中药复方大青叶制剂的制备方法、质量控制方法和应用

摘要

本发明涉及复方大青叶制剂的制备和质量控制方法。制备方法包括主药配制和制备相应制剂两步，其主药配制中主药重量组分配比是，大青叶360～440份，山银花或金银花180～220g份，羌活90～110份，拳参90～110份，大黄90～110份；以上诸味药材，加常规量水煎煮两次，每次1h；合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至60℃时相对密度1.08～1.32；加乙醇使含醇量达50～60％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至60℃时相对密度1.17～1.43的清膏，备用；按药品规范备相应制剂。质量控制方法是内容物的鉴别和含有成分的含量测定；含大青叶的鉴别；山银花或金银花的鉴别；大黄的鉴别；羌活的鉴别；大黄中大黄素与大黄酚总含量的测定和绿原酸的含量测定；它们在制备治疗感冒、流感、腮腺炎、急性病毒性肝炎药物制剂中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的制备和质量控制方法，具体涉及复方大青叶制剂的制备和质量控制方法。

背景技术

复方大青叶制剂是一种已经上市的中药复方制剂，具有疏风清热，解毒消肿，凉血利胆的作用。临床上主要用于感冒发热头痛，咽喉红肿，耳下肿痛，胁痛黄疸等症，以及流感、腮腺炎、急性病毒性肝炎见有上述症状者。但现有复方大青叶制剂标准落后，含蔗糖量高达46％，质量控制指标较少，仅有靛玉红、绿原酸、大黄鉴别项，没有全面的含量测定的内容。即现有技术的质量控制方法不能有效控制复方大青叶制剂的质量，从而将影响产品的生产和保证质量。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种改进的复方大青叶制剂的制备方法和质量可控的质量控制方法。

本发明的技术方案是：

研制一种中药复方大青叶制剂的制备方法，包括主药配制和制备相应制剂两步，其特征是：

(1)主药配制

主药重量组分配比是，大青叶360～440份，山银花或金银花180～220g份，羌活90～110份，拳参90～110份，大黄90～110份；

以上诸味药材，加常规量水煎煮两次，每次1h；合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至60℃时相对密度1.08～1.32；加乙醇使含醇量达50～60％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至60℃时相对密度1.17～1.43的清膏，备用；

(2)制备相应制剂

①制备口服液

向上步清膏加2～3倍水，搅匀，冷藏≥12h，滤过，滤液加热煮沸0.5h，待温度降至60℃时，加入防腐剂，冷藏≥12h，滤过；添加矫味剂，搅匀，制得药物原液，备用；

添加剂的重量配比是：主药总量∶防腐剂∶矫味剂＝1∶0.003～0.004∶0.14～0.16；

娇味剂中，蔗糖∶非营养性或低热值矫味剂＝1∶0.04～0.05，

非营养性或低热值矫味剂从木糖醇，赤藓糖醇，甘草酸，甜蜜素或甜菊苷中选择；

配量蔗糖加水煮沸制成糖浆，再加入非营养性或低热值矫味剂使溶解，与药物原液合并，搅匀；加水至总体积1000份，按药品规格灌装，灭菌，即得；

②制备颗粒剂

上步清膏≤100℃干燥并制成细粉，按制药常规加适宜药用辅料，混匀并制成颗粒，上述配量可制得颗粒1000份，按药品规格包装，密封，即得；

③制备片剂

上步清膏≤100℃干燥并制成细粉，按制药常规加适宜药用辅料，混匀并制成颗粒，压片，包糖衣或薄膜衣，上述配量可制得片剂1000片，按药品规格包装，密封，即得；

④制备胶囊剂

上步清膏并制成细粉，按制药常规加适宜药用辅料，混匀并制成颗粒，填充于空胶囊内，上述配量可制得胶囊剂1000粒，按药品规格包装，密封，即得；

⑤制备丸剂

上步清膏≤100℃干燥并制成细粉，添加适宜药用辅料，按制药常规加水或蜂蜜和水为黏合剂混匀并制成球形或类球形丸剂，≤80℃干燥；包糖衣或薄膜衣，上述配量可制得丸剂1000粒，按药品规格包装，密封，即得。

上述的中药复方大青叶制剂的制备方法，其特征是主药重量组分配比是，大青叶380～420份，山银花或金银花190～210g份，羌活95～105份，拳参95～105份，大黄95～105份。

上述的中药复方大青叶制剂的质量控制方法，其特征是所述的质量控制方法主要是内容物的鉴别和含有成分的含量测定：

A.内容物的鉴别的步骤

(1)大青叶的鉴别

取样量：口服液10ml；或相应生药量的颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂；

口服液直接用于乙酸乙酯或三氯甲烷提取；其他剂型先用水10ml溶解后再同法操作；

取口服液10ml，用乙酸乙酯或三氯甲烷提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯或三氯甲烷提取液，用1％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次10ml，乙酸乙酯或三氯甲烷液置水浴上蒸干，残渣加乙酸乙酯或三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加乙酸乙酯或三氯甲烷制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液5～10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以5∶4∶1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮的混合液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；

(2)山银花或金银花的鉴别

取样量：口服液10ml；或相应生药量的颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂；

口服液直接用于按下述步骤进行；其他剂型先用水10ml溶解后，加盐酸调PH值，再同法操作；

取口服液10ml，加盐酸2～4滴，使溶液PH值为1～2，用乙酸乙酯或三氯甲烷提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯或三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加水10ml，分次溶解，用氨试液调PH值为7.0～7.5，加于聚酰胺柱，湿法装柱，柱长20cm，内径15～20mm，用氨试液调PH值为7.0～7.5的水溶液40ml洗脱，洗脱液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，必要时滤过，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液和对照品溶液各1～2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以1∶4的冰醋酸-水溶液或20∶6∶0.8三氯甲烷-甲醇-甲酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

或者取口服液10ml，加于30～60目，内径0.9cm聚酰胺柱上，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用50％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VI B薄层色谱法检验，吸取上述两种溶液各0.5～1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以20∶6∶0.8的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(3)大黄的鉴别

取样量：口服液10ml；或相应生药量的颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂；

口服液直接用于按下述步骤进行；其他剂型先用水10ml溶解后，再加盐酸调PH值；

取口服液10ml，加盐酸1ml，置水浴中加热30min，冷却后用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，同法制成对照药材溶液；再取大黄素、大黄酚对照品，加乙酸乙脂制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以15∶5∶1的30～60℃石油醚-甲酸乙脂-甲酸的上层溶液为展开剂展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光斑点；置氨气中熏，斑点变为红色；

(4)羌活的鉴别

取样量：口服液10ml；或相应生药量的颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂；

口服液直接用于按下述步骤进行；其他剂型先用水10ml溶解后，再用乙酸乙酯提取；

取口服液10ml，用乙酸乙酯或60～90℃石油醚提取4次，每次10ml，合并乙酸乙酯或60～90℃石油醚提取液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取羌活对照药材1g，加乙醇30ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5～8μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10∶2∶3的乙酸乙酯-甲醇-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

或2∶1∶1的正己烷-苯-乙酸乙酯混合溶剂为展开剂；或4∶1的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂为展开剂；展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

B.对含有的成分按照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法进行含量测定的步骤

1、大黄中大黄素与大黄酚总含量的测定方法

(1)色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；85∶15的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长254nm；理论板数按大黄素、大黄酚峰计算均不得低于4000；

(2)对照品溶液的制备

精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，加流动相制成每1ml含大黄素30μg、含大黄酚50μg的混合对照品溶液，备用；

(3)供试品溶液的制备

精密吸取本品5ml，加盐酸1ml，氯仿30ml，加热回流30min，放冷，分取氯仿层，水层用氯仿强力振摇提取3次，每次30ml，合并氯仿提取液，水浴蒸干，残渣加流动相使溶解，定容至10ml量瓶中，摇匀，滤过，备用；

(4)测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品每1ml含大黄以大黄素(C₁₅H₁₀O₅)与大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)之和计，不得少于0.1mg；

2、绿原酸的含量测定方法

(1)色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；15∶85的甲醇-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长324nm；理论板数按绿原酸峰计算，不得低于3000；

(2)对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的对照品溶液，10℃以下保存；

(3)供试品溶液的制备

精密吸取本品1ml，置50ml棕色量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，备用；

(4)测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1ml含绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)不得少于0.6mg。

4.按照权利要求1或2所述的中药复方大青叶制剂的应用，其特征是在制备治疗感冒、流感、腮腺炎、急性病毒性肝炎药物制剂中的应用。

为有效控制产品质量，我们建立了新的复方大青叶制剂的质量控制方法，该方法首先降低了制剂的含糖量，并采用薄层色谱法对其中的成分进行鉴别，采用高效液相色谱法对其中的成分进行含量测定。

截止目前，尚未发现对该产品质量标准进行全面研究的报道，仅有个别研究者对其中的绿原酸或大黄作过单独研究。

本发明的优点是：

1.制法中减少蔗糖含量，由46％减少到15％，既节约资源，降低生产成本，又符合现代人健康生活要求。

2.该质量控制方法全面，精密度、灵敏度、稳定性均好，而且方法更简捷，能保证产品质量稳定可控。

3.功能主治与用法、用量等同现有技术，便于推广应用。

以上复方大青叶配方组成是按重量配比的，大规模生产可以以公斤为单位，或以吨为单位。

以上组成可制成药物制剂1000剂，所述1000剂指，制成的成品药物制剂，如制成液体制剂1000ml，胶囊制剂或丸剂1000粒，片剂1000片，颗粒剂1000g等，

附图说明

图1是实施例1的大黄素对照品面积归一化高效液相图谱；

图2是实施例1的大黄酚对照品面积归一化高效液相图谱；

图3是实施例1的大黄素标准曲线；

图4是实施例1的大黄酚标准曲线；

图5是实施例1的阴性对照试验-大黄素、大黄酚对照品高效液相色谱图；

图6是实施例1的阴性对照试验-阴性样品全程高效液相色谱图；

图7是实施例1的阴性对照试验-大黄药材全程高效液相色谱图；

图8是实施例1的阴性对照试验-样品全程高效液相色谱图；

图9是实施例1的阴性对照试验-绿原酸对照品高效液相色谱图；

图10是实施例1的阴性对照试验-阴性样品高效液相色谱图；

图11是实施例1的阴性对照试验-样品高效液相色谱图；

图12是实施例1绿原酸对照品标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明进一步阐述。

图1中，对照品：大黄素对照品购自中国药品生物制品检定所，包装20mg，批号：110756-200110)。面积归一化法测定，本品纯度为100％。

图2中，对照品：大黄酚对照品购自中国药品生物制品检定所，包装20mg，批号：110796-200110)。面积归一化法测定，本品纯度为100％。

图3、图4分别为大黄素、大黄酚的标准曲线。纵坐标为峰面积，横坐标为进样量，结果显示大黄素在0.340μg～1.700μg范围内，大黄酚在0.380μg～1.900μg范围内，峰面积值与进样量有良好的线性关系。

图5是阴性对照试验一大黄素、大黄酚对照品高效液相色谱图；

图6是除去大黄药材的阴性样品全程高效液相色谱图；

图7是大黄药材全程高效液相色谱图；

图8是样品全程高效液相色谱图；

图9是绿原酸对照品高效液相色谱图；

图10是不含山银花的阴性样品高效液相色谱图；

图11是样品高效液相色谱图；

图12是绿原酸的标准曲线。纵坐标为峰面积，横坐标为进样量，结果显示绿原酸在0.20μg～0.80μg范围内，峰面积值与进样量有良好的线性关系。

实施例1

(1)主药配制

主药配比：大青叶360g，山银花180g，羌活100g，拳参90g，大黄100g。

以上诸味药材，加常规量水煎煮两次，每次1h；合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至60℃时相对密度1.08～1.32；加乙醇使含醇量达50～60％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至60℃时相对密度1.17～1.43的清膏，备用；

(2)制备口服液

向上步清膏加2～3倍水，搅匀，冷藏≥12h，滤过，滤液加热煮沸0.5h，待温度降至60℃时，加入防腐剂，冷藏≥12h，滤过；添加矫味剂及糖浆，搅匀，制得药物原液，备用；

添加剂的重量配比是：主药总量∶防腐剂∶甜味剂＝1∶0.003～0.004∶0.14～0.16；

甜味剂中，蔗糖∶非营养性或低热值矫味剂＝1∶0.04～0.05，

非营养性或低热值矫味剂从木糖醇，赤藓糖醇，甘草酸，甜蜜素或甜菊苷中选择；

配量蔗糖加水煮沸制成糖浆，再加入非营养性或低热值矫味剂使溶解，与药物原液合并，搅匀；加水至总体积1000份，按药品规格灌装，灭菌，即得；

(3)内容物的鉴别和含有成分的含量测定：

A1.内容物的鉴别的步骤

(1)大青叶的鉴别

取口服液10ml，用乙酸乙酯或三氯甲烷提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯或三氯甲烷提取液，用1％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次10ml，乙酸乙酯或三氯甲烷液置水浴上蒸干，残渣加乙酸乙酯或三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加乙酸乙酯或三氯甲烷制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液5～10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以5∶4∶1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮的混合液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；

(2)山银花的鉴别

取口服液10ml，加盐酸2～4滴，使溶液PH值为1～2，用乙酸乙酯或三氯甲烷提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯或三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加水10ml，分次溶解，用氨试液调PH值为7.0～7.5，加于聚酰胺柱，湿法装柱，柱长20cm，内径15～20mm，用氨试液调PH值为7.0～7.5的水溶液40ml洗脱，洗脱液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，必要时滤过，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液和对照品溶液各1～2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以1∶4的冰醋酸-水溶液或20∶6∶0.8三氯甲烷-甲醇-甲酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

或者取本品10ml，加于聚酰胺柱(30～60目，3g，内径0.9cm)上，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用50％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)检验，吸取上述两种溶液各0.5～1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(20∶6∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)大黄的鉴别

取样量：口服液10ml；或相应生药量的颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂；

口服液直接用于按下述步骤进行；其他剂型先用水10ml溶解后，再加盐酸调PH值。

取口服液10ml，加盐酸1ml，置水浴中加热30min，冷却后用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，同法制成对照药材溶液；再取大黄素、大黄酚对照品，加乙酸乙脂制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以15∶5∶1的30～60℃石油醚-甲酸乙脂-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光斑点；置氨气中熏，斑点变为红色；

(4)羌活的鉴别

取样量：口服液10ml；或相应生药量的颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂；

口服液直接用于按下述步骤进行；其他剂型先用水10ml溶解后，再用乙酸乙酯提取。

取口服液10ml，用乙酸乙酯或60～90℃石油醚提取4次，每次10ml，合并乙酸乙酯或60～90℃石油醚提取液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取羌活对照药材1g，加乙醇30ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5～8μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10∶2∶3的乙酸乙酯-甲醇-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

或用2∶1∶1的正己烷-苯-乙酸乙酯混合溶剂为展开剂；或用4∶1的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂为展开剂；展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

或A2.内容物鉴别步骤的筛选

(1)大青叶的鉴别

方法1

供试品溶液的制备取口服液10ml，用乙酸乙酯提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯提取液，用1％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次10ml，乙酸乙酯液置水浴上蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；

对照品溶液的制备取靛玉红对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液。

阴性溶液的制备将处方中的大青叶除去，其他四味按实施例1中的制法项进行制备阴性对照样品；然后照供试品溶液的制备方法同法制备。

展开剂：甲苯-乙酸乙酯-丙酮(5∶4∶1)

显色与检视不需要显色剂，晾干日光下检视。

结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点，阴性对照无干扰。

方法2

供试品溶液的制备取口服液10ml，用三氯甲烷提取2次，每次10ml，合并三氯甲烷提取液，用1％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次10ml，三氯甲烷液置水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；

对照品溶液的制备取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液。

其他操作同方法1

结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点，阴性对照无干扰。

(2)山银花或金银花的鉴别

方法1

供试品溶液的制备取口服液10ml，加盐酸2～4滴，使溶液PH值为1-2，用乙酸乙酯提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液蒸干，残渣加水10ml，分次溶解，用氨试液调PH值为7.0～7.5，加于聚酰胺柱(湿法装柱，柱长20cm，内径15-20mm)上，用以氨试液调PH值为7.0～7.5的水溶液40ml洗脱，洗脱液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解(必要时滤过)，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

阴性溶液的制备将处方中的山银花除去，其他四味按实施例1中的制法项进行制备阴性对照样品；然后照供试品溶液的制备方法同法制备。

展开剂：冰醋酸-水溶液(1∶4)

显色与检视不需要显色剂，晾干，紫外灯(365nm)下检视；放置2小时后观察，效果更佳。

结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。

方法2

供试品溶液的制备取口服液10ml，加盐酸2～4滴，使溶液PH值为1-2，用三氯甲烷提取3次，每次20ml，三氯甲烷液，蒸干，残渣加水10ml，分次溶解，用氨试液调PH值为7.0～7.5，加于聚酰胺柱(湿法装柱，柱长20cm，内径15-20mm)上，用以氨试液调PH值为7.0～7.5的水溶液40ml洗脱，洗脱液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解(必要时滤过)，作为供试品溶液。

其他操作同方法1.

结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。

方法3

供试品溶液的制备取口服液10ml，加于聚酰胺柱(30～60目，3g，内径0.9cm)上，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用50％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.5～1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(20∶6∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

展开剂：三氯甲烷-甲醇-甲酸(20∶6∶0.8)。

其他操作同方法1.

结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。

(3)大黄的鉴别

供试品溶液的制备取样量：口服液10ml；或相应生药量的颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂；

口服液直接用于按下述步骤进行；其他剂型先用水10ml溶解后，再加盐酸调PH值。

取本品10ml，加盐酸1ml，置水浴中加热30min，冷却后用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，同供试品溶液制备法制成对照药材溶液。

对照品溶液的制备取大黄素对照品、大黄酚对照品，加乙酸乙酯制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。

阴性溶液的制备将处方中的大黄除去，其他四味按质量标准中的制法项进行制备阴性对照样品；然后照供试品溶液的制备方法同法制备。

展开剂石油醚(30～60℃)-甲酸乙脂-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液

显色与检视不需要显色剂，晾干，紫外灯(365nm)下检视；置氨气中熏后日光下检视。

结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光斑，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨气中熏，斑点变为红色。阴性对照无干扰。

(4)羌活的鉴别

方法1

供试品溶液的制备取本品10ml，用乙酸乙酯提取4次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备取羌活对照药材1g，加乙醇30ml，浸渍1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。

阴性溶液的制备将处方中的羌活除去，其他四味按质量标准中的制法项进行制备阴性对照样品；然后照供试品溶液的制备方法同法制备。

展开剂乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶3)的上层溶液。

显色与检视不需要显色剂，晾干，紫外灯(365nm)下检视。

结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。阴性对照无干扰。

方法2

供试品溶液的制备取本品10ml，用60～90℃石油醚提取4次，每次10ml，合并60～90℃石油醚液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

其他操作同方法1.

结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。阴性对照无干扰。

B1.对含有的成分进行含量测定的步骤

1、大黄中大黄素与大黄酚总含量的测定

(1)仪器与试药

仪器：美国戴安高效液相色谱仪，CREATE科瑞Venus-C₁₈-5μ色谱柱P680泵UVD170紫外检测器CHROMELEON数据处理软件Startorius BP211D电子分析天平d＝0.01mg；

试剂：甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯；

对照品：大黄素对照品购自中国药品生物制品检定所，包装20mg，批号110756～200110；

(2)测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1％磷酸溶液(85∶15)为流动相；检测波长254nm。理论板数按大黄素、大黄酚峰计算均应不得低于4000。

对照品溶液的制备精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，加流动相制成每1ml含大黄素30μg、含大黄酚50μg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备精密吸取本品5ml，加盐酸1ml，氯仿30ml，加热回流30min，放冷，分取氯仿层，水层用氯仿强力振摇提取3次，每次30ml，合并氯仿液，水浴蒸干，残渣加流动相使溶解，定容至10ml量瓶中，摇匀，滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1ml含大黄以大黄素(C₁₅H₁₀O₅)与大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)之和计，不得少于0.1mg。

2、绿原酸的含量测定：

(1)仪器与试药

仪器：美国戴安高效液相色谱仪，CREATE科瑞Venus-C₁₈-5μ色谱柱P680泵UVD170紫外检测器CHROMELEON数据处理软件Startorius BP211D电子分析天平d＝0.01mg；

试剂：甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯；

对照品：绿原酸购自中国药品生物制品检定所，包装20mg，批号110753～200413；

(2)测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液(15∶85)为流动相；检测波长324nm。理论板数按绿原酸峰计算，应不得低于3000。

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的对照品溶液(10℃以下保存)。

供试品溶液的制备精密吸取本品1ml，置50ml棕色量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1ml含绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)不得少于0.6mg。

本发明的方法是经过筛选得到的，筛选过程说明如下：

B2大黄素与大黄酚总含量及绿原酸含量测定方法的筛选

(1)仪器与试药

仪器：美国戴安高效液相色谱仪，CREATE科瑞Venus-C₁₈-5μ色谱柱P680泵UVD170紫外检测器CHROMELEON数据处理软件startorius BP211D电子分析天平d＝0.01mg

试剂：甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

对照品：大黄素对照品(中国药品生物制品检定所，20mg，110756～200110)。归一化法测定，本品纯度为100％。(参见附图1)

大黄酚对照品(中国药品生物制品检定所，20mg，110796～200412)。归一化法测定，本品纯度为100％。(参见附图2)

(2)色谱条件的选择

1)检测波长的确定：根据《中国药典》2005版一部17页大黄药材含量测定项下的规定，确定检测波长为：254nm.

2)流动相的选择：采用美国戴安高效液相色谱仪，P680泵UVD170紫外检测器，流速1ml/min。流动相曾试用以下几个系统：

甲醇-0.1％磷酸溶液(85∶15)

结果：大黄素保留时间为10.0min，大黄酚保留时间为15.6min，对照品及样品峰形良好；

甲醇-水(92∶8)

结果：大黄素保留时间为4.4min，大黄酚保留时间为5.9min，对照品及样品均出现拖尾，峰形评价一般。

通过以上试验结果可知：用甲醇-0.1％磷酸溶液(85∶15)系统时对照品及样品峰形良好，故选择流动相为：甲醇-0.1％磷酸溶液(85∶15)。

(3)提取条件的选择

1)提取方法的选择：吸取060302批样品，分别照以下方法进行提取：

方法一：精密吸取本品5ml，加乙醇50ml回流提取30min，倾取乙醇液，水浴蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，水浴温浸(80℃)30min，放冷，用乙醚萃取3次，每次30ml，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加流动相使溶解，定容至10ml量瓶中，摇匀，滤过，即得。

方法二：精密吸取本品5ml，加盐酸1ml，氯仿30ml，加热回流30min，放冷，分取氯仿层，水层用氯仿强力振摇提取3次，每次30ml，合并氯仿液，水浴蒸干，残渣加流动相使溶解，定容至10ml量瓶中，摇匀，滤过，即得。

方法三：精密吸取本品5ml，加盐酸1ml，用乙醚强力振摇提取3次，每次50ml，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加流动相使溶解，定容至10ml量瓶中，摇匀，滤过，即得。

分别吸取以上样品液各20μl注入液相色谱仪测其含量，结果见下表：

表-1提取方法选择结果表

结果表明：以方法二提取样品时总含量最高，故选方法二为提取方法，但对方法中各步骤仍需进一步细化与优选。

2)水解时间的选择：大黄中的活性成分主要为蒽醌类，常以甙的形式存在，甙类化合物易在酸性条件下加热可水解成甙元，为考察大黄中甙类水解是否完全，取060301批样品三份，分别将水解时间定为20min、30min、40min，其余操作不变，制备供试液。分别将供试液注入液相色谱仪测其含量，结果下表。

表-2提取时间选择结果表

结果表明：样品水解30min已水解完全，有效成分在30min后无明显变化，故将样品的水解时间定为30min。

3)提取次数的选择：提取次数是影响提取效果的主要因素之一，为最大程度的提取有效成分，同时节约试剂，本试验对提取次数进行了优选。取060301批样品三份，分别将水解放冷倾取氯仿后的水液提取2次，3次，4次，其余操作不变，制备供试液。分别将供试液注入液相色谱仪测其含量，结果下表。

表-3提取次数选择结果表

结果表明：样品提取3次时，有效成分已提取完全，故确定提取次数为三次。

(4)线性范围考察：取大黄素、大黄酚对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含大黄素85μg、大黄酚95μg的混合对照溶液，分别精密吸取20μl、15μl、10μl、8μl、4μl进样，测定其峰面积。结果见表4、表-5。

表-4大黄素对照品测定结果

以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，得标准曲线方程。得大黄素标准曲线方程为：Y＝50.797X-0.4352(r＝0.9998)，大黄酚标准曲线方程为：Y＝72.116X+0.4771(r＝0.9998)。以上结果表明大黄素在0.340μg～1.700μg范围内，大黄酚在0.380μg～1.900μg范围内，峰面积值与进样量有良好的线性关系(参见附图-3、图-4)。

(5)阴性对照试验：取不含大黄的阴性试制样品5ml，同“供试品溶液制备”项下，同法处理后，制得阴性对照液，分别取对照品溶液、阴性对照液、大黄药材溶液、复方大青叶合剂供试品溶液各进20μl，记录色谱图。

结果表明：在阴性对照图谱中大黄素、大黄酚峰无干扰。(参见图-5、图-6、图-7、图-8)

(6)精密度试验：吸取对照品溶液(大黄素22.8μg/ml、大黄酚50.8μg/ml)和060302批同一样品供试液分别重复进样6次，每次各20μl，分别计算两者峰面积的RSD，结果见表-6、表-7。

表-6对照品精密度试验结果

表-7供试品精密度试验结果

结果表明：对照品大黄素峰面积RSD为0.45％，大黄酚峰面积RSD为0.39％，供试品大黄素峰面积RSD为0.63％，大黄酚峰面积RSD为0.41％，对照品及供试品的精密度良好。

(7)重现性试验：取060303批的样品5份，分别按供试品制备项下制备、测定结果，总含量见表-8。

表-8重现性试验结果

结果表明：5份供试品的平均含量为1.74mg/10ml，RSD为0.70％，试验方法的重现性良好。

(8)稳定试验：取同一份供试品溶液，分别于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时，进样。结果见表-9、表-10。

表-9大黄素稳定性试验结果

表-10大黄酚稳定性试验结果

结果表明：供试品大黄素在8小时内RSD为1.16％，大黄酚在8小时内RSD为0.23％，供试品溶液在8小时内稳定性良好。

(9)回收率试验：(采用加样回收法)精密吸取060301批(已知大黄素含量为0.65mg/ml，大黄酚含量为0.110mg/ml)样品2.5ml，共称取5份，分别加入相同的大黄素、大黄酚对照品，测定总含量，计算回收率。回收率＝(总量-样品中量)/加入纯品量。结果见表-11、表-12。

表-11大黄素回收率试验结果

表-12大黄酚回收率试验结果

结果表明：大黄素平均回收率为98.9％，RSD为1.79％，大黄酚平均回收率为8.1％，RSD为0.46％，加样回收率良好。

2、绿原酸含量测定方法的筛选

(1)仪器

美国戴安高效液相色谱仪，CREATE科瑞Venus-C₁₈-5μ色谱柱P680泵UVD170紫外检测器CHROMELEON数据处理软件startorius BP211D电子分析天平d＝0.01mg

(2)试药

甲醇(色谱纯)，磷酸(分析纯)，水(重蒸馏水)；其他试剂为分析纯。

绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，20mg，10753-200212)。

(3)色谱条件及基本参数流动相：甲醇-0.4％磷酸溶液(15∶85)流速：1.000ml/min；柱温：室温；检测波长：324nm。进样量：20μl(定量环进样)；理论板数：3000～6000。

(4)检测波长的选择根据《中国药典》2005版一部405～406页“双黄连口服液”测定项下金银花的含量测定，确定检测波长为：324nm。

(5)阴性对照试验按处方不取金银花，模拟生产工艺制备复方大青叶合剂空白对照品。依法测定，空白对照品色谱图中，在与绿原酸对照品色谱相应位置处未见有显著的干扰峰。参见附图-9、图-10、图-11。

(6)供试品溶液的制备精密吸取060301批复方大青叶合剂样品1ml，分别用甲醇、50％甲醇和流动相稀释并定容至50ml，分别以微孔滤膜滤过，作为供试液，注入液相色谱仪测其含量，结果见表-13。

表-13提取溶剂选择结果表

结果标明：三提取溶剂所得样品绿原酸含量相差不大，但50％甲醇峰形较好，所以选择50％甲醇为提取溶剂。

(7)线性范围的规定取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，分别精密吸取20μl、15μl、10μl、8μl、5μl进样，测定其峰面积。结果见表14，附图-12。以峰面积(y)对进样量(x)进行回归，得标准曲线方程。y＝57.496x-0.0979(r＝0.9999)。以上结果表明在0.20μg～0.80μg范围内，绿原酸峰面积值与进样量有良好的线性关系。

表-14绿原酸对照品测定结果

(8)精密度试验吸取对照品溶液和060301批同一份样品溶液分别重复进样6次，每次各20μl，分别计算两者峰面积的RSD，结果见表-15。

表-15精密度试验结果

结果表明：对照品峰面积RSD为0.27％，供试品峰面积RSD为0.57％，精密度良好。

(9)重现性试验取060301批复方大青叶合剂，分别照已选定的方法制备供试品，测定其中绿原酸含量。试验结果见表-16：

表-16重现性试验结果

结果标明：样品的平均含量为0.7275mg/ml，RSD为1.68％，试验方法的重现性良好。

(10)加样回收率试验(采用加样回收法)精密称取060301批(已知含量为0.7275mg/ml)1ml，共称取5份，分别加入相同的绿原酸对照品，测定总含量，计算回收率。回收率＝(总量-样品中量)/加入纯品量。结果见表-17。

表-17回收率试验结果

结果表明：平均回收率为98.68％，RSD为0.68％，加样回收率良好。

3、样品测定：取本公司生产的复方大青叶合剂样品，按拟订的含量方法测定，大黄素、大黄酚总含量、绿原酸含量见表-18。

表-18复方大青叶合剂含量测定结果表

上述的中药复方大青叶制剂在制备治疗感冒、流感、腮腺炎、急性病毒性肝炎药物制剂中的应用。

【功能主治】疏风清热，解毒消肿，凉血利胆。用于感冒发热头痛，咽喉红肿，耳下肿痛，胁痛黄疸等症，及流感、腮腺炎、急性病毒性肝炎见有上述症状者。

【用法与用量】口服，一次10～20ml，一日2～3次。用于急性病毒性肝炎，一次30ml，一日3次。

实施例2制备颗粒剂

主药配比：

大青叶360g，金银花180g，羌活90g，拳参90g，大黄90g。

以上诸味药材，加常规量水煎煮两次，每次1h；合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至60℃时相对密度1.08～1.32；加乙醇使含醇量达50～60％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至60℃时相对密度1.25～1.30的清膏，备用；

(2)制备颗粒剂

上步清膏按制药常规加适宜药用辅料，混匀并制成颗粒，60℃以下干燥，上述配量可制得颗粒1000份，按药品规格包装，密封，即得。

内容物的鉴别和含有成分的含量测定：

A.内容物的鉴别的步骤

(1)大青叶的鉴别

取颗粒剂9g加10ml水溶解后，用乙酸乙酯或三氯甲烷提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯或三氯甲烷提取液，用1％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次10ml，乙酸乙酯或三氯甲烷液置水浴上蒸干，残渣加乙酸乙酯或三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加乙酸乙酯或三氯甲烷制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液；另取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液10～15μl，对照品溶液6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以5∶4∶1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮的混合液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；

(2)金银花的鉴别

取颗粒剂10g，加10ml水溶解后，加盐酸2～4滴，使溶液PH值为1～2，用乙酸乙酯或三氯甲烷提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯或三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加水10ml，分次溶解，用氨试液调PH值为7.0～7.5，加于聚酰胺柱，湿法装柱，柱长20cm，内径15～20mm，用氨试液调PH值为7.0～7.5的水溶液40ml洗脱，洗脱液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，必要时滤过，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液和对照品溶液各1～2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以20∶6∶0.8的三氯甲烷-甲醇-甲酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

或颗粒剂10g，加10ml水溶解后，加于聚酰胺柱(30～60目，3g，内径0.9cm)上，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用50％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各0.5～1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(20∶6∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)大黄的鉴别

取颗粒剂10g加10ml水溶解后，加盐酸1ml，置水浴中加热30min，冷却后用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，同法制成对照药材溶液；再取大黄素、大黄酚对照品，加乙酸乙脂制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以15∶5∶1的30～60℃石油醚-甲酸乙脂-甲酸配制混合溶剂，取其上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视及氨气熏后检视，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(4)羌活的鉴别

取颗粒剂10g加10ml水溶解后，用乙酸乙酯或60～90℃石油醚提取4次，每次10ml，合并乙酸乙酯或60～90℃石油醚提取液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取羌活对照药材1g，加乙醇30ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5～8μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以2∶1∶1的正己烷-苯-乙酸乙酯混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

B.对含有的成分进行含量测定的步骤

【含量测定】

1、大黄素与大黄酚总含量的测定

(1)仪器与试药

仪器：美国戴安高效液相色谱仪，CREATE科瑞Venus-C₁₈-5μ色谱柱P680泵UVD170紫外检测器CHROMELEON数据处理软件Startorius BP211D电子分析天平d＝0.01mg；

试剂：甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯；

对照品：大黄素对照品购自中国药品生物制品检定所，包装20mg，批号110756-200110；

(2)测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1％磷酸溶液(85∶15)为流动相；检测波长254nm。理论板数按大黄素、大黄酚峰计算均应不得低于4000。

对照品溶液的制备精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，加流动相制成每1ml含大黄素30μg、含大黄酚50μg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备精密称取本品5g，加水10ml溶解后加盐酸1ml，氯仿30ml，加热回流30min，放冷，分取氯仿层，水层用氯仿强力振摇提取3次，每次30ml，合并氯仿液，水浴蒸干，残渣加流动相使溶解，定容至10ml量瓶中，摇匀，滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含大黄以大黄素(C₁₅H₁₀O₅)与大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)之和计，不得少于0.1mg。

2、绿原酸的含量测定：

(1)仪器与试药

仪器：美国戴安高效液相色谱仪，CREATE科瑞Venus-C18-5μ色谱柱P680泵UVD170紫外检测器CHROMELEON数据处理软件Startorius BP211D电子分析天平d＝0.01mg；

试剂：甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯；

对照品：绿原酸购自中国药品生物制品检定所，包装20mg，批号110753-200413；

(2)测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液(15∶85)；或乙腈-0.4％磷酸溶液(10∶90)或甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)或甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(18∶85∶1∶0.3)为流动相；检测波长324nm。理论板数按绿原酸峰计算，应不得低于3000。

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的对照品溶液(10℃以下保存)。

供试品溶液的制备精密称取本品1.0g，置具塞三角瓶中，加50％甲醇50ml超声处理30分钟，补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)不得少于0.6mg。

照以上方法对十批样品进行了含量测定，结果如下表-19：

表-19复方大青叶颗粒含量测定结果表

其余同实施例1。

实施例3制备胶囊剂

主药配比：

大青叶300g，山银花200g，羌活100g，拳参100g，大黄100g。

以上诸味药材，加常规量水煎煮两次，每次1h；合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至60℃时相对密度1.08～1.32；加乙醇使含醇量达50～60％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至60℃时相对密度1.25～1.30的清膏，备用；

制备胶囊剂

上步清膏80℃以下真空干燥或微波干燥，粉碎成细粉，按制药常规加适宜药用辅料，混匀并制成颗粒，干燥，填充于空胶囊内，上述配量可制得胶囊剂1000粒，按药品规格包装，密封，即得。

内容物的鉴别和含有成分的含量测定：

A.内容物的鉴别的步骤

(1)大青叶的鉴别

取胶囊剂中的内容物约3g，加10ml水溶解后，用乙酸乙酯或三氯甲烷提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯或三氯甲烷提取液，用1％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次10ml，乙酸乙酯或三氯甲烷液置水浴上蒸干，残渣加乙酸乙酯或三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加乙酸乙酯或三氯甲烷制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液；另取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液10～15μl，对照品溶液6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以5∶4∶1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮的混合液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；

(2)山银花的鉴别

取胶囊剂中的内容物3g，加10ml水溶解后，加盐酸2～4滴，使溶液PH值为1～2，用乙酸乙酯或三氯甲烷提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯或三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加水10ml，分次溶解，用氨试液调PH值为7.0～7.5，加于聚酰胺柱，湿法装柱，柱长20cm，内径15～20mm，用氨试液调PH值为7.0～7.5的水溶液40ml洗脱，洗脱液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，必要时滤过，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液和对照品溶液各1～2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以20∶6∶0.8三氯甲烷-甲醇-甲酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

或取胶囊中的内容物3g，加10ml水溶解后，加于聚酰胺柱(30～60目，3g，内径0.9cm)上，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用50％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各0.5～1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(20∶6∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)大黄的鉴别

取胶囊剂中的内容物3g加10ml水溶解后，加盐酸1ml，置水浴中加热30min，冷却后用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，同法制成对照药材溶液；再取大黄素、大黄酚对照品，加乙酸乙脂制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以15∶5∶1的30～60℃石油醚-甲酸乙脂-甲酸配制混合溶剂，取其上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视及氨气熏后检视，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(4)羌活的鉴别

取胶囊剂中的内容物3g加10ml水溶解后，用乙酸乙酯或60～90℃石油醚提取4次，每次10ml，合并乙酸乙酯或60～90℃石油醚提取液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取羌活对照药材1g，加乙醇30ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5～8μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10∶2∶3的乙酸乙酯-甲醇-水配制混合溶剂，取其上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

B.对含有的成分进行含量测定的步骤

【含量测定】

1、大黄素与大黄酚总含量的测定

(1)仪器与试药

仪器：美国戴安高效液相色谱仪，CREATE科瑞Venus-C₁₈-5μ色谱柱P680泵UVD170紫外检测器CHROMELEON数据处理软件Startorius BP211D电子分析天平d＝0.01mg；

试剂：甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯；

对照品：大黄素对照品购自中国药品生物制品检定所，包装20mg，批号110756-200110；

(2)测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1％磷酸溶液(85∶15)为流动相；检测波长254nm。理论板数按大黄素、大黄酚峰计算均应不得低于4000。

对照品溶液的制备精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，加流动相制成每1ml含大黄素30μg、含大黄酚50μg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备取胶囊内容物3g，精密称定，加水10ml溶解后加盐酸1ml，氯仿30ml，加热回流30min，放冷，分取氯仿层，水层用氯仿强力振摇提取3次，每次30ml，合并氯仿液，水浴蒸干，残渣加流动相使溶解，定容至10ml量瓶中，摇匀，滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含大黄以大黄素(C₁₅H₁₀O₅)与大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)之和计，不得少于0.30mg。

2、绿原酸的含量测定：

(1)仪器与试药

仪器：美国戴安高效液相色谱仪，CREATE科瑞Venus-C18-5μ色谱柱P680泵UVD170紫外检测器CHROMELEON数据处理软件Startorius BP211D电子分析天平d＝0.01mg；

试剂：甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯；

对照品：绿原酸购自中国药品生物制品检定所，包装20mg，批号110753-200413；

(2)测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液(15∶85)；或乙腈-0.4％磷酸溶液(10∶90)或甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)或的甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(18∶85∶1∶0.3)为流动相；检测波长324nm。理论板数按绿原酸峰计算，应不得低于3000。

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的对照品溶液(10℃以下保存)。

供试品溶液的制备取本品0.3g，精密称定，置具塞三角瓶中，加50％甲醇50ml超声处理30分钟，不足减失重量，摇匀，滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)不得少于1.8mg。

照以上方法对十批样品进行了含量测定，结果如下表-20：

表-20复方大青叶胶囊含量测定结果表

其余同实施例1。

实施例4制备片剂

主药配比：大青叶380g，山银花190g，羌活95g，拳参95g，大黄95g。

以上诸味药材，加常规量水煎煮两次，每次1h；合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至60℃时相对密度1.08～1.32；加乙醇使含醇量达50～60％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至60℃时相对密度1.25～1.30的清膏，备用；

制备片剂

上步清膏80℃以下真空干燥或微波干燥，粉碎成细粉，按制药常规加适宜药用辅料，混匀并制成颗粒，压片，包糖衣或薄膜衣，上述配量可制得片剂1000片，按药品规格包装，密封，即得。

内容物的鉴别和含有成分的含量测定中：

A.内容物的鉴别步骤

(1)大青叶的鉴别

取片剂3.0g研碎，加10ml水溶解后，用乙酸乙酯或三氯甲烷提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯或三氯甲烷提取液，用1％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次10ml，乙酸乙酯或三氯甲烷液置水浴上蒸干，残渣加乙酸乙酯或三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加乙酸乙酯或三氯甲烷制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液；另取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液10～15μl，对照品溶液6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以5∶4∶1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮的混合液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；

(2)山银花的鉴别

取片剂3.0g研碎，加10ml水溶解后，加盐酸2～4滴，使溶液PH值为1～2，用乙酸乙酯或三氯甲烷提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯或三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加水10ml，分次溶解，用氨试液调PH值为7.0～7.5，加于聚酰胺柱，湿法装柱，柱长20cm，内径15～20mm，用氨试液调PH值为7.0～7.5的水溶液40ml洗脱，洗脱液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，必要时滤过，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液和对照品溶液各1～2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以20∶6∶0.8三氯甲烷-甲醇-甲酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

或片剂3.0g研碎，加10ml水溶解后，加于聚酰胺柱(30～60目，3g，内径0.9cm)上，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用50％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.5～1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(20∶6∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)大黄的鉴别

取片剂3.0g研碎，加10ml水溶解后，加盐酸1ml，置水浴中加热30min，冷却后用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，同法制成对照药材溶液；再取大黄素、大黄酚对照品，加乙酸乙脂制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以15∶5∶1的30～60℃石油醚-甲酸乙脂-甲酸配制混合溶剂，取其上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视及氨气熏后检视，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(4)羌活的鉴别

取片剂3.0g研碎，加10ml水溶解后，用乙酸乙酯或60～90℃石油醚提取4次，每次10ml，合并乙酸乙酯或60～90℃石油醚提取液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取羌活对照药材1g，加乙醇30ml，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；

照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法检验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5～8μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10∶2∶3的乙酸乙酯-甲醇-水配制混合溶剂，取其上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

B.对含有的成分进行含量测定的步骤

1、大黄素与大黄酚总含量的测定

(1)仪器与试药

仪器：美国戴安高效液相色谱仪，CREATE科瑞Venus-C₁₈-5μ色谱柱P680泵UVD170紫外检测器CHROMELEON数据处理软件Startorius BP211D电子分析天平d＝0.01mg；

试剂：甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯；

对照品：大黄素对照品购自中国药品生物制品检定所，包装20mg，批号110756-200110；

(2)测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1％磷酸溶液(85∶15)为流动相；检测波长254nm。理论板数按大黄素、大黄酚峰计算均应不得低于4000。

对照品溶液的制备精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，加流动相制成每1ml含大黄素30μg、含大黄酚50μg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备取片剂3.0g研碎，精密称定，加水10ml溶解后加盐酸1ml，氯仿30ml，加热回流30min，放冷，分取氯仿层，水层用氯仿强力振摇提取3次，每次30ml，合并氯仿液，水浴蒸干，残渣加流动相使溶解，定容至10ml量瓶中，摇匀，滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含大黄以大黄素(C₁₅H₁₀O₅)与大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)之和计，不得少于0.30mg。

2、绿原酸的含量测定：

(1)仪器与试药

仪器：美国戴安高效液相色谱仪，CREATE科瑞Venus-C18-5μ色谱柱P680泵UVD170紫外检测器CHROMELEON数据处理软件Startorius BP211D电子分析天平d＝0.01mg；

试剂：甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯；

对照品：绿原酸购自中国药品生物制品检定所，包装20mg，批号110753-200413；

(2)测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液(15∶85)；或乙腈-0.4％磷酸溶液(10∶90)或甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)或的甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(18∶85∶1∶0.3)为流动相；检测波长324nm。理论板数按绿原酸峰计算，应不得低于3000。

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的对照品溶液(10℃以下保存)。

供试品溶液的制备取片剂0.3g研碎，精密称定，置具塞三角瓶中，加50％甲醇50ml超声处理30分钟，不足减失重量，摇匀，滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)不得少于1.8mg。

照以上方法对十批样品进行了含量测定，结果如下表-21：

表-21复方大青叶片含量测定结果表

其余同实施例1。

实施例5制备丸剂

主药配比：大青叶420g，山银花210g，羌活105g，拳参105g，大黄105g。

以上诸味药材，加常规量水煎煮两次，每次1h；合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至60℃时相对密度1.08～1.32；加乙醇使含醇量达50～60％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至60℃时相对密度1.25～1.30的清膏，备用；

制备丸剂

上步清膏80℃以下真空干燥或微波干燥，粉碎成细粉，按制药常规加水或蜂蜜和水为黏合剂混匀并制成球形或类球形丸剂，80℃以下干燥；包糖衣或薄膜衣，上述配量可制得丸剂1000粒，按药品规格包装，密封，即得。

内容物的鉴别和含有成分的含量测定中：

A.内容物的鉴别步骤

(1)大青叶的鉴别中样品的取样量为5.0g，其余同实施例4。

(2)山银花的鉴别中样品的取样量为5.0g，其余同实施例4。

(3)大黄的鉴别中样品的取样量为5.0g，其余同实施例4。

(4)羌活的鉴别中样品的取样量为5.0g，其余同实施例4。

B.对含有的成分进行含量测定的步骤

1、大黄素与大黄酚的含量测定

(1)仪器与试药同实施例4。

(2)测定方法中，供试品的制备项下，样品的取样量为5.0g，其余同实施例4。

本品每1g含大黄以大黄素(C₁₅H₁₀O₅)与大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)之和计，不得少于0.15mg。

2、绿原酸的含量测定

(1)仪器与试药同实施例4。

(2)测定方法中，供试品的制备项下，样品的取样量为5.0g，其余同实施例4。

本品每1g含绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)不得少于0.9mg。

照以上方法对十批样品进行了含量测定，结果如下表-22：

表-22复方大青叶丸含量测定结果表

其余同实施例1

实施例6

主药配比是，大青叶420g，金银花190g，羌活105g，拳参105g，大黄105g。

制备口服液，其余同实施例1。

实施例7

主药配比是，大青叶380g，山银花210g，羌活95g，拳参95g，大黄95g。

制备片剂，其余同实施例4。

实施例8

主药配比是，大青叶400g，金银花210g，羌活105g，拳参95g，大黄105g。

制备颗粒，其余同实施例2。

实施例9

主药配比是，大青叶380g，山银花210g，羌活95g，拳参95g，大黄95g。

制备胶囊剂，其余同实施例3。

实施例10

主药配比是，大青叶400g，山银花210g，羌活105g，拳参95g，大黄105g。

制备丸剂，其余同实施例5。

实施例11

主药配比是，大青叶400g，山银花200g，羌活100g，拳参100g，大黄100g。

制备口服液，其余同实施例1。

实施例12

主药配比是，大青叶400g，山银花200g，羌活100g，拳参100g，大黄100g。

制备颗粒剂，其余同实施例2。

实施例13

主药配比是，大青叶400g，山银花200g，羌活100g，拳参100g，大黄100g。

制备胶囊剂，其余同实施例3。

实施例14

主药配比是，大青叶400g，山银花200g，羌活100g，拳参100g，大黄100g。

制备片剂，其余同实施例4。

实施例15

主药配比是，大青叶400g，山银花200g，羌活100g，拳参100g，大黄100g。

制备丸剂，其余同实施例5。