dd，1H)，3.98(m，3H)，3.90(m，1H)，3.88(s，1H)，2.38(t，2H)，2.32(t，2H)，1.78(m，2H)，1.55(m，2H)，1.24(m，18H)，0.85(t，3H)。

第一中间产物B 7的合成(路线2)：戊二酸酐(28.5g，250mmol)溶于乙醇(100毫升)，加热回流，反应5个小时。得到的第一中间产物B7不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

第三中间产物D7的合成(路线7)：第一中间产物B7(6.0g，37.5mmol)，SOCl₂(8.9g，75mmol)，和1滴DMF溶于二氯甲烷(40ml)，加热回流3小时。旋转蒸发除去溶剂和过量的SOCl₂得到第三中间产物D7，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物7的合成(路线7)：阿糖胞苷盐酸盐(1.4g，5mmol)和第三中间产物D7(1.0g，5.6mmol)溶于DMF(12ml)，室温搅拌2天。蒸馏除去DMF。油状物加25ml乙醚搅拌固化，共三次。得到的半固体粗产品用10ml，1mol/L的NaHCO₃水溶液中和。用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，水洗后，用无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩，放置后析出晶体。过滤，得到阿糖胞苷前药衍生物7(25.3mg)，LC(UV 254nm)纯度＞95％。LC-MSm/z 386[M+H]⁺(分子式C₁₆H₂₃N₃O₈，分子量385)。

合成路线8：

第一中间产物B8的合成(路线8)：二甘醇酐(0.58g，5mmol)溶于乙醇(20ml)，控制温度40℃，反应5个小时。得到的第一中间产物B8不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物8的合成(路线8)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B8(0.81g，5.0mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物8(191.5mg)，LC(UV 254nm)纯度＞90％。LC-MS m/z 388[M+H]⁺(分子式C₁₅H₂₁N₃O₉，分子量387)。

合成路线9：

第一中间产物B9的合成(路线9)：二甘醇酐(1.276g，11mmol)溶于月桂醇(2.42g，13mmol)，控制温度40℃，反应4个小时。得到的第一中间产物B9不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物9的合成(路线9)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B 9(1.51g，5.0mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物9(90.1mg)，LC(UV 254nm)纯度＞90％。LC-MS m/z 528[M+H]⁺(分子式C₂₅H₄₁N₃O₉，分子量527)。

合成路线10：

第一中间产物B10的合成(路线10)：二甘醇酐(1.276g，11mmol)溶于月桂醇(2.42g，13mmol)，控制温度40℃，反应4个小时。得到的第一中间产物B10不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

第三中间产物D10的合成(路线10)：第一中间产物B10(1.81g，6.0mmol)，SOCl₂(1.43g，12mmol)和1滴DMF溶于二氯甲烷(20ml)，加热回流4小时。旋转蒸发除去溶剂和过量的SOCl₂得到第三中间产物D10，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物10的合成(路线10)：阿糖胞苷盐酸盐(1.4g，5mmol)和第三中间产物D10(1.92g，6.0mmol)溶于DMF(12ml)，室温搅拌2天。蒸馏除去DMF。油状物加25ml乙醚搅拌固化，共三次。得到的半固体粗产品用10ml，1mol/L的NaHCO₃水溶液中和。过滤，所得固体用水洗至中性，用60ml乙酸乙酯重结晶，过滤出固体，然后通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝5/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物10(118.0mg)，LC(UV 254nm)纯度＞90％。LC-MS m/z 528[M+H]⁺(分子式C₂₅H₄₁N₃O₉，分子量527)。

合成路线11：

第一中间产物B11的合成(路线11)：己二酸酐(1.276g，11mmol)溶于甲醇(2.42g，13mmol)，控制温度40℃，反应4个小时。得到的第一中间产物B11(己二酸单甲酯)不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物11的合成(路线11)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B11(己二酸单甲酯)(0.72g，4.1mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物11(58.6mg)，LC(UV 254nm)纯度＞95％。LC-MS m/z 386[M+H]⁺(分子式C₁₆H₂₃N₃O₈，分子量385)。

第一中间产物B12的合成(路线12)：己二酸酐(1.276g，11mmol)溶于乙醇(2.42g，13mmol)，控制温度40℃，反应4个小时。得到的第一中间产物B 12(己二酸单乙酯)不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物12的合成(路线12)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B12(己二酸单乙酯)(0.8g，4.1mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物12(47.9mg)，LC(UV 254nm)纯度＞95％。LC-MS m/z 400[M+H]⁺(分子式C₁₇H₂₅N₃O₈，分子量399)。

合成路线13：

第一中间产物B13的合成(路线13)：丁二酸酐(1.276g，11mmol)溶于甲醇(2.42g，13mmol)，控制温度40℃，反应4个小时。得到的第一中间产物B13(丁二酸单甲酯)不经进一步纯化，直接用于下一步反应

第三中间产物D13的合成(路线13)：第一中间产物B13(726mg，5.5mmol)，SOCl₂(1.31g，11mmol)和1滴DMF溶于二氯甲烷(10ml)，加热回流3小时。减压旋转蒸发除去溶剂和过量的SOCl₂得到第三中间产物D13，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物13的合成(路线13)：阿糖胞苷盐酸盐(1.4g，5mmol)和第三中间产物D13(820mg，5.5mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌2天。蒸馏除去DMF。油状物加乙醚搅拌固化。得到的半固体粗产品用NaHCO₃水溶液中和。旋干，固体溶于甲醇，过滤除去不溶物。然后通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝4/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物13(128.4mg)，LC(UV 254nm)纯度＞90％。LC-MS m/z 358[M+H]⁺(分子式C₁₄H₁₉N₃O₈，分子量357)。

合成路线14：

第二中间产物C14的合成(路线14)：将如上合成路线中的2，6-二甲基氨基苯(1.21g，10mmol)溶于10毫升THF，然后加入戊二酸酐(1.14g，10mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)，50℃反应5小时，减压蒸干滤液，所得第二中间产物C14不经纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物14的合成(路线14)：将阿糖胞苷(2.43g，10mmol)，第二中间产物C14(2.35g，10mmol)，PyBOP(5.7g，11mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物14(139.4mg)，LC(UV 254nm)纯度＞95％)。LC-MS m/z 461[M+H]⁺(分子式C₂₂H₂₈N₄O₇，分子量460)。

合成路线15

第二中间产物C15的合成(路线15)：将上述路线15中的环烷基苯并咪唑(0.53g，2.1mmol)，丁二酸酐(0.25g，2.5ml)与DMAP(0.2g，1.6mmol)溶于四氢呋喃(20ml)中，控制温度35℃，反应3个小时。倒入水中，析出固体，过滤所得固体的第二中间产物C15不经进一步纯化，直接用于下一步反应。阿糖胞苷前药衍生物15的合成(路线15)：阿糖胞苷(0.39g，1.6mmol)，第二中间产物C15(0.47g，1.3mmol)，PyBOP(0.84g，1.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌过周末。反应液倒入水中，析出固体，得到阿糖胞苷前药衍生物15(104.8mg)，LC(UV 254nm)纯度＞99％。LC-MS m/z 599[M+Na]⁺(分子式C₂₅H₂₉ClN₆O₈，分子量576)。

合成路线16

第一中间产物B16的合成(路线16)：将正癸醇(4g，26mmol)溶于20毫升四氢呋喃中，然后加入戊二酸酐(2.5g，22mmol)，60℃下搅拌反应4小时。得到的第一中间产物B 16不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物16的合成(路线16)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B16(1.36g，5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，室温下搅拌12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物16(70.2mg)。LC(UV 254nm)纯度97％。LC-MSm/z 498[M+H]⁺(分子式C₂₄H₃₉N₃O₈，分子量497)。

合成路线17：

第一中间产物B17的合成(路线17)：戊二酸酐(2.28g，20mmol)与正十四醇(4.28g，20mmol)混合，加热融熔，反应4小时，冷却，得白色固体的第一中间产物B17，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物17的合成(路线17)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B17(1.48g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，40℃下搅拌12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物17(31.6mg)。LC(UV 254nm)纯度95％。LC-MSm/z 554[M+H]⁺(分子式C₂₈H₄₇N₃O₈，分子量553)。

合成路线18：

第一中间产物B18的合成(路线18)：戊二酸酐(0.51g，4.5mmol)与正十六醇(1.2g，4.9mmol)混合，加热融熔，反应4个小时，冷却，得白色固体的第一中间产物B18，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物18的合成(路线18)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B18(1.6g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，60℃下搅拌12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物18(166.7mg)。LC(UV 254nm)纯度97％。LC-MSm/z 604[M+Na]⁺(分子式C₃₀H₅₁N₃O₈，分子量581)。

合成路线19：

第一中间产物B19的合成(路线19)：戊二酸酐(2.24g，19.6mmol)与正十八醇(5.4g，20mmol)混合，加热融熔，反应4个小时，冷却，得白色固体的第一中间产物B 19，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物19的合成(路线19)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B19(1.73g，4.9mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，50℃下搅拌12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物19(149.6mg)。LC(UV 254nm)纯度99％。LC-MSm/z 632[M+Na]⁺(分子式C₃₂H₅₅N₃O₈，分子量609)。

合成路线20：

第一中间产物B20的合成(路线20)：将正癸醇(0.77g，4.9mmol)溶于20毫升四氢呋喃中，然后加入二甘醇酐(0.52g，4.5mmol)，回流搅拌反应4小时，得到的第一中间产物B20不用进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物20的合成(路线20)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B20(1.23g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，40℃下搅拌12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物20(31.3mg)。LC(UV 254nm)纯度97％。LC-MSm/z 500[M+H]⁺(分子式C₂₃H₃₇N₃O₉，分子量499)。

合成路线21：

第一中间产物B21的合成(路线21)：二甘醇酐(0.52g，4.5mmol)与十四醇(1.05g，4.9mmol)混合，加热融熔，反应4小时，冷却，得白色固体的第一中间产物B21，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物21的合成(路线21)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B21(1.48g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，50℃下搅拌12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物21(101.2mg)。LC(UV 254nm)纯度95％。LC-MSm/z 556[M+H]⁺(分子式C₂₇H₄₅N₃O₉，分子量555)。

合成路线22：

第一中间产物B22的合成(路线22)：二甘醇酐(0.52g，4.5mmol)与十六醇(1.19g，4.9mmol)混合，加热融熔，反应4小时，冷却，得白色固体的第一中间产物B22，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物22的合成(路线22)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B22(1.6g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，60℃下搅拌12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物22(62.9mg)。LC(UV 254nm)纯度95％。LC-MSm/z 606[M+Na]⁺(分子式C₂₉H₄₉N₃O₉，分子量583)。

合成路线23：

第一中间产物B23的合成(路线23)：二甘醇酐(0.52g，4.5mmol)与十八醇(1.33g，4.9mmol)混合，加热融熔，反应4小时，冷却，得白色固体的第一中间产物B 23，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物23的合成(路线23)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中间产物B23(1.74g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，室温下搅拌12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前药衍生物23(43.2mg)。LC(UV 254nm)纯度95％。LC-MSm/z 612[M+H]⁺(分子式C₃₁H₅₁N₃O₉，分子量611)。

生物活性：

本发明所涵盖的阿糖胞苷前药衍生物具有抑制肿瘤细胞增生的功能，以及抗肿瘤作用。肿瘤细胞癌症包括但不限于血癌、肠癌、皮肤癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、子宫癌、脑瘤、色素瘤、前列腺癌等。

合成药物肿瘤细胞毒性实验操作规程

本发明的阿糖胞苷前药衍生物及其制剂对肿瘤细胞的抑制作用试验

1.试验材料

1)细胞株：

HL-60细胞株，悬浮生长，用含10％胎牛血清(Hyclone公司)的RPMI 1640细胞培养基培养，常规培养保持初始细胞浓度在3*10⁵/ml左右，三天一次1∶3传代。实验前一天传代(5*10⁵/ml)，实验时细胞浓度在7.5～10*10⁵/ml之间。

BEL-7402细胞株和HT-29细胞株，贴壁生长，用10％胎牛血清(Hyclone公司)的D-MEM细胞培养基培养，常规培养初始细胞浓度在3*10⁵/ml左右，2～3天1∶3传代一次。实验前一天1∶2传代，实验时细胞浓度在5～10*10⁵/ml之间。

2)药物的溶解与稀释：根据提供的阿糖胞苷前药衍生物的重量和分子量，首先加入DMSO 100～200μl，然后加入NS，使稀释后得到的药物浓度为5mM(注意DMSO终浓度不超过10％)。

3)D-MEM或RPMI 1640细胞培养基，Gibco公司

4)胎牛血清，Hyclone公司

5)细胞消化液，0.25％Trypsin+0.02％EDTA

6)PBS磷酸盐缓冲液

7)MTT液，MTT干粉(Sigma)，用PBS充分溶解配成5mg/ml，0.22μm微孔滤膜过滤后分装，-20℃保存

8)10％酸化SDS，0.01N HCl

9)离心管、吸管等(BD公司)，96孔板(Costar公司)

2.步骤：

1)细胞接种：传代后24小时的细胞，生长状态良好。常规收获细胞，用新鲜培养液调整细胞浓度为2×10⁵/ml(贴壁细胞)～3×10⁵/ml(悬浮细胞)。贴壁细胞接种100μl/孔，37℃、5％CO₂孵箱中培养24h后弃去旧培养液，加入新鲜培养液95μl/孔。悬浮细胞直接接种95μl/孔。

2)药物处理：每一药物设6个浓度梯度，每一浓度设3个复孔，药物空白对照组设5个复孔。每次试验同时做Ara-C对照。HT-29和BEL-7402细胞加入药物的浓度依次为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.16mM，每孔5μl，终浓度依次为0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.016、0.008mM，对照组加入5μl生理盐水；HL-60细胞加入药物的浓度依次为5×10^-3、2.5×10^-3、1.25×10^-3、0.625×10^-3、0.3125×10^-3、0.16×10^-3mM，对应终浓度依次为2.5×10^-4、1.25×10^-4、6.25×10^-5、3.125×10^-5、1.6×10^-5、8×10^-6mM，对照组加入5μl生理盐水。

3)细胞培养与检测：加入药物后，37℃、5％CO₂孵箱中培养72h，然后每孔加入MTT 10μl，继续培养4h，每孔加100μl 10％SDS(含0.01N HCl)溶解，24h后用Bio-rad 680型ELISA读数仪测定各孔吸光度(A)，检测波长为570nm、参考波长为630nm。

4)计算：首先平均各复孔的吸光度(去除过于悬殊的数据)，计算每种细胞每个药物浓度下的抑制率(IR)，IR(％)＝(1-A_n/A₀)×100％，A_n为实验孔平均吸光度，A₀为药物空白对照孔平均吸光度。用EXCEL软件，绘制药物浓度效应曲线，选择合理的计算方法计算50％细胞存活的药物浓度(IC₅₀)。

图5是阿糖胞苷前药衍生物抑制BEL-7402肝癌细胞株的药物浓度-抑制率曲线图，其中，JF001、JF017、JF019、JF020和JF033分别为根据上述合成路线1、17、19、20和33合成得到的阿糖胞苷衍生物。

表1-2列举了代表性阿糖胞苷前药衍生物抑制不同肿瘤细胞的生物活性。其中，JF004、JF006、JF007、JF009、JF010、JF013、JF014和JF021分别为根据上述合成路线4、6、7、9、10、13、14和21合成得到的阿糖胞苷衍生物。

表1

表2、代表性阿糖胞苷前药衍生物的肿瘤细胞活性