用于农药污染土壤修复的微生物固定化颗粒的制备方法

摘要

本发明涉及农药污染土壤的原位修复，具体的说是一种用于农药污染土壤修复的微生物固定化颗粒制备方法，即以多孔炭为主要载体材料，以纤维素、壳聚糖、海藻酸钠为辅助载体实现对微生物的固定，将得到的微生物固定化颗粒用于农药污染土壤的原位修复。本发明所用载体材料价格便宜，成本低，来源广泛，通气性良好，对生物无毒性，不会造成土壤的二次污染。该载体及其固定化工艺可用于假单胞菌属、芽孢杆菌属、动胶杆菌属、微球菌属等多菌种微生物的固定化，具有一定广谱适用性；芽孢杆菌可达到100亿个/克以上。与现有固定方法相比，本发明可将固定化细胞颗粒直接播撒到土壤中，不破坏原有土壤结构。

说明书

【技术领域】

本发明涉及农药污染土壤的原位修复，具体的说是一种用于农药污染土壤修复的微生物固定化颗粒制备方法，即以多孔炭为主要载体材料，实现对微生物的固定，将得到的微生物固定化颗粒用于农药污染土壤的原位修复。

【背景技术】

化学农药作为保障农业丰收的重要手段，在农业生产中发挥着非常重要的作用。然而，由于人们长期施用农药缺乏科学性，尤其是剧毒、高残留、难降解农药的大量使用导致环境中的农药的数量远远超过了环境的自净能力，即超过环境的容量。我们面临着不断增加的土壤、地下水和大气农药污染的环境问题，国家质检总局公布的最新数据显示，目前我国农药年产量已达40万吨，居世界第2位(全世界12亿磅，1997年)。我国每年农业防治约需农药25万吨，而农药的利用率只有10％～20％，其余则进入了农作物、土壤。2000年太湖流域农田土壤中15种多氯联苯同系物检出率为100％，六六六、DDT超标率为28％和24％，上海市郊区农田中的DDT含量严重超标，南京市菜地土壤中六六六和DDT的检出率为100％。据统计，我国被污染的土壤面积已达到1300万～1600万公顷，经济损失达10亿元之巨。

农药的微生物降解研究从最早的有机氯农药DDT开始已有几十年的历史。早在20世纪50年代，Cornell大学任教的Martin Alexander与他的学生就针对《寂静的春天》出版后人们对环境中农药污染和残毒问题的关注，展开了农药在土壤中可降解性的研究，为后来生物技术在环境保护中的应用打下了坚实的基础。生物修复(Bioremediation)是指利用微生物或其他生物将存在于土壤、地下水和海洋中的有毒、有害污染物降解为二氧化碳和水或转化为无害物质的系统，与物理化学方法相比，被公认为是一种有效、安全、廉价和无二次污染的方法。

世界各国的科研工作者分离筛选了大量的降解性微生物，国内的研究工作者也在这方面做了大量工作。目前已经分离得到一批能降解或转化某种农药的微生物有：细菌、真菌、放线菌、藻类等，大多数来自土壤微生物。

然而，微生物对环境污染物的修复能否最终实现不仅仅依赖于其降解能力本身，而且依赖于污染物的生物可利用性以及细菌与土著微生物之间的竞争能力等其他因素。

传统意义的微生物修复的特点是利用游离优势菌的降解作用，随着污染物逐渐趋向成分更复杂、易积累、难降解和毒性影响更长期，游离微生物修复技术的不足逐渐显现。如：单位体积内有效降解菌浓度低、反应启动慢、菌体易流失、与土著菌竞争处于弱势、抗毒性侵害能力差、对恶劣的环境条件变化敏感等。

固定化微生物技术是20世纪80年代兴起的一种新型生物技术，可以大幅度地提高参加反应的微生物浓度，增强微生物的耐环境冲击性，可根据需要选择适宜的微生物，可降低二次污染等。因而该技术被广泛用于修复受污染的流体介质(如废水)和半流体介质(如泥浆)环境中。但将固定化微生物技术应用于修复受有机物污染的非流体介质(如土壤)的研究，国内外尚未见报道。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种用于农药污染土壤修复的微生物固定化方法，即以多孔炭为主要载体材料，以纤维素、壳聚糖、海藻酸钠为辅助载体，通过吸附挂膜实现对降解菌的固定，将得到的微生物固定化颗粒用于农药污染土壤的原位修复。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种用于农药污染土壤修复的微生物固定化颗粒的制备方法，其步骤如下：

a.载体材料的破碎与筛分：先将载体材料粉碎成均匀颗粒，高温高压蒸汽灭菌，干燥备用；

b.细菌斜面培养：在基础培养基中接入菌种，在28-30℃温度下置于培养箱中斜面培养48小时；

c.细菌种子液制备：用接种环在所述基础培养基上接取菌种，接入到液体种子培养基，放入摇床在温度28-30℃条件下培养20-24小时，制得细菌种子液；

d.固定化颗粒制备：将培养了12-14小时的所述细菌种子液与所述载体材料颗粒按照重量5-20％的比例混合，在30℃温度下振荡培养24-48小时，然后加入交联剂，经12-18小时化学交联，然后将所述经过化学交联的载体材料颗粒转移至一次加固剂中，加固反应22-24小时，再将所述经过一次加固的载体材料颗粒转移到二次加固剂中，加固24小时，然后将所述载体材料颗粒用无菌水冲洗并浸泡24小时；

e.增殖培养：将所述浸泡过的载体材料颗粒取出接入增殖培养基中，放入摇床在温度28-30℃条件下培养24小时，然后更换增殖培养基两次，每次重复增殖培养步骤，最终得到微生物固定化颗粒成品。

上述方法中，所述载体材料优选方案采用多孔炭，一般用木炭或竹炭，粉碎成均匀颗粒，粒径0.80-1.60mm。

所述细菌种子液的菌体浓度为10⁵-10⁷个/ml。

所述交联剂为质量浓度2-4％羧甲基纤维素水溶液。

所述加固反应为二次，一次加固剂为质量浓度1-2％壳聚糖水溶液，二次加固剂为质量浓度2-3％海藻酸钠水溶液。

所述菌种为假单胞菌、芽孢杆菌、微球菌中的一种或多种细菌混合。。

所述基础培养基由下列组分构成牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，琼脂1.5-2.0％，蒸馏水96.2-96.7％，pH 7.0-7.2；

所述种子培养基由下列组分构成：葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH₄NO₃0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，KCl 0.02％，蒸馏水98.38％，pH 7.0-7.2；

所述增殖培养基由下列组分构成：：葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH₂PO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.025％，(NH₄)₂HPO₄ 0.2％，蒸馏水95.425％，pH 7.0-7.2。

微生物固定化颗粒的播种方式为：保持土壤水分条件在田间最大含水量或轻度淹水状态(以手握土指缝间滴水为适，水面高度2-5cm)，随施底肥按每平方米撒施0.3kg微生物固定化颗粒，并翻耕使之与土壤混匀。

本发明的原理是：农药污染土壤固定化生物修复技术的关键是筛选适宜的载体材料和确定优化的固定化工艺条件。微生物固定的载体材料应具有物理和化学稳定性好、无毒性或抑制性、物理性状(包括形态、孔隙率、相对密度等)优越、廉价易得等特性。目前，微生物固定化的常用载体有活性炭、多孔玻璃、石英砂、硅藻土、沸石等无机材料，以及琼脂、海藻酸钙(钠)、聚乙烯醇(PVA)凝胶、聚丙烯酰胺(ACAM)凝胶、硅胶等有机材料。微生物固定化过程及固定化微生物在污染土壤修复实际应用效果的好坏，与所利用的载体材料特性有密切的联系。同时，固定化载体的成本是固定化微生物技术经济可行的关键。木炭、竹炭等炭材作为一种多孔介质材料、孔隙率高、比表面积大、吸附性好、物理化学性能稳定，且价廉易得，具备微生物固定化载体材料应具有的性能特点，可用作微生物固定化载体。木炭、竹炭本身不具有毒性，可作为土壤改良剂使用。木炭主要组分是木质素和纤维素，具有多孔结构，为微生物提供优良的微环境有利的屏蔽了外界土著菌的干扰，使固定化微生物很好的发挥对农药降解作用，高分子量农药一般以共代谢的方式被降解，木炭组分中的木质素和纤维素还可为微生物提供初级共代谢底物，诱导微生物产生降解农药所必需的酶类，从而实现对高分子农药的共代谢降解。纤维素作为自然界中储量最大的天然高分子材料，具有价廉易得、易被微生物降解、不会给环境带来二次污染等特点。纤维素分子内含有许多亲水性的羟基基团，是一种纤维状、多毛细管的高分子聚合物，具有多孔和比表面积大的特性，因此具有亲和吸附性。

作为固定剂的壳聚糖是从虾蟹壳中制得的氨基多糖，具有良好的生物相容性、无毒性，其分子链上含有大量的伯氨基；海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种多糖，由β-1，4-D型甘露糖醛酸钠盐(M)和α-1，4-L型古罗糖醛酸钠盐(G)组成，分子链上含有大量的羧基。当其与木炭进行复合时，壳聚糖和海藻酸钠主要作用是可以通过静电作用在木炭表面形成聚电解质膜。

传统的固定化方法虽然具有自身的优势，但同时都存在难以克服的缺陷。比如吸附法制备容易，载体可再生，可供选用的载体种类繁多，但被吸附的微生物活性相对较低，微生物与载体的结合程度不够牢固，需较长时间完成初始化固定过程；包埋法的微生物细胞固化程度高，物化稳定性强，不易被分解，能抗有毒物质的侵害，但是微生物细胞与基质问的扩散阻力增大，准备工艺较复杂，可能会导致部分细胞活性丧失，并且不适于大分子污染物质的分解；交联固定化法可使微生物细胞高度密集，使稳定度得到提高，但是制备较困难，交联剂会使细胞活性降低，并且费用较昂贵。

为了克服各种固定化方法的缺陷与不足，获得具有高固定化强度和高微生物活性的固定化微生物系统，可以采用两法结合或是三法结合的改进方法。如先用吸附法将微生物结合到载体上，再利用交联法将微生物细胞交联起来形成“细胞网”结构，或先用吸附法处理微生物细胞后再用高分子聚合物进行包埋处理。这样可以克服吸附法强度低和交联法影响微生物活性的问题。复合固定化法就是在此思路上产生的，即在污染土壤治理的时候，将两种或多种固定化微生物方法结合起来使用从而获得单一固定化方法所无法达到的性能或处理效果，提高整个微生物系统的处理性能，同时克服单一固定化法的种种缺陷与不足。本发明固定化过程中不使用凝胶，细菌成活率高；使用的交联剂、加固剂乃天然有机物，无二次污染；制备的固定化颗粒微观结构均匀，扩散传质性能优异。

培养基就是细菌的食物，细菌培养是分三个阶段，基础培养基：是维持细菌基本生长存活的；种子培养基是做成细菌溶液制备微生物固定化颗粒用的；增殖培养基是菌液固定在载体上形成微生物固定化颗粒后，促进细菌生长的。

固定化微生物颗粒播入土壤后，遇干旱时，细菌继续休眠保存；遇灌溉和大雨时，颗粒可避免细菌淋失。干燥的固定细菌颗粒进入土壤后，吸附水分继续保持菌体，并逐渐向环境中释放细菌，起到缓释菌体的作用，保证持续的高菌数和延长细菌存活时间，在根际持续发展并形成局部优势类群。本发明可用于菌种的单株固定和多株菌的共固定；能够保证载体内部的菌体的数量和活性；固定化颗粒可持有很高的有效菌数。

本发明的优点在于：

1.本发明所用载体材料价格便宜，成本低，来源广泛，通气性良好，对生物无毒性，不会造成土壤的二次污染。

2.该载体及其固定化工艺可用于假单胞菌属、芽孢杆菌属、动胶杆菌属、微球菌属等多菌种微生物的固定化，具有一定的广谱适用性；芽孢杆菌可达到100亿个/克以上。

3.与其他固定方法相比，该微生物固定化颗粒制作简单，不需要单独的制粒步骤和专用装置；对于农药污染土壤而言，将固定化细胞颗粒直接投加到其中，在操作上是简单的，无需破坏原有土壤结构。

4.播种式微生物固定化颗粒的特点是：一、利用木炭、竹炭的疏松多孔结构、巨大比表面积，为微生物创造一个优良的生长环境。二、充分利用载体的吸附作用，对土壤中的农药污染物进行富集，然后附着在载体颗粒上的微生物对污染物进行分解。这种载体可通过负载不同的优势菌种，用于多种类型污染土壤的治理。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1为木炭颗粒断面×2,000环境扫描电子显微镜照片，

图2为木炭颗粒断面×4,000环境扫描电子显微镜照片，

图3为细菌固定化颗粒×1,500环境扫描电子显微镜照片，

图4为细菌固定化颗粒×6,000环境扫描电子显微镜照片，

图5为本发明的流程图。

【具体实施方式】

实施例1：

参见附图5，(1)炭块的破碎与筛分：

将大块木炭破碎，筛分出直径为0.80mm的小颗粒，比表面积1155m²/g，孔隙体积0.86cm³/g。再将木炭颗粒在蒸馏水中曝气5小时，去除其表面附着的炭粉和灰尘，干燥备用。图1、2是所述木炭颗粒的电子显微镜照片。

(2)细菌斜面培养：

在牛肉膏蛋白胨基础培养基(其组分重量比是0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，1.5-2.0％琼脂，pH 7.0-7.2)的试管中接入假单胞菌(Pseudomonas sp.)置于28-30℃培养箱中斜面培养48小时。

(3)细菌种子液制备：

用接种环在斜面培养基上接取2环菌苔，接入到液体种子培养基(其组分重量比是：葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH₄NO₃ 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，KCl 0.02％，pH 7.0-7.2)中，在摇床转速130-150r/min、28-30℃条件下，培养20-24小时，制得细菌种子液，菌体的浓度为10⁵-10⁷个/ml。

(4)交联剂配制：

按照总质量1000g，称取20g羧甲基纤维素，溶于蒸馏水中，pH值自然，制得交联剂。

(5)加固剂配制：

按照总质量1000g，称取10g壳聚糖，溶于蒸馏水中，pH值自然，制得一次加固剂。

按照总质量1000g，称取30g海藻酸钠，溶于蒸馏水中，pH值自然，制得二次加固剂。

(6)固定化颗粒制备：

按照重量20％的比例将培养12-14小时的种子液与颗粒炭混匀，30℃振荡培养24-48小时后加入交联剂，经12-18小时化学交联，然后将粒子转移至一次加固剂中，加固反应22-24小时，将粒子转移到二次加固剂中，再次加固24小时，最后用无菌水冲洗，浸泡24小时，制得固定化颗粒。图3、4是所述固定化颗粒的电子显微镜照片。

(7)增殖培养：

将固定化颗粒接入增殖培养基(其组分重量比是葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH₂PO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.025％，(NH₄)₂HPO₄ 0.2％，pH 7.0-7.2)中，在摇床转速130-150r/min、28-30℃条件下，培养24小时，然后更换增殖培养基2次，每次重复增殖培养步骤。

(8)微生物固定化颗粒播种方式：

土壤水分条件保持在田间最大含水量或轻度淹水状态(以手握土指缝间滴水为适，水面高度2-5cm)，随施底肥按每平方米撒施0.3kg微生物固定化颗粒，并翻耕使之与土壤混匀。

(9)污染土壤修复效果：

固定化颗粒投粒比10％，当土壤中阿特拉津初始浓度为50mg/kg时，修复42d，阿特拉津的去除率为56％。

实施例2：

与实施例1不同之处在于：

所述载体材料为竹炭颗粒，粒径1.60mm，比表面积860m²/g，孔隙体积0.77cm³/g。

所述菌种为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。

所述交联剂为质量浓度3％羧甲基纤维素水溶液。

所述一次加固剂为质量浓度1.5％壳聚糖水溶液，二次加固剂为质量浓度2.5％海藻酸钠水溶液。

固定化颗粒投粒比5％，当土壤中2，4-D初始浓度为40mg/kg时，修复35d，2，4-D的去除率为42％。

实施例3：

与实施例1不同之处在于：

所述载体材料为椰壳基颗粒炭，粒径0.80mm，比表面积1104m²/g，孔隙体积0.82cm³/g。

所述菌种为微球菌(Micrococcus sp.)。

所述交联剂为质量浓度4％羧甲基纤维素水溶液。

所述一次加固剂为质量浓度2％壳聚糖水溶液，二次加固剂为质量浓度2％海藻酸钠水溶液。

固定化颗粒投粒比2％，当土壤中苄嘧磺隆初始浓度为20mg/kg时，修复28d，苄嘧磺隆的去除率为62％。

实施例4：

与实施例1不同之处在于：

所述载体材料为果壳基颗粒炭，粒径1.60mm，比表面积在820m²/g，孔隙体积0.74cm³/g。

所述菌种为节杆菌(Arthrobacter sp.)。

所述交联剂为质量浓度2.5％羧甲基纤维素水溶液。

所述一次加固剂为质量浓度2％壳聚糖水溶液，二次加固剂为质量浓度3％海藻酸钠水溶液。

固定化颗粒投粒比5％，当土壤中异丙隆初始浓度为30mg/kg时，修复42d，异丙隆的去除率为76％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。