一种用于检测细胞嵌合状态或个体识别的基因检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于检测细胞嵌合状态或个体识别的基因检测试剂盒，具体涉及一种用于检测细胞嵌合状态或个体识别的寡核苷酸序列、试剂盒及方法。该试剂盒利用基因插入/缺失多态性(INDELs)和位点特异性荧光定量PCR来定量检测人类不同个体存在异体细胞的嵌合状态或微嵌合状态，可用于母子/女细胞微嵌合，造血干细胞或者其他器官移植后供者/受者细胞嵌合状态，白血病造血干细胞移植后残留病的检测，法医个体识别和亲子鉴定等。本发明的所述的试剂盒特异性好，检测灵敏度高，可精确定量检测，操作简便，不需要特殊的设备，采用本发明所述方法进行个体识别检测时，只需要琼脂糖电泳即可分辨结果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测细胞嵌合状态或个体识别的基因检测试剂盒和核苷酸序列及其使用方法，属于生物技术领域。

背景技术

利用不同生物个体各自的独特的基因信息来区分不同的个体或细胞的个体来源，可用于检测与自身免疫病有关的分娩后母子细胞长期存在的微嵌合状态，造血干细胞或者其他器官移植后供者/受者细胞嵌合状态，白血病造血干细胞移植后微小残留病等，在法医物证鉴定、亲子鉴定和其他医学检验方面有着广泛的应用。基因组是包含着一个人所有遗传信息的片段，与生具有，并且终身保持不变。这种遗传信息蕴含在人的骨骼、毛发、血液等所有人体组织或器官中。由于人类基因组中有着数量众多的多种类型的多态性位点，不同个体之间往往在很多位点上都有差异，并且进行基因检测只需微量的标本即可进行。利用基因多态性进行个体识别已经成为法医和临床检测广泛使用的方法。

近年来已开发出多种遗传标记用于个体识别。其中短串联重复序列(Short TandemRepeat简称STR)由于检测方法简便、快速、准确度高、扩增片段大小适中，目前已发展为各法医学实验室最常用的个体识别检测标记。但由于不同的微卫星多态性片段之间片段大小差异很少(常为3～5个碱基长度)，因此需要高分辨率的电泳方法(聚丙烯酰胺凝胶电泳或使用测序仪分析)才能进行检测。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳操作复杂，稳定性差，已逐渐趋于淘汰；而测序仪的成本昂贵，限制了此技术的广泛应用。

遗传学上嵌合体(Chimerism)的定义是同一个体体内不同遗传性状的细胞嵌合或混杂表现。这种一个机体同时有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在的状态称为嵌合状态。已经发现，分娩后母子细胞长期存在的微嵌合状态，与自身免疫病有关；造血干细胞或者其他器官移植后供者/受者细胞嵌合状态和预后有关，白血病造血干细胞移植后微小残留病嵌合状态等和治疗直接相关。对于疾病机理和治疗的研究、患者病情的检测都有重要意义。例如，在异体造血干细胞移植中，被植入的干细胞来源于与患者不属于同一个体的供者，这些干细胞植入患者体内后，虽然能够在患者体内生长自己，但其携带的基因遗传信息仍旧是属于供者的信息，因此便形成了嵌合现象。因此供受者细胞嵌合状态的监测是造血干细胞移植成功与否的重要指标，目前多采用STR方法来检测造血干细胞移植后的植入状态。

微嵌合现象(Microchimerism)是指某一个体的少量细胞转移到另一个体内的现象。一般称混合的细胞中一种个体来源的成分低于1％时为微嵌合，而所有来源的成分比例均大于1％时为嵌合状态。早在上世纪50年代就已经发现，母亲可能会将自己的细胞传输给胎儿，并且在胎儿出生后，母体来源的细胞还会长期在孩子体内存在甚至数十年之久。后来还发现，分娩后母亲的体内也可能会长期携带少量的来源于孩子的细胞。目前的研究已知这种母子嵌合的现象和一些自身免疫性疾病有关，但还有更多的机理有待研究者探索。近年来，随着器官移植的应用和研究的深入，研究者还发现在器官移植中也广泛存在微嵌合现象。如在心脏移植或肾脏移植的患者体内可以检测到少量来源于供者的细胞长期存在于患者的外周血中，这种微嵌合现象和移植物的排斥和耐受有关。

与个体识别不同的是，个体识别是用来检测两个标本是否分别来源于同一个个体，或者是否具有遗传学上的血缘关系；而嵌合状态分析的是在一份标本中，不同个体来源的细胞成分各占多少。因此，个体识别是根据不同标本的多态性位点信息进行比较分析，以对其遗传学上是否属于同一个体或是否具有血缘关系进行评估；而嵌合率的分析是根据已知的分别属于两个或多个不同个体的多态性信息为线索，来定量分析混合标本中两个或多个不同个体细胞所占的比例。

因此嵌合状态的检测要求可以定量分析，尤其是微嵌合状态的检测要求更高灵敏度的检测方法。而目前常规应用的STR方法进行嵌合状态检测时，由于检测方法和仪器的限制，检测灵敏度只能达到1％，因此不能进行微嵌合的分析。目前进行微嵌合研究时，多采用在女性标本内检测Y染色体特异性基因的方法。此方法具有特异性好，检测灵敏度高的特点。但由于Y染色体只存在于男性细胞，因此该方法只能用来检测女性标本内男性来源的细胞，通用性差，造成多数标本无法进行检测和分析。另一种较常用的方法是根据HLA位点的多态性，根据两个个体HLA位点多态性的差别，结合巢式位点特异性PCR方法来增加检测灵敏度。但由于HLA位点多态性很强，往往需要对每一对标本都要特别设计实验方案，而且不能进行定量分析。

随着基因组研究的进展，新一代的多态性位点相继被发现和应用。也有研究者采用单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)位点来设定个体识别的检测方案。但由于单核苷酸多态性的等位基因间差异只有一个碱基，因此难以设定高灵敏度的检测方案，检测灵敏度往往只能达到1％，仍然不能用于微嵌合的检测。而且SNP定量方法复杂，实用性差。

INDELs(insertions and deletions，即插入和缺失)多态性是近年来发现的新一代的多态性位点，是指基因组中插入或缺失了不同类型和大小的小片段DNA。相对于STR多态性，由于STR位点为不同数目的重复序列，因此无法通过设定位点特异性PCR引物的方法来提高检测灵敏度；而INDELs多态性是缺失或插入的变异，而且缺失或插入的片段可以是几个至几百个碱基不等，因此可以通过设计位点特异性PCR引物的方法来对插入/缺失的等位基因型进行区分。相对于SNP多态性，由于SNP是单碱基的替换突变，不同等位基因间序列差异较小，因此根据SNP位点设计的位点特异性引物只有3’末端一个碱基是特异性的，难以提高检测灵敏度；但INDELs多态性的缺失或插入的等位基因型之间的差异可以是几个甚至几百个碱基，因此不同位点的特异性引物之间可以有很大的差异，因此可以大大提高引物的特异性和检测灵敏度。此外，确定一些个体的基因INDELs多态性特征在法医物证鉴定、亲子鉴定和其他医学检验方面有着广泛的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组用以检测人体内异体细胞嵌合状态、微嵌合状态或对不同个体进行基因识别的寡核苷酸。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的用于检测细胞嵌合状态或个体识别的基因检测试剂盒。该试剂盒可用于母子细胞微嵌合，造血干细胞或者其他器官移植后供者/受者细胞嵌合状态，白血病造血干细胞移植后残留病的检测，法医个体识别和亲子鉴定等。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一组用于检测细胞嵌合状态或个体识别的寡核苷酸，为序列表SEQ IDNo.1至序列表SEQ ID No.32所示碱基序列的寡核苷酸；

其中，SEQ ID No.1为检测插入多态性的rs2308010多态性位点特异性引物，SEQID No.2为检测缺失多态性的rs2308010多态性位点特异性引物，SEQ ID No.3为rs2308010多态性位点的上游引物、SEQ ID No.4为rs2308010多态性位点的下游引物；

SEQ ID No.5为检测插入多态性的rs4150017多态性位点特异性引物，SEQ IDNo.6为检测缺失多态性的rs4150017多态性位点特异性引物，SEQ ID No.7为rs4150017多态性位点的上游引物、SEQ ID No.8为rs4150017多态性位点的下游引物；

SEQ ID No.9为检测插入多态性的rs2307553多态性位点特异性引物，SEQ IDNo.10为检测缺失多态性的rs2307553多态性位点特异性引物，SEQ ID No.11为rs2307553多态性位点的上游引物、SEQ ID No.12为rs2307553多态性位点的下游引物；

SEQ ID No.13为检测插入多态性的rs2308144多态性位点特异性引物，SEQ IDNo.14为检测缺失多态性的rs2308144多态性位点特异性引物，SEQ ID No.15为rs2308144多态性位点的上游引物、SEQ ID No.16为rs2308144多态性位点的下游引物；

SEQ ID No.17为检测插入多态性的rs4646006多态性位点特异性引物，SEQ IDNo.18为检测缺失多态性的rs4646006多态性位点特异性引物，SEQ ID No.19为rs4646006多态性位点的上游引物、SEQ ID No.20为rs4646006多态性位点的下游引物；

SEQ ID No.21为检测插入多态性的rs34132048多态性位点特异性引物，SEQ IDNo.22为检测缺失多态性的rs34132048多态性位点特异性引物，SEQ ID No.23为rs34132048多态性位点的上游引物、SEQ ID No.24为rs34132048多态性位点的下游引物；

SEQ ID No.25为检测插入多态性的rs1610932多态性位点特异性引物，SEQ IDNo.26为检测缺失多态性的rs1610932多态性位点特异性引物，SEQ ID No.27为rs1610932多态性位点的上游引物、SEQ ID No.28为rs1610932多态性位点的下游引物；

SEQ ID No.29为检测插入多态性的rs56024302多态性位点特异性引物，SEQ IDNo.30为检测缺失多态性的rs56024302多态性位点特异性引物，SEQ ID No.31为rs56024302多态性位点的上游引物、SEQ ID No.32为rs56024302多态性位点的下游引物。

各种引物的序列详见表1，其中扩增片段长度为该引物和下游引物(R)配对所得的扩增片段长度。

表1.引物序列

本发明还提供一种用于检测细胞嵌合状态或个体识别的基因检测试剂盒，10tests/盒，保存于-20℃，由以下试剂组成：

1)基因组DNA提取试剂(20人次)，购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，货号：AP-MN-BLGDNA-50；

2)超纯水(MilliporeMILLI-Q PF PLUS纯水机制备，电阻率＞18.2MΩ)5ml；

3)2×PCR反应液2ml，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：KT201；

4)2×SYBRGreen PCR反应液2ml，购自美国应用生物系统有限公司，货号：4367659；

5)检测所使用的各种引物各50ul(各种引物如表1所示，其序列由美国IntegratedDNA Technologies公司合成，用1×TE稀释为2pmol/ul浓度)，分别分装在相应编号的0.2ml离心管中；

6)基因组DNA对照品1(50ng浓度，50ul)；

7)基因组DNA对照品2(50ng浓度，50ul)；

其中所述基因组DNA对照品1和对照品2的rs2308010、rs4150017、rs2307553、rs2308144、rs4646006、rs34132048、rs1610932和rs56024302位点多态性进行了基因测序。本发明提供的基因组DNA对照品1和对照品2的位点多态性信息见表2(其中“+”代表插入多态性，“-”代表缺失多态性)。

表2.试剂盒对照品的8个INDELs位点的多态性信息

本发明的优点是：

1、本发明仅采用普通PCR仪和琼脂糖电泳方法即可进行INDELs位点的多态性定性分析，并根据各INDELs位点的多态性进行个体识别或亲缘关系分析。相对于目前广泛采用的STR方法，本发明不需要测序仪等昂贵的仪器，易于推广和使用。

2、进行嵌合或微嵌合状态分析时，相对于采用Y染色体特异性序列的检测方法，本方法不具有性别限制性。任何性别的标本均可进行分析，使分析不再受标本性别的限制，具有更好的通用性。

3、进行嵌合或微嵌合状态分析时，相对于采用HLA位点特异性引物的方法，本方法通用性更好，而且可以进行精确的定量分析。

4、进行嵌合或微嵌合状态定量分析时，由于本方法结合了INDELs多态性的特点和巢式PCR技术。在增大初始模板量的同时又保证了定量检测结果的准确性。采用Y染色体特异性序列检测微嵌合时，由于初始DNA模板量的限制，检测灵敏度只能达到约10^-4。但采用本方法时，由于初始模板量的增加，检测灵敏度可提高到10^-5，进一步提高了检测灵敏度。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为本发明的引物设计示意图，其中□为基因序列，为插入多态性序列，F为上游引物，R为下游引物，+为插入型位点特异性引物，-为缺失型位点特异性引物；

图2为本试剂盒用于个体识别检测电泳结果图，“+”和“-”分别表示该反应检测的为插入型和缺失型多态性，电泳图示标本A和标本B的8个INDELs位点中，有6个位点(rs4150017、rs2307553、rs2308144、rs4646006 rs34132048、rs56024302)的多态性有差异；

图3为本发明用于检测嵌合状态的电泳结果图，电泳图示标本处于嵌合状态时的检测结果和INDELs多态性位点的分类情况；

图4为检测检测母女微嵌合状态时各位点多态性检测电泳结果图，电泳图示标本E和标本F中INDELs多态性位点的分类情况；

图5为本发明的标准品扩增所得扩增曲线和标准曲线图；R：内参引物扩增曲线；A：50％标准品特异性引物扩增曲线；B：5％标准品特异性引物扩增曲线；C：0.5％标准品特异性引物扩增曲线；D：0.05％标准品特异性引物扩增曲线；

图6为本发明的标本检测扩增曲线和解离曲线图。

具体实施方式

实施例1：引物的设计与合成

选择在中国汉族人群中具有较强多态性的候选INDELs位点：根据美国国立生物信息中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站SNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝snp)中的INDELs多态性信息进行选择，初选在数据库资料中这个人群多态性较强的INDELs位点。

引物设计如图1，图示了本发明的引物设计方法和原理：根据选取的每个INDELs位点序列设计并制备相应的引物序列：对于每一个INDELs位点，分别设计一条共用的上游引物(F)、一条共用的下游引物(R)、检测插入多态性(Insersion，I)的位点特异性引物(+)和检测缺失多态性(Deletsion，D)的位点特异性引物(-)。每条位点特异性引物的3’末端分别各有4-6个碱基特异性对应各INDELs位点的或缺失多态性的基因序列，以达到较强的位点特异性效果。

标本选择和实验：随机选取100个汉族健康成人(男50个，女50个)基因组DNA标本进行扩增和基因测序分析。根据实际检测的各位点的多态性情况最终确定采用的INDELs位点。用上述设计的引物对100份健康成人基因组DNA标本进行检测，以评估引物扩增效率和各位点的多态性情况。

基因组DNA的提取爱思进生物技术(杭州)有限公司的产品说明进行，提取得到的基因组DNA用1×TE溶液稀释到5ng/ul备用。PCR反应体系为20ul，每个反应体系中含基因组DNA 10ng，每个INDELs位点对应的编号为“F、R、+”或“F、R、-”的引物各4pmol(分别用以检测插入多态性和缺失多态性)，2×PCR反应液10ul，用超纯水补足反应体系。PCR反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性15秒-58℃退火30秒-72℃延伸45秒共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR产物经2％琼脂糖电泳30分钟检测，根据出现的条带大小判断各位点的多态性情况。

根据实验结果，最终选取了8个在汉族人群中具有较强多态性的INDELs位点，在SNP数据库中的编号分别为：rs2308010、rs4150017、rs2307553、rs2308144、rs4646006、rs34132048、rs1610932、rs56024302。所用引物序列见表1，在100例标本中检测到的8个位点的多态性信息见表3，其中“+/+”代表纯合插入多态性；“+/-”代表插入/缺失杂合多态性；“-/-”代表纯合缺失多态性。

以上所用引物均由美国Integrated DNA Technologies公司合成。

表3.100例标本中本试剂盒所选8个INDELs位点的多态性检测结果

实施例2 本发明所述试剂盒的组成

本发明所述用于检测细胞嵌合状态或个体识别的基因检测试剂盒，10tests/盒，保存于-20℃，由以下试剂组成：

1)基因组DNA提取试剂(20人次)，购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，货号：AP-MN-BLGDNA-50；

2)超纯水(MilliporeMILLI-Q PF PLUS纯水机制备，电阻率＞18.2MΩ)5ml；

3)2×PCR反应液2ml，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：KT201；

4)2×SYBRGreen PCR反应液2ml，购自美国应用生物系统有限公司，货号：4367659；

5)检测所使用的各种引物各50ul(各种引物如表1所示，其序列由美国IntegratedDNA Technologies公司合成，用1×TE稀释为2pmol/ul浓度)，分别分装在相应编号的0.2ml离心管中；

6)基因组DNA对照品1(50ng浓度，50ul)；

7)基因组DNA对照品2(50ng浓度，50ul)；

基因组DNA对照品1和对照品2的制备：

采取两名健康供者外周血标本各10ml，用上述爱思进公司基因组DNA提取试剂提取全血基因组DNA后，用1×TE缓冲液稀释为50ng/ul并分装后即为对照品。

其中基因组DNA对照品1和对照品2做为质控品提供，标本来源于两位健康供者。对照品1和对照品2联合使用，提供了8个INDELs位点的各种插入型和缺失型的基因型的DNA标本。基因组DNA对照品1和对照品2的位点多态性经基因测序证实，具体多态性信息见表2(其中“+”代表插入多态性，“-”代表缺失多态性)。

实施例3：本试剂盒用于个体识别的检测

随机选取两个不同个体的基因组DNA标本(分别命名为A和B)，分别进行本试剂盒中8个INDELs位点的多态性检测。

PCR反应体系为20ul，每个反应体系中含基因组DNA 10ng，每个INDELs位点对应的编号为“F、R、+”或“F、R、-”的引物各4pmol(分别用以检测插入多态性和缺失多态性)，2×PCR反应液10ul，用超纯水补足反应体系。PCR反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性15秒-58℃退火30秒-72℃延伸45秒共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR产物经2％琼脂糖电泳30分钟检测，根据出现的条带大小判断各位点的多态性情况。

电泳结果见图2，“+”和“-”分别表示该反应检测的为插入型和缺失型多态性。根据电泳结果可判断，标本A和标本B的8个INDELs位点中，有6个位点(rs4150017、rs2307553、rs2308144、rs4646006  rs34132048、rs56024302)的多态性有差异，因此可判断标本A和标本B来源于不同的个体。

实施例4：本试剂盒用于骨髓移植后嵌合状态的检测

选取一例进行骨髓移植的白血病患者的移植前外周血、供者外周血、供者外周血和移植后外周血标本(分别标记为C、D和CD)进行检测。移植后外周血标本经用经典的STR方法检测结果为患者来源细胞占13.12％，为供者和患者混合嵌合状态。STR方法采用ABI Identifilier试剂盒和ABI 310测序仪进行检测。

与STR方法相同的是，采用本试剂盒进行嵌合状态检测时，同样需要对患者移植前标本和供者标本进行检测，以获得供者和患者各自的INDELs位点多态性信息。但本试剂盒只需要琼脂糖电泳检测和普通凝胶成像仪即可对嵌合状态进行分析。

具体实施方法为：

1、分别对C、D和CD标本进行8个INDELs位点的检测：PCR反应体系为20ul，每个反应体系中含基因组DNA 10ng，每个INDELs位点对应的编号为“F、R、+”或“F、R、-”的引物各4pmol(分别用以检测插入多态性和缺失多态性)，2×PCR反应液10ul，用超纯水补足反应体系。PCR反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性15秒-58℃退火30秒-72℃延伸45秒共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR产物经2％琼脂糖电泳30分钟检测，根据出现的条带大小判断各位点的多态性情况。本例的电泳结果见图3。

2、多态性位点的分类：根据各位点多态性的情况，可将8个INDELs位点分为4类：1、供者和患者多态性完全相同的为0类位点(如本例中rs4150017和rs34132048位点)，为非信息位点，此类位点不能用来进行嵌合状态分析；2、患者(C)为插入纯合性、供者(D)为缺失纯合性，或患者(C)为缺失纯合性、供者(D)为插入纯合性的位点(如本例中rs56024302位点)为I类位点，此类位点可以进行各种嵌合状态的分析。3、患者(C)为插入/缺失杂合性、供者(D)为插入或缺失纯合性的位点为IIa类位点(如本例中的rs2308010、rs2308144、rs4646006位点)，此类位点适合进行患者细胞量相对较少的嵌合状态分析，在进行供者细胞相对较少的嵌合状态分析时会有较大的误差。3、供者(D)为插入/缺失杂合性、患者(C)为插入或缺失纯合性的位点为IIb类位点(如本例中的rs2307553、rs1610932位点)，此类位点适合进行供者细胞量相对较少的嵌合状态分析，在进行患者细胞相对较少的嵌合状态分析时会有较大的误差。

3、嵌合比例的计算：

嵌合率的计算首先要用凝胶成像仪对嵌合标本(本例中为标本CD)中I类和II类位点的插入和缺失型PCR电泳片段进行灰度分析。本例中所用的凝胶成像仪为Tanon GIS-2010凝胶成像仪，所用灰度分析软件为天能GIS凝胶图像处理系统V4.0。

a)0类位点不参与嵌合状态的分析，不进行计算。

b)I类位点的嵌合率计算公式为：

患者标本嵌合率＝患者特异性条带灰度值/(插入/缺失条带的总灰度值)

供者标本嵌合率＝供者特异性条带灰度值/(插入/缺失条带的总灰度值)

c)IIa类位点主要用于患者成份嵌合率计算，计算公式为：

患者标本嵌合率＝患者特异性条带灰度值/(插入/缺失条带的总灰度值)

d)IIb类位点主要用于供者成份嵌合率计算，计算公式为：

供者标本嵌合率＝供者特异性条带灰度值/(插入/缺失条带的总灰度值)

本例标本中rs56024302位点为I类位点，嵌合率计算结果为患者细胞所占比例为11.80％；rs2308010、rs2308144、rs4646006为IIa类位点，计算患者细胞所占比例为13.51％、12.12％和10.17％。患者细胞嵌合比例平均值为12.05％，与用STR方法检测的结果相近。

实施例5：本试剂盒用于微嵌合状态的检测

本试剂盒用于微嵌合状态的检测(如母子微嵌合)时，同样需要先对来自不同个体的两份标本进行检测，以获得供者和患者各自的INDELs位点多态性信息，再选出可用的信息位点进行进一步的微嵌合检测。由于微嵌合状态时，微嵌合的细胞比例一般很低(＜1％)，由于扩增产物量很低和检测方法的限制，琼脂糖电泳检测时往往检测不到微嵌合的扩增产物，因此需要结合荧光定量PCR进行检测。为达到10^-5的检测灵敏度，需要至少500ng的初始基因组DNA模板进行检测。但当模板总量过多时，会影响PCR的扩增效率和低拷贝模板的检测，因此对嵌合或微嵌合状态进行定量分析时需要进行预扩增，即巢式PCR的第一轮扩增。预扩增时分别采用各INDELs位点的上游引物(F)、下游引物(R)组合进行扩增。在进行荧光定量PCR检测时，还要构建标准曲线，以进行精确的定量分析。

我们采用本试剂盒对41对母子/女进行母亲为供者的骨髓移植的母亲标本进行了微嵌合状态的检测。结果在其中10例(24％)母亲外周血中检测到子/女细胞的微嵌合，微嵌合细胞的比例在10^-5～10^-3之间。在此举其中一例进行应用方法的说明(母亲标本命名为E，女儿标本命名为F)。

具体实施方法为：

1、标本E和标本F中各INDELs位点的多态性检测和多态性位点的分类方法同实施例3。两份标本的位点多态性电泳图见图4，由于两者为母女血缘关系，因此不存在I类位点。根据II类位点中的rs2308010、rs4150017、rs2308144和rs4646006位点可以进行女儿(F)体内母亲(E)细胞的微嵌合状态分析。

2、巢式PCR的第一轮扩增：PCR反应体系为20ul，每个反应体系中含基因组DNA 660ng(约相当于10⁵个细胞的基因组DNA)，每个INDELs位点对应的编号为“F、R”的引物各4pmol，2×PCR反应液10ul，用超纯水补足反应体系。PCR反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性15秒-58℃退火30秒-72℃延伸45秒共进行20个循环，最后72℃延伸7分钟。

3、标准品的构建：选取已知具有相关多态性的其它人的基因组DNA标本，将不同的纯合插入、纯合缺失或杂合性的多态性标本以不同比例混合(如缺失多态性：插入多态性比例分别为50％、5％、0.5％、0.05％)，得到不同比例的标准品。

4、巢式第二轮PCR反应，即微嵌合状态的定量分析：将制备的嵌合比例分别为50％、5％、0.5％、0.05％的标准品或巢式第一轮PCR扩增所得到的产物稀释500倍作为定量分析的模板，同时以超纯水为模板做空白对照。对于各个可进行定量分析的INDELs位点(本例中为rs2308010、rs4150017、rs2308144和rs4646006位点)，根据相应情况分别采用检测插入多态性的位点特异性引物(+)或检测缺失多态性的位点特异性引物(-)与下游引物(R)组合进行PCR第二轮的巢式PCR扩增，同时采用上游引物(F)和下游引物(R)组合进行内参基因的扩增。此步骤的PCR扩增在荧光定量PCR仪上进行，并且采用SYBRGreen染料法进行扩增产物的实时检测。本例荧光定量PCR检测在AB 7300型荧光定量PCR仪上进行，PCR反应体系为20ul，其中包括稀释后的第一轮PCR产物2ul、SYBRGreen PCR反应液10ul、每条引物各4pmol。反应条件为50℃ 2分钟使UNG酶起作用、95℃ 10分钟预变性并激活热启动酶，然后95℃变性15秒、60℃ 1分钟共进行40个循环，PCR循环后做解离曲线分析以判断PCR产物的特异性。

5、标准曲线分析：根据不同浓度的标准品检测所得的目的基因和内参基因的CT值的差值(目的基因CT-内参基因CT值，即ΔCT值)做标准曲线。图5所示为本例中rs2308010位点的标准品扩增及标准曲线图，图中显示标准品扩增曲线形态良好，标准曲线R²＝0.9915，线性相关性良好。

6、微嵌合状态的定量分析：根据每个多态性位点插入或缺失型位点特异性引物和内参引物扩增所得的解离曲线分析产物的特异性，并计算两者所得CT值的差值(ΔCT)。根据不同浓度的标准品检测所得的ΔCT值做标准曲线，然后根据所得的标准曲线和待检标本的ΔCT值可计算标本中嵌合或微嵌合状态的比例。图6所示为本例中rs2308010位点的检测结果，图中显示所测标本中内参基因和特异性位点(插入多态性位点)基因控制曲线形态良好，解离曲线显示PCR产物特异，空白对照无扩增。由于本例中女儿rs2308010位点的基因型为缺失纯合性，而母亲此位点的基因型为插入/缺失杂合型，因此在女儿基因组DNA中检测到的插入型基因片段来源于微嵌合的母源性细胞。本例中rs2308010位点的插入型基因微嵌合率根据标本中检测到的ΔCT值和标准曲线计算为0.036％，由于母亲体内此位点的基因型为插入/缺失杂合型，因此母体细胞的微嵌合率应为0.036％×2＝0.072％。本例中对另三个位点(rs4150017、rs2308144和rs4646006)同样进行了定量分析，检测结果分别为0.056％、0.078％、0.067％，四个多态性位点细胞微嵌合的平均值为0.068％。因此在女儿标本中存在母体来源的细胞的微嵌合状态，母源性细胞嵌合比例约为0.068％。

序列表

<110>北京市道培医院

<120>一种用于检测细胞嵌合状态或个体识别的基因检测试剂盒

<130>

<160>32

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成引物rs2308010  +

<400>1

ctgactagca acaagcgtgg aattagtcag    30

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<212>DNA

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agtcctgcaa caagcgtgga attaggact     29

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<212>DNA

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gaacttatgc aatattactg ccatcaagtt c    31

<210>4

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<212>DNA

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<212>DNA

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agacaggtac ggtgtgatgc cactgtct        28

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atcaaggtac ggtgtgatgc cacttgat        28

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<212>DNA

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acaaggagtg caacagaacg agaccttgt    29

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gtcttgtcct ttcaacggtt tccaagac     28

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<212>DNA

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ctctgtgcaa agtgggcatt tgacagag       28

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<212>DNA

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gaaagtgaca tgtgtattag acctgccact ttc 33

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<212>DNA

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gctcacatga gtgcacagcc atgagc         26

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<212>DNA

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cttcattgtc ctcgcctcca tgaag         25

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cttcagcacc ttgtcctcgc ctgaag        26

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<212>DNA

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<212>DNA

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ctgattgcgt caccatttgt gaatcag       27

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<212>DNA

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tgagtgctgg taaatggcac acactca    27

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<212>DNA

<213>人工合成引物rs4646006  -

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tgcacctggt aaatggcaca cagtgca     27

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<212>DNA

<213>人工合成引物rs4646006  F

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ctaagtggca gcattttcag cacttag      27

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<212>DNA

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agctgacgag tctccagatc tatgatcagc t    31

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<212>DNA

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tgttaggtgc ccagtgagca gaactaaca       29

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<212>DNA

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gactgtgccc agtgagcaga acagtc          26

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ttggtcggag acagtaggta gatgttgacc aa    32

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cagagacgtg gttgtcaaat gaaggtctct g     31

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<212>DNA

<213>人工合成引物rs1610932  +

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agaacccttt gcaactcacc aggttct          27

<210>26

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<212>DNA

<213>人工合成引物rs1610932  -

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gcatctttgc aactcacctg gatgc            25

<210>27

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<212>DNA

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ctgtctgtat cacagctgaa taagcagaca g    31

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<213>人工合成引物rs1610932  R

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caacatccag ggagagcatg gtgttg          26

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gatagatcca ttcacccatc catctatc        28

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actttgccat tcacccatcc atcaaagt        28

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cagctagtcc attcctgtac cagagtagct g    31

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<213>人工合成引物rs56024302  R

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ctcattagga gtttggagct gcaatgag        28