一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法

摘要

本发明提供了一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为：采集被测者口腔粘膜样本，抽提基因组DNA，基因分型和结果分析。本发明所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。本发明2个位点的基因分型采用TaqMan-MGB技术进行分型。经实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法，用于检测CCND1和STK15基因的变异，属于分子生物学技术领域。

背景技术

大样本量中国人群研究证实，细胞周期素CCND1和丝氨酸/苏氨酸激酶STK15基因的变异在中国人群众普遍存在。以往的检测方法在对CCND1和STK15基因进行检测时出现的假阳性现象无法很好的排查和解释。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确率高的细胞周期调节相关基因的基因型检测方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤1.检测的样品类型与采样方法：

用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；

步骤2.基因组DNA的抽提方法：

采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时一2.5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；

步骤3，荧光定量PCR反应：

将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，同时检测2个位点，即细胞周期素(CCND1)rs9344和丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)s2273535，并增设2个不含DNA模版的NTC空白对照孔；

在每一个反应孔中加入荧光定量PCR反应体系，其总体积为10μl，即2μl浓度为20ng/μl的DNA模板、1μl10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl浓度为25mM的合成DNA的四种脱氧核苷酸底物d NTP、0.5μl浓度为25mM的氯化镁溶液、0.02μl浓度为5units/μl的Taq DNA聚合酶、5.43μl去离子水、0.225μl浓度为20μM的正向引物、0.225μl浓度为20μM的反向引物、0.25μl浓度为10μM的VIC荧光探针和0.25μl浓度为10μM的FAM荧光探针，其中，2个位点的正向引物、反向引物、带VIC荧光A型探针以及带FAM荧光G型探针如下：

细胞周期素(CCND1)SEQ ID NO1：Rs9344：

带VIC荧光A型探针：ACCCaGTAAGTGA

带FAM荧光G型探针：ACCCgGTAAGTGA

正向引物：TGGTGGCCGCAGTGCAAGGC

反向引物：TTGGCACCAGCCTCGGCATT

丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)SEQ ID NO2：Rs2273535：

带VIC荧光A型探针：AAaTTGCTGAGT

带FAM荧光T型探针：AAtTTGCTGAGT

正向引物：AGAATTTGAAGGACACAAGA

反向引物：TGCCAGAAAGTTTATTTTCT

将反应孔和空白对照孔在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟，反应结束，取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到细胞周期素(CCND1)rs9344、丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)s2273535两张图；

步骤4：SNP基因型分析：

将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的2个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；

(1)、细胞周期素(CCND1)rs9344

在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AG基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；

(2)、丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)rs2273535

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AT基因型、坐标轴右下区域点为TT基因型(该基因型在中国人群中频率很低)。

本发明所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。本发明2个位点的基因分型分别采用PCR技术及-MGB技术进行分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。本发明增加了一对内参因物的设计避免了假阳性现象，同时适用于大样本量的基因分型检测。

本发明的优点是：检测准确率高，可重复性强。

附图说明

图1为细胞周期素(CCND1)SEQ ID NO1：Rs9344基因分型图；

图2为丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)SEQ ID NO2：Rs2273535基因分型图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例

一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法：

步骤1.检测的样品类型与采样方法：

用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；

步骤2.基因组DNA的抽提方法：

采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时-2.5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；

步骤3，荧光定量PCR反应：

将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，同时检测2个位点，即细胞周期素(CCND1)rs9344、丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)s2273535，并增设2个不含DNA模版的NTC空白对照孔；

在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABIMGB、0.1μl 25mMd NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM氯化镁溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、去离子水5.43μl、2个位点分别采用不同的正向引物(20μM，0.225μl)、反向引物(20μM，0.225μl)、VIC荧光探针(10μM，0.25μl)和FAM荧光探针(10μM，0.25μl)工具进行检测(详见下表)；

将反应孔和空白对照孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟，反应结束，取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到细胞周期素(CCND1)rs9344、丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)s2273535两张图；

步骤4：SNP基因型分析：

将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的2个表和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；如图1所示，为细胞周期素(CCND1)SEQ ID NO1：Rs9344基因分型图；如图2所示，为丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)SEQ ID NO2：Rs2273535基因分型图。

(1)、细胞周期素(CCND1)rs9344

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AG基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；

(2)、丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)rs2273535

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AT基因型、坐标轴右下区域点为TT基因型(该基因型在中国人群中频率很低，上图30个样本中未检出该基因型)。

步骤5：被测者检测报告如下表：

位点序列的确定：

根据文献提供的位点序列信息和rs号，在NCBI SNP数据库中进行检索比对，获得以上3个位点的参考序列如下：

1.CCND1 Pro241Pro Rs9344

ACAGCCTCCT TCCCTCTCTC CTTCTGCCTC AGATGTGAAG TTCATTTCCA 50

ATCCGCCCTC CATGGTGGCA GCGGGGAGCG TGGTGGCCGC AGTGCAAGGC 100

CTGAACCTGA GGAGCCCCAA CAACTTCCTG TCCTACTACC GCCTCACACG 150

CTTCCTCTCC AGAGTGATCA AGTGTGACCC                       180

A/G                                                    SNP

GTAAGTGAGG GTGATGTCCC AGGCAGCCTT GCCGGGGCTT ACAGGGGGAG 230

ACACCTAGTG CCACGGAAAT GCCGAGGCTG GTGCCAAGGC CCCCAAGGGT 280

GACAAGGTTG GGGCTGGGGC TGGGCCCCTC GGACCCCAGG CCACAGACTG 320

ACAGGGCACC GGCTTCTTCC ACTGCTCCTA                       350

2、STK15   Arg194Trp  Rs2273535

GATGGCAGGG GCTGCTTGCT CTTTTGGGTG TTATTCAGTG GCCTGGAGAC 50

AGGATGAGGT ACACTGGTTG CCTGCAATTG CTTCTGCTTC TGATTCTGAA 100

CCGGCTTGTG ACTGGAGACA AGCTTTTGTG CTTGCAAAGG AATGCGCTGG 150

GAAGAATTTG AAGGACACAA GACCCGCTGA GCCTGGCCAC TATTTACAGG 200

TAATGGATTC TGACAAGGAA                                  220

A/T                                                    SNP

TTGCTGAGTC ACGAGAACAC GTTTTGGACC TCCAACTGGA GCTGTAGCCT 270

AGAATGGAAG AGAAAATAAA CTTTCTGGCA TTCATGAAAG CAAAAGATGA 320

ATATATTGAG AATTTCACAA AGTTTGTTCT CTAGTATAGC AAAATAATGA 370

ATGTCACTGA TAAGAGATGG AAGGTGAAAA                       400

序列表

<110>上海中优医药高科技有限公司

<120>一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法

<160>10

<210>1

<211>360

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>mutation

<222>(181)

<223>n＝a或g

<400>1

acagcctcct tccctctctc cttctgcctc agatgtgaag ttcatttcca atccgccctc 60

catggtggca gcggggagcg tggtggccgc agtgcaaggc ctgaacctga ggagccccaa 120

caacttcctg tcctactacc gcctcacacg cttcctctcc agagtgatca agtgtgaccc 180

ngtaagtgag ggtgatgtcc caggcagcct tgccggggct tacaggggga gacacctagt 240

gccacggaaa tgccgaggct ggtgccaagg cccccaaggg tgacaaggtt ggggctgggg 300

ctgggcccct cggaccccag gccacagact gacagggcac cggcttcttc cactgctcct 360

<210>2

<211>400

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>mutation

<222>(221)

<223>n＝a或t

<400>2

gatggcaggg gctgcttgct cttttgggtg ttattcagtg gcctggagac aggatgaggt 60

acactggttg cctgcaattg cttctgcttc tgattctgaa ccggcttgtg actggagaca 120

agcttttgtg cttgcaaagg aatgcgctgg gaagaatttg aaggacacaa gacccgctga 180

gcctggccac tatttacagg taatggattc tgacaaggaa nttgctgagt cacgagaaca 240

cgttttggac ctccaactgg agctgtagcc tagaatggaa gagaaaataa actttctggc 300

attcatgaaa gcaaaagatg aatatattga gaatttcaca aagtttgttc tctagtatag 360

caaaataatg aatgtcactg ataagagatg gaaggtgaaa                       400

<210>3

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>带VIC荧光A型探针，与CCND1 rs9344SNP位点结合。

<400>3

acccagtaag tga 13

<210>4

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>带FAM荧光T型探针，与CCND1rs9344SNP位点结合。

<400>4

aatttgctga gt 12

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于CCND1rs9344SNP序列扩增的正向引物。

<400>5

tggtggccgc agtgcaaggc 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于CCND1rs9344SNP序列扩增的反向引物。

<400>6

ttggcaccag cctcggcatt  20

<210>7

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>带VIC荧光A型探针，与STK15rs2273535SNP位点结合。

<400>7

aaattgctga gt 12

<210>8

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>带FAM荧光G型探针，与STK15rs2273535SNP位点结合。

<400>8

acccggtaag tga 13

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于STK15rs2273535SNP序列扩增的正向引物。

<400>9

agaatttgaa ggacacaaga  20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于STK15rs2273535SNP序列扩增的反向引物。

<400>10

tgccagaaag tttattttct  20