一种抗人重组组织因子单克隆抗体的制备方法

摘要

一种抗人重组组织因子单克隆抗体的制备方法，是利用原核表达后纯化获得的截断型人重组组织因子结合福氏佐剂免疫小鼠，取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选取HAT选择培养基选择性培养筛选，有限稀释法亚克隆培养后，利用ELISA法选择目的杂交瘤细胞，大量扩增并注入同系小鼠腹腔内制备腹水，得到效价良好，产量较高的抗人重组组织因子单克隆抗体。本发明方法制备得到的抗人重组组织因子单克隆抗体灵敏性高、特异性强，可用于人重组组织因子的免疫亲和纯化，还可用于抗凝药物和肿瘤治疗药物的研究开发。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗人重组组织因子单克隆抗体的制备方法。

背景技术

人组织因子(Tissue Factor，TF)是分子量为47KD的糖蛋白，含有263个氨基酸残基，为跨膜受体蛋白质。TF是凝血因子VII的受体和辅助因子，是外源凝血途径的启动蛋白。TF蛋白分子分为3部分，胞内区21个氨基酸残基，跨膜部分为23个氨基酸残基，具有疏水性，胞外部分含219个氨基酸残基，为氨基端，带有糖链。

组织因子是生理性凝血中最重要的启动因子，是目前临床上凝血酶原时间检测试剂的主要成分，也是影响凝血酶原时间测定的主要因素。近年来的研究还证实，TF不仅在凝血途径中起着重要作用，在各种恶性肿瘤中也常常异常表达，可以通过介导多种信号转导影响肿瘤的生长、侵袭和转移等病理过程。

专利200510012414.7构建和表达了一种截断型人重组组织因子TF₂₄₃(由跨膜部分和膜外部分组成)，同时证明这种缺失胞内区的截断型人重组组织因子具有全部的凝血活性。这种截断型人重组组织因子与生物提取获得的天然组织因子相比，其制备的凝血酶原测定试剂产品质量和测定结果均十分稳定；而与01132127.x专利申请公开的仅包含胞外区的人重组组织因子相比，其生物活性大大提高。

在该专利技术中，利用抗TF单克隆抗体的亲和免疫纯化技术，是获得良好人重组组织因子蛋白的关键。

抗TF单克隆抗体还可与TF发生免疫反应，抑制血栓的形成。同时Huang(Science，1997，275(5229)：547-550.)和Versteeg(Mol Med，2004，10(16)：6.)等的动物模型研究表明：TF抗体与TF结合后，可以靶向性抑制肿瘤血管的生成，导致肿瘤坏死。

因此，利用单克隆抗体技术制备灵敏性高、特异性强的抗TF单克隆抗体，不仅能利用免疫亲和方法特异迅速地纯化TF蛋白，为新型凝血酶原测定试剂的生产提供技术保障；还可为利用抗TF单克隆抗体应用于血栓、癌症等临床治疗奠定基础。

而目前国内尚无商品化的抗TF单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人重组组织因子单克隆抗体的制备方法，利用本发明方法制备得到的抗人重组组织因子单克隆抗体灵敏性高、特异性强。

本发明的抗人重组组织因子单克隆抗体是通过以下方法制备得到的：

1)选择免疫原：利用200510012414.7专利构建表达的人重组组织因子(rhTF₂₄₃)作为免疫原，其蛋白特征是含有天然人组织因子跨膜部分和胞外部分的243个氨基酸残基，为缺失胞内区的截断型人重组组织因子，具有天然人组织因子的全部凝血活性。

该人重组组织因子是从人胎盘组织中获取总RNA，设计PCR引物，通过RT-PCR方法得到目的基因片段；将收集的TF基因片段与phoA质粒重组，构建TF表达质粒载体pTF₂₄₃，转化到大肠杆菌MM294中，筛选得到基因重组工程菌株，接入发酵培养基发酵表达，最后通过TF单克隆抗体免疫亲和层析柱纯化得到rhTF₂₄₃，其具体的构建表达方法可参阅200510012414.7专利。

2)免疫：将免疫原稀释成不同浓度的稀释液，与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂乳化混合成不同免疫原浓度的乳化混合液，对小鼠进行基础免疫、加强免疫、二次加强免疫和融合前冲击免疫。

具体的免疫过程为：

基础免疫：采用30μg～60μg rhTF₂₄₃/ml乳化混合液对小鼠进行皮下多点注射免疫；

加强免疫：两周后，采用15μg～30μg rhTF₂₄₃/ml乳化混合液对小鼠进行腹腔注射免疫；

二次加强免疫，加强免疫两周后，采用15μg～30μg rhTF₂₄₃/ml乳化混合液对小鼠进行二次腹腔注射免疫；

融合前冲击免疫：二次加强免疫一周后，采用25μg～50μg rhTF₂₄₃/ml乳化混合液对小鼠进行腹腔注射冲击免疫。

其中，上述不同浓度的免疫原稀释液与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂均是按照1∶1的体积比进行乳化混合的。

3)筛选免疫血清：采用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；

4)细胞融合及克隆化：选取血清效价最高的鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞利用PEG1500试剂进行体外融合，经多次亚克隆获得稳定分泌抗人重组组织因子的杂交瘤细胞株；

5)制备腹水：将杂交瘤细胞株扩大培养后，注入经液体石蜡预处理的小鼠腹腔内生产腹水；

制备腹水的条件是：以液体石蜡作为致敏剂，选取14～22周龄BALB/c小鼠为实验动物，以0.5m1/只注射液体石蜡，以1×10⁵～5×10⁵个/ml的接种密度接种杂交瘤细胞株0.5ml/只。

6)收集腹水：接种杂交瘤细胞株10～12d后，将腹水迅速吸至细胞离心管中，3000rpm离心15min，收集上清液，得到效价良好，产量较高的抗人重组组织因子单克隆抗体。

与现有技术相比，本发明具有的优势是：

1)采用具有天然人组织因子的全部凝血活性的人重组组织因子作为抗原，筛选获得的抗组织因子单克隆抗体特异性高；

2)优化了腹水的制备方法，扩大培养后的细胞株注入经液体石蜡预处理的小鼠腹腔以生产腹水，大大提高了腹水的产率。

3)依本发明方法制得的单克隆抗体，可用于研究开发抗凝药物和肿瘤治疗药物，质量稳定，产量高，可用于产业化和商业化。

附图说明

图1为抗人重组组织因子单克隆抗体的SDS-PAGE分析结果；

图中，1、2为纯化的抗人重组组织因子单克隆抗体，3为标准蛋白质分子量。

图2为抗人重组组织因子单克隆抗体的蛋白免疫印迹(Wester Blot)分析结果；

图中，M为标准蛋白质分子量，1、2、3为截断型人重组组织因子rhTF₂₄₃，4为纯化的抗人重组织组织因子单克隆抗体。

具体实施方式

实施例1

抗人重组组织因子单克隆抗体的制备

1、免疫原

选择200510012414.7专利构建表达的人重组组织因子(rhTF₂₄₃)作为免疫原。

2、免疫小鼠

基础免疫：取储存于Tris-HCl缓冲液中的rhTF₂₄₃(1mg/ml)稀释至120μg/ml，按照1∶1的体积比与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂充分乳化混合，以酒精棉球消毒BALB/c小鼠腹部，选取5个点对小鼠进行皮下注射免疫，注射量0.5ml/只。免疫量0.5ml，30μg rhTF₂₄₃/只，注射完毕后用酒精棉球消毒注射部位，防止感染。

加强免疫：两周后，取储存于缓冲液中的rhTF₂₄₃稀释至60μg/ml，按照1∶1的体积比与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂充分乳化混合，以酒精棉球消毒BALB/c小鼠右腹部，吸取乳化液进行腹腔注射免疫，免疫量0.5ml，15μg rhTF₂₄₃/只，注射完毕后用酒精棉球消毒注射部位，防止感染。

二次加强免疫：两周后，取储存于缓冲液中的rhTF₂₄₃稀释至60μg/ml，按照1∶1的体积比与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂充分乳化混合，以酒精棉球消毒BALB/c小鼠右腹部，吸取乳化液进行腹腔注射免疫，免疫量0.5ml，15μg rhTF₂₄₃/只，注射完毕后用酒精棉球消毒注射部位，防止感染。

融合前冲击免疫：二次加强免疫一周后，取储存于缓冲液中的rhTF₂₄₃，稀释至100μg/ml，按照1∶1的体积比与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂充分乳化混合，以酒精棉球消毒BALB/c小鼠右腹部，吸取乳化液进行腹腔注射免疫，免疫量0.5ml，25μg rhTF₂₄₃/只，注射完毕后用酒精棉球消毒注射部位，防止感染。

3、细胞融合及克隆化

免疫冲击后第三天，取免疫小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞进行细胞融合，具体操作如下：

1)取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。

2)将免疫小鼠拉颈处死，75％酒精中浸泡消毒5min，分别取胸腺细胞(饲养细胞)和脾脏，脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，取注射器冲洗脾脏获得脾细胞悬液；

3)分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清，脾细胞以DMEM高糖培养基重悬，胸腺细胞以HAT选择培养基重悬后100μl/孔，铺96孔培养板；

4)取对数生长期的鼠骨髓瘤细胞SP2/0，与脾细胞以1∶5或1∶10的比例混合，在50ml离心管内用不完全培养液洗涤一次，将两种细胞液混匀后，以1200rpm离心8min；

5)弃去上清，使两种细胞充分混合；

6)在1min内加入1ml的PEG1500，再1min内加入1ml的DMEM，边加边转动离心管，继续在1min内加入4ml的DMEM，边加边转动离心管，最后在1min内加入20ml的DMEM，边加边转动离心管；

7)将液体以1200rpm离心8min，加入适量含20％胎牛血清的HAT轻轻混悬；

8)根据所用96孔板数量补加培养液，分装到制备的饲养细胞96孔板(100μl/孔)中，或按每2×10⁷个脾淋巴细胞加入10mlHAT培养液的比例补加培养液，置37℃ CO₂箱中培养；

9)培养5天后，用HAT培养基半量换液，7～10天后用HT培养基换液，14天后用普通完全培养基培养，待杂交瘤细胞长至孔底面积1/3时，采用ELISA法检测，阳性孔经三次有限稀释克隆化后保留一株最佳杂交瘤细胞株，即抗人重组组织单克隆抗体杂交瘤株。

4、酶联免疫法进行血清效价测定及杂交瘤筛选

血清效价及杂交瘤筛选中的酶联免疫方法如下：选取96孔酶标板，pH9.6碳酸盐缓冲液包被rhTF₂₄₃(10μg/ml，100μl/孔)，4℃保存过夜后加明胶封闭。甩干后依次加稀释血清或杂交瘤培养上清、1000的酶标二抗，最后加底物邻苯二胺终止反应。492nm酶标仪测定。PBS为阴性对照，PBSTB为阳性对照。

实施例2

不同接种密度抗人重组组织因子单克隆抗体腹水的制备

1、杂交瘤细胞准备

选择实施例1中获得的抗人重组组织单克隆抗体杂交瘤，经DMEM高糖细胞培养基常规扩大培养后待用。

2、实验动物的选择及预处理

选择14周龄、雌性、经产BALB/c小鼠，以液体石蜡作为致敏剂，接种杂交瘤细胞株一周前致敏，0.5ml/只。

3、接种杂交瘤细胞株

将杂交瘤细胞株经组织培养瓶细胞传代培养，待细胞生长至对数期计数后收集(1000rpm，6min，离心去上清)，利用无血清基础培养基(避免引入牛抗)重悬调整细胞至不同的接种浓度后接种。不同杂交瘤细胞株接种密度腹水生产结果见表1。

表1不同接种密度小鼠腹水产量及抗体效价

4、腹水的收集及处理

杂交瘤细胞株接种后10～12d密切注意，约10d左右，小鼠腹部有明显的隆起，待到小鼠濒临死亡时，拉颈处死，仰卧固定于超净台中的鼠架上，75％酒精处理后，用无菌眼科剪小心暴露腹膜，用一次性注射器将腹水迅速吸至细胞离心管中，3000rpm离心15min，-20℃保存。

5、单克隆抗体的提取和纯化

腹水离心处理后，上清液经硫酸铵沉淀及蛋白G柱层析方法纯化后于-20℃保存。

6、单克隆抗体的初步鉴定

6.1SDS-PAGE分析

3％浓缩胶、80V稳压；12％分离胶、120V稳压(见图1)。

6.2蛋白免疫印迹(Wester Blot)分析

取rhTF₂₄₃ 30μg作12％SDS-PAGE后，电转移至NC膜，一抗为1∶1500倍稀释的纯化mAb，二抗为1∶2000倍稀释的羊抗鼠IgG/HRP，ECL检测(见图2)。

实施例3

不同处理组抗人重组组织因子单克隆抗体腹水的制备

选择实施例1中获得的抗人重组组织单克隆抗体杂交瘤，常规扩大培养后待用。

选择同批购入的14周龄BALB/c小鼠21只，雌、雄、雌性经产鼠各7只，分为3组。接种杂交瘤细胞株一周前以液体石蜡致敏，0.5ml/只。一周后接种相同密度(5×10⁵个/ml)的杂交瘤株细胞悬液，小鼠呈濒死状时采集腹水。

腹水生产结果见表2.

表2不同处理组小鼠腹水产量及抗体效价

实施例4

不同周龄小鼠抗人重组组织因子单克隆抗体腹水的制备

选择实施例1中获得的抗人重组组织单克隆抗体杂交瘤，常规扩大培养后待用。

选取同批购入的雌性经产BALB/c小鼠25只，随机分为5组，从14周龄开始，每隔2周选一组小鼠接种相同密度(5×10⁵个/ml)杂交瘤株细胞悬液，小鼠呈濒死状时采集腹水。

腹水生产结果见表3.

表3不同周龄小鼠腹水产量及抗体效价